miR-301標的化によるPTEN活性化で食道扁平上皮癌の血管新生と腫瘍増殖を抑制

概要

目的

食道扁平上皮癌（ESCC）は早期転移と遅い診断が特徴です。マイクロRNA-301（miR-301）は多様な癌に関与することが知られています。しかし、ESCCにおけるmiR-301の影響は未解明です。したがって、本研究ではESCC進行におけるmiR-301の役割を探索することを目的としました。

方法

ESCC組織と細胞株におけるmiR-301とホスファターゼ・テンシン相同体（PTEN）の発現を評価。次に、スクリーニングされた細胞を変異miR-301またはPTENオリゴヌクレオチドとプラスミドで処理し、ESCC細胞のコロニー形成能、細胞生存率、移動、侵襲、細胞周期分布、アポトーシスを評価。さらに、腫瘍増殖と微小血管密度（MVD）も評価し、miR-301とPTENの標的関係を確認しました。

結果

ESCC組織と細胞でmiR-301が上昇、PTENが低下していました。機能アッセイにはKYSE30細胞とEca109細胞を選択。KYSE30細胞では、miR-301阻害またはPTEN過剰発現が細胞悪性振る舞いを抑制し、PTEN沈黙がmiR-301阻害のESCC進行への影響を消失させました。Eca109細胞では、miR-301過剰発現またはPTEN阻害が細胞悪性振る舞いを促進し、PTEN過剰発現がmiR-301上昇の効果を逆転させました。in vivoアッセイでは、miR-301阻害またはPTEN過剰発現がESCC腫瘍増殖とMVDを抑制し、miR-301上昇またはPTEN減少は逆の効果を示しました。さらに、PTENはmiR-301によって標的とされることが確認されました。

結論

総合すると、本研究の結果はmiR-301がPTEN発現を制御することでESCCにおける細胞増殖、転移、血管新生に影響を与えることを明らかにしました。

はじめに

食道癌（EC）は世界で8番目に多い癌であり、高い死亡率と不良な予後を示す重大な悪性腫瘍です。全EC症例の約90%を占める食道扁平上皮癌（ESCC）は、中国におけるECの主要な形態です。低社会経済的地位、喫煙、飲酒、栄養摂取不良、ニトロソアミン豊富またはマイコトキシン汚染食品など複数の原因がESCC発生に関与します。臨床転帰と治療の向上にもかかわらず、ESCC患者の予後は依然として不良で、5年生存率は15-25%です。したがって、ESCC発生においてバイオマーカーとして機能し得るオンコジーンや腫瘍抑制遺伝子を同定し、ESCC患者により効果的な治療法を提供することが極めて重要です。

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現調節に不可欠な役割を果たす小さな非コードRNAであり、mRNAの安定性と翻訳能力を調節することで腫瘍進行に影響を与えることが明らかにされています。miR-4324、miR-889-3p、miR-9など多数のmiRNAがESCCプロセスに関連することが見つかっています。miR-301はヒトゲノム上の17q22-23に位置するfam33a転写単位から形成されるmiRNAファミリーの一員です。miR-301の過剰発現は以前に同定されており、ヒト疾患への関与が反映されています。しかし、ESCCにおけるmiR-301の機能メカニズムは未解明です。また、ホスファターゼ・テンシン相同体（PTEN）は癌で頻繁に破壊され、癌患者の生殖細胞系列変異で標的とされることが確認されており、腫瘍抑制役割を果たします。PTENの不調和がESCC発生と相関することが検証されています。興味深いことに、最近の研究でmiR-301が非小細胞肺癌でPTENを標的とすることが明らかになりました。しかし、ESCC発生におけるmiR-301とPTENの標的関係は未解明のままです。本研究は、ESCC進行におけるmiR-301とPTENの影響に焦点を当てており、これらはほぼ未知で新規性があります。我々はmiR-301がPTEN発現を調節することでESCCの血管新生と細胞増殖に影響を与えると推測しました。

材料と方法

倫理声明

全患者から研究前に文書によるインフォームドコンセントを取得。本研究プロトコルはヘルシンキ宣言の医学研究倫理原則に基づき、吉林大学第二病院倫理委員会の承認を受けました。動物実験は米国国立衛生研究所発行の実験動物管理・使用ガイドラインに厳密に準拠。動物実験プロトコルは吉林大学第二病院実験動物管理・使用委員会の承認を受けました。

研究対象

2015年1月から2017年12月に吉林大学第二病院胸部外科で食道切除術を受けたESCC患者（男性78例、女性32例）から、ESCC組織110例と隣接正常組織（腫瘍から>5 cm）110例を採取。110例中、>60歳84例、≤60歳26例；腫瘍サイズ：≥5 cm 65例、<5 cm 45例；リンパ節転移（LNM）なし71例、あり39例；TNMステージ：I+II期60例、III期50例；腫瘍位置：上部ESCC 13例、中下部ESCC 97例。全患者はESCCと診断され、術前放射線化学療法を受けていません。腫瘍は完全切除され、病理学的に陰性切除縁が確認されました。2009年国際対癌連合（UICC）提唱のESCCステージング基準に従い、術後病理ステージはpT1-4N1-2（I-IIIb）期と同定。術後有意な合併症はなく、周術期死亡例は除外しました。

逆転写定量PCR（RT-qPCR）

組織と細胞の総RNAをTrizolキット（Invitrogen Inc.、Carlsbad、CA、USA）で抽出。RNA濃度と品質を測定。RNAプライマー（表1）をタカラバイオテクノロジー（遼寧、中国）で設計・合成。Takara PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（タカラ）の指示に従いRNAをcDNAに逆転写。Light Cycler 480II（Roche）でPower PCR SYBR green PCR master mix（タカラ）を用いてqPCR実施。U6をmiR-301のローディングコントロール、β-actinをPTENの内部基準として使用。データは2^−ΔΔCt法で解析。

ウェスタンブロット解析

RIPA溶解バッファー（Beyotime Institute of Biotechnology、上海、中国）で細胞と組織の総タンパク質を抽出し、BCAタンパク質定量キット（Beyotime）で定量。各試料のタンパク質濃度を測定し、10% SDS-PAGEを実施。試料をニトロセルロース膜に転写し、5%脱脂乳で4°C一晩ブロッキング。一次抗体PTENとβ-actin（ともに1:500、Santa Cruz Biotechnology Inc.、CA、USA）を添加し一晩インキュベート。その後、それぞれの二次抗体を添加し1時間インキュベート。増強化学発光試薬（Pierce Chemical Inc.、Dallas、TX、USA）に1分浸漬後、暗所で露光しLAS4000 mini化学発光イメージャーで現像。グレー値をβ-actinをコントロールとしてイメージングシステムソフトウェアで評価し、最終的な相対タンパク質発現量を取得。タンパク質バンドをImageJ2xソフトウェアで解析。

デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ

PTENの3'-非翻訳領域（UTR）配列がmiR-301と相互作用すると予測され、予測標的部位内の変異配列を合成し、pGL3コントロールルシフェラーゼレポーターベクター（Promega、WI、USA）のXbaIとFseIサイトに挿入。pGL3-PTEN-wtとpGL3-PTEN-mutベクターを作製。正しく同定されたwtとmutルシフェラーゼレポータープラスミドをmiR-301ミミックとミミックNCと共にKYSE30とEca109細胞に48時間コトランスフェクション。その後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をそれぞれルシフェラーゼ検出キット（Promega）で測定。

細胞培養、グループ分け、トランスフェクション

ESCC細胞株（KYSE-150、KYSE-30、Eca109、KYSE-70）を中国科学院上海生物化学・細胞生物学研究所（上海、中国）から入手。ヒト食道上皮細胞（HEEC）を明州バイオテクノロジー（浙江、中国）から入手。RPMI 1640培地（Invitrogen）に10%胎仔牛血清（FBS、Life Technologies、USA）、100 units/mlペニシリンGナトリウム（Sigma）、100 μg/mlストレプトマイシン硫酸塩（Sigma）を補充して培養。各細胞株のmiR-301発現とPTEN mRNA発現をRT-qPCRで測定し、最も高い相対発現と最も低い相対発現を示す細胞株を後続の細胞実験に選択。

KYSE-30細胞を7群に分け、それぞれmiR-301インヒビター、インヒビター陰性対照（NC）、pcDNA-PTEN（過剰発現（oe）-PTENと命名）、pcDNA-NC（oe-NCと命名）、miR-301インヒビター+low分子干渉RNA（si）-PTEN、miR-301インヒビター+si-NCで処理。Eca109細胞も7群に分け、miR-301ミミック、ミミックNC、si-PTEN、si-NC、miR-301ミミック+oe-PTEN、miR-301ミミック+oe-NCで処理。インヒビターNC、miR-301インヒビター、miR-301ミミック、ミミックNC、si-NC、si-PTENはGenePharma Ltd.（上海、中国）から購入。pcDNA-PTEN NCとpcDNA-PTENは上海桑根生物技術公司（上海、中国）から入手。細胞コンフルエンスが60%に達したとき、リポフェクタミン2000（Invitrogen）でESCC細胞に一過性トランスフェクション実施。

細胞計数キット（CCK-8）アッセイ

細胞を96ウェルプレート（1×10³ cells/well）に播種し、異なる期間インキュベート。24、48、72、96時間インキュベート後、各ウェルに10 μL CCK-8溶液（5 mg/mL）を添加し、37°Cで遮光下2時間インキュベート。450 nmでの光学密度（OD）値をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA）で分析。

コロニー形成アッセイ

トランスフェクション後、細胞を6ウェルプレートに500 cells/wellで播種し14日間培養。コロニーをメタノールで固定、0.5%クリスタルバイオレットで染色し、倒立顕微鏡で計数。

トランスウェルアッセイ

RPMI 1640培地でインキュベートした細胞（5×10³）を、非コートまたはマトリゲルコート膜（Corning、NY、USA）のトランスウェルデバイス上室に播種。24時間後、上室の細胞を除去し、下面に残った細胞を固定、0.1%クリスタルバイオレットで染色。顕微鏡（オリンパス、東京、日本）で3視野をランダムに選択し細胞数を計数。

フローサイトメトリー

細胞周期とアポトーシスをフローサイトメトリーで評価。アネキシンV-フルオレセインイソチオシアネート（10 μL）とヨウ化プロピジウム（PI；5 μL、Sigma）を細胞（5×10⁵ cells/well）と共に暗所4°Cで30分インキュベート。アポトーシス細胞割合をフローサイトメーター（BD Biosciences、CA、USA）とFlowJoバージョン10ソフトウェア（FlowJo LLC、OR、USA）で算出。

細胞周期評価では、細胞（5×10⁵ cells/well）を75%エタノールで4°C一晩固定し、5 μl PI/リボヌクレアーゼA（Sigma）で4°C暗所30分染色。データをフローサイトメーター（BD Biosciences）で解析。各試料の蛍光信号（14,000）を収集し、ModFit LTバージョン3.2ソフトウェア（Verity Software House, Inc.、ME、USA）で計算。

ヌードマウス皮下腫瘍形成

4週齢、体重16-24 gの雌性BALB/c-nuヌードマウス42匹を吉林大学実験動物センター（長春、中国）から入手。ヌードマウスを14群（n=3）に分割。7群のヌードマウスに細胞グループ分けに従いKYSE-30細胞を、残り7群にEca109細胞をそれぞれ注射。トランスフェクション済みKYSE-30とEca109細胞濃度を5×10⁶ cells/100 μLに調整。ヌードマウスを固定し、無菌条件下で対応するESCC細胞を皮下注射。腫瘍の最大長径（L）と短径（W）を毎週測定し、腫瘍体積（V）= 1/2 × L × W²で算出。注射5週目にヌードマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出・計量・撮影。腫瘍形成率 = 皮下腫瘍を持つマウス数/注射マウス総数 × 100%。注射時間を横軸、腫瘍サイズを縦軸として腫瘍増殖曲線を作成。

免疫組織化学染色

ヌードマウスの腫瘍組織を10%ホルマリンで固定、パラフィン包埋、4 μmに切片。60°Cで2時間乾燥、キシレンで脱パラフィン、勾配エタノールで脱水、50 μL 3% H₂O₂で10分処理。0.01 Mクエン酸緩衝液に浸漬、95°Cで20分沸騰、正常ヤギ血清作業液で37°C 10分ブロッキング、CD₃₄（1:100、Santa Cruz）を添加し4°C一晩インキュベート。HRP標識ヤギ抗ウサギ/マウスIgGポリマー（ZSGB-Bio、北京、中国）を添加、ヘマトキシリンで対比染色、脱水・透明化、中性バルサムで封入。一次抗体をPBSで置換したNCを用意。微小血管密度（MVD）測定：低倍率顕微鏡で観察。褐黄色に染色され周囲腫瘍細胞と結合組織と明確に区別される内皮細胞または内皮細胞クラスターを微小血管とみなす。枝構造も切断されていれば血管とみなすが、管腔サイズ>8赤血球、筋層またはより厚い管腔を持つ血管は除外。3高倍率視野の微小血管数を記録し、平均値を各症例のMVDとしました。

統計解析

全統計解析をSPSSバージョン21.0ソフトウェア（IBM Corp.、Armonk、NY、USA）で実施し、GraphPad Prism Software 6.0で提示。データを平均±標準偏差で表現。2独立群間の差をStudent's t検定で検定。3群以上の比較に一元配置分散分析（ANOVA）実施。P値 < 0.05を統計的有意差ありと判定。

結果

ESCC組織と細胞でmiR-301高発現、PTEN低発現

ESCC組織と隣接正常組織におけるmiR-301とPTEN発現をRT-qPCRとウェスタンブロットで評価し、ESCCにおける役割を明らかにしました。その結果（図1a-c）、ESCC組織でmiR-301が上昇、PTENが低下していました。患者をmiR-301またはPTEN発現の中央値で低発現群と高発現群に分け、miR-301/PTEN発現とESCC患者の臨床病理学的特徴の相関を分析。結果、miR-301/PTEN発現は年齢、性別、腫瘍サイズ、部位、分化度とは無関連でしたが、ESCC患者のTNMステージとLNMと相関しました（表2）。

次に、4ESCC細胞株とHEECでのmiR-301とPTEN発現をRT-qPCRとウェスタンブロットで測定。ESCC細胞株でmiR-301上昇、PTEN低下が確認され、KYSE-30が最も高いmiR-301発現と最も低いPTEN発現、Eca109が逆の傾向を示しました。したがって、細胞実験ではKYSE-30細胞株をmiR-301ダウンレギュレーション/PTEN過剰発現で、Eca109細胞株をmiR-301過剰発現/PTEN沈黙で処理しました。

PTENはmiR-301によって標的とされる

バイオインフォマティクスソフトウェア（https://www.microrna.org/）でPTENがmiR-301の標的遺伝子と予測されました（図2a）。デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイでさらに確認：PTEN-wtベクターとmiR-301ミミックを共トランスフェクションしたESCC細胞では、PTEN-mutベクターとmiR-301ミミック共トランスフェクション細胞と比較してルシフェラーゼ活性が有意に低下し、miR-301が特異的にPTENに結合することが示唆されました（図2b、c）。

トランスフェクション細胞でのmiR-301とPTEN発現をRT-qPCRとウェスタンブロットで評価。KYSE-30細胞（図2d-f）では、miR-301インヒビター処理細胞でmiR-301低下、PTEN上昇；pcDNA-PTEN（oe-PTEN）処理でPTEN発現上昇、si-PTENがmiR-301インヒビターのPTEN発現への効果を逆転。Eca109細胞（図2g-i）では、miR-301ミミック処理でmiR-301上昇、PTEN低下；si-PTENでPTEN発現低下、pcDNA-PTEN（oe-PTEN）がmiR-301ミミックのPTEN発現抑制役割を逆転。これらのデータはmiR-301がPTENを標的とすることを示唆しています。

miR-301阻害またはPTEN過剰発現でESCC細胞生存率抑制；miR-301上昇またはPTEN減少で生存率促進

ESCC細胞の生存率をコロニー形成とCCK-8アッセイで評価。KYSE-30細胞株（図3a-c）では、miR-301インヒビターまたはoe-PTENトランスフェクションでコロニー形成能と細胞生存率が抑制；PTEN沈黙がmiR-301インヒビターのESCC細胞生存率への影響を消失。Eca109細胞株（図3d-f）では、miR-301ミミックまたはsi-PTENトランスフェクションでコロニー形成能と細胞生存率が促進；PTEN過剰発現がmiR-301上昇のコロニー形成能とEca109細胞生存率への促進役割を逆転。これらの結果は、miR-301ノックダウンまたはPTEN過剰発現がESCC細胞生存率を抑制し、miR-301上昇またはPTEN阻害が促進することを示唆しています。

miR-301阻害またはPTEN過剰発現でESCC細胞移動・侵襲抑制；miR-301上昇またはPTEN減少で促進

ESCC細胞の移動・侵襲能をトランスウェルアッセイで評価。KYSE-30細胞株（図4a、b）では、miR-301阻害またはPTEN過剰発現で細胞移動・侵襲能が抑制；miR-301インヒビターの抑制役割がsi-PTENで逆転。Eca109細胞株（図4c、d）では、miR-301ミミックまたはsi-PTENトランスフェクションで移動・侵襲能が促進；PTEN過剰発現がmiR-301ミミックの影響を逆転。以上の所見は、ESCC細胞の移動・侵襲がmiR-301抑制またはPTEN上昇で阻害され、miR-301上昇またはPTEN低下で促進されることを示唆しています。

miR-301阻害またはPTEN過剰発現で細胞周期停止とアポトーシス誘導；miR-301上昇またはPTEN減少で抑制

トランスフェクション後の細胞周期移行とアポトーシスをフローサイトメトリーで検出。KYSE-30細胞株（図5a-d）では、miR-301インヒビターまたはoe-PTENトランスフェクションでアポトーシス率上昇、G0/G1期細胞増加、S期とG2/M期細胞減少；miR-301インヒビターによるアポトーシスと細胞周期停止の変化がsi-PTENで逆転。

フローサイトメトリー結果から、Eca109細胞株（図5e-h）では、miR-301ミミックまたはsi-PTENトランスフェクションでアポトーシス率抑制、G0/G1期細胞減少、S期とG2/M期細胞増加；PTEN過剰発現がmiR-301ミミックのEca109細胞アポトーシス率と細胞周期停止への効果を逆転。これらの結果から、miR-301ダウンレギュレーションまたはPTENアップレギュレーションがESCC細胞の細胞周期移行とアポトーシスを促進し、miR-301上昇またはPTEN沈黙が逆効果を及ぼすと結論付けられました。

in vivoでmiR-301阻害またはPTEN過剰発現がESCC腫瘍増殖と血管新生抑制；miR-301上昇またはPTEN減少で増大

各群のヌードマウスでのESCC腫瘍増殖と変化を観察。腫瘍増殖を評価し、KYSE-30細胞株（図6a-e）では、miR-301インヒビターまたはoe-PTEN注射ヌードマウスで腫瘍体積と重量減少；miR-301インヒビターの腫瘍増殖抑制役割がsi-PTENで消失。Eca109細胞株（図6f-j）では、miR-301ミミックまたはsi-PTEN注射ヌードマウスで腫瘍体積と重量増大；PTEN過剰発現がmiR-301ミミックの腫瘍増殖効果を逆転。一方、ヌードマウス異種移植片のCD34発現を免疫組織化学染色で評価（図7a-d）。KYSE-30異種移植片では、miR-301ダウンレギュレーションまたはPTENアップレギュレーションでMVD抑制；PTEN沈黙がmiR-301阻害のMVDへの影響を逆転。Eca109異種移植片では、miR-301アップレギュレーションまたはPTENダウンレギュレーションでMVD増大；PTEN過剰発現がmiR-301上昇によるMVD増大を消失。これらのデータは、miR-301阻害またはPTEN過剰発現がESCC腫瘍増殖と血管新生を抑制し、miR-301上昇またはPTEN沈黙が逆効果を示すことを示しています。

考察

ECは消化管の浸潤性悪性腫瘍の一種です。ECの主要タイプとして、ESCCは食道上皮細胞で発生する悪性腫瘍です。miRNAは小さな非コードRNAとして、RNAサイレンシングの主要分子として重要な役割を果たすことが実証されています。本研究は、miR-301とその標的遺伝子PTENがESCC進行に及ぼす影響を探る目的で設計され、miR-301阻害がPTENを上昇させることでESCCの血管新生と細胞増殖を抑制することを発見しました。

miR-301発現を評価したところ、HEECと比較してESCC細胞でmiR-301高発現が認められ、隣接正常組織と比較してもESCC組織でmiR-301高発現が確認されました。同様の結果として、Liらが心筋梗塞組織でmiR-301高発現を同定しています。また、PTENがmiR-301によって標的とされることを解明し、既存文献でも指摘されています。さらに、miR-301によって標的とされるPTENがESCC組織と細胞の両方で低下していることを発見。先行研究でも、PTENが非腫瘍食道上皮組織と比較してESCCで低発現であることが明らかにされています。また、MaらがEca109細胞株でPTEN発現低下を報告しており、本研究でも一連の実験でEca109を選択しています。これらの研究は、ESCCにおけるmiR-301高発現とPTEN低発現のエビデンスを提供しています。

本研究のもう一つの重要な成果は、miR-301阻害がPTEN発現増強によりESCC細胞のコロニー形成能と細胞増殖を抑制し、miR-301上昇またはPTEN減少が逆効果を示すことです。同様に、HanらがルテオリンによるmiR-301ダウンレギュレーションが前立腺癌細胞増殖を抑制することを解明。最近の文献では、PTEN過剰発現が膵癌細胞増殖を抑制し、前立腺癌でも同様の結果がまとめられています。また、miR-301ダウンレギュレーションまたはPTEN上昇がESCC細胞移動・侵襲を抑制し、miR-301上昇またはPTEN減少が逆傾向を示すことも発見。これに一致して、ShiらがmiR-301阻害が乳癌細胞移動・侵襲を減衰させることを支持し、miR-130b阻害とPTEN上昇でESCC細胞移動・侵襲が抑制されることも報告されています。これらの出版物は、多様なヒト癌におけるmiR-301のオンコジーン役割とPTENの腫瘍抑制効果を検証するのに役立ちました。本研究の別の結果として、miR-301阻害とPTEN過剰発現がESCC細胞のアポトーシス促進とG0/G1期細胞周期停止誘導を行い、miR-301上昇またはPTEN減少が逆結果を示しました。同様に、最近の文献で活性化PTENがESCCで細胞周期停止とアポトーシスを誘導することが明らかにされています。一貫して、TianらがPTEN上昇が血管内皮増殖因子発現低下により肝細胞癌で血管新生を抑制することを発見。以上のデータに基づき、miR-301とPTENの細胞アポトーシスと血管新生における役割が多様な疾患でさらに確認されました。結果として、miR-301ダウンレギュレーションがPTEN高発現を通じてESCC腫瘍増殖を抑制することを結論付け、同様の結論が乳癌と前立腺癌でも明らかにされています。逆に、miR-301上昇またはPTEN減少がESCC腫瘍増殖を誘導。miR-301とPTENがin vivo癌細胞増殖に関与することが結論付けられました。

結論

本研究では、miR-301抑制がPTEN上昇によりESCC細胞の血管新生、細胞増殖、移動、侵襲を抑制しアポトーシスを促進することを示しました。この研究は、ESCCの潜在的分子メカニズムの理解を深め、ESCC治療の新たな標的を提供する可能性があります。

略語

ESCC:

食道扁平上皮癌

PTEN:

ホスファターゼ・テンシン相同体

MVD:

微小血管密度

EC:

食道癌

miRNAs:

マイクロRNA

LNM:

リンパ節転移

UICC:

国際対癌連合

RT-qPCR:

逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応

3'UTR:

3'-非翻訳領域

WT:

野生型

MUT:

変異型

HRP:

ホースラディッシュペルオキシダーゼ

FBS:

胎仔牛血清

OE:

過剰発現

NC:

陰性対照

CCK-8:

細胞計数キット

DMEM:

Dulbecco改変Eagle培地

PI:

ヨウ化プロピジウム

FITC:

フルオレセインイソチオシアネート

MVD:

微小血管密度

ANOVA:

分散分析