hGC33標的ソラフェニブナノ粒子がWnt経路抑制により肝細胞がんを相乗的に抑制

概要

腫瘍特異的阻害剤の送達はがん治療の課題である。抗体修飾ナノ粒子は、特定の腫瘍関連抗原を過剰発現する腫瘍細胞に担持薬物を送達できる。ここでは、肝細胞がん（HCC）で過剰発現する膜タンパク質グリカン-3（GPC3⁺）に対する抗体hGC33で修飾した、ソラフェニブ担持ポリエチレングリコール-b-PLGAポリマーナノ粒子を作製した。hGC33修飾NPs（hGC33-SFB-NP）が、HCC細胞表面のGPC3に特異的に結合することでGPC3⁺ HCC細胞を標的とし、Wnt誘導シグナル伝達を阻害、サイクリンD1発現をダウンレギュレートしてHCC細胞をG0/1期で停止させ、上皮間葉転換（EMT）を阻害することでHCC細胞遊走を減弱させることを発見した。hGC33-SFB-NPは、GPC3分子とともにRas/Raf/MAPK経路とWnt経路をそれぞれ阻害することで、HCC細胞の遊走、細胞周期進行、増殖を抑制した。hGC33-SFB-NPはインビボで肝がん増殖を抑制し、腫瘍保持マウスの生存率を改善した。結論として、hGC33がSFB-NPのHCC細胞への標的性を高め、hGC33-SFB-NPがWnt経路とRas/Raf/MAPK経路をブロックすることでHCC進行を相乗的に抑制することを示した。

はじめに

グリカン3（GPC3）は、グリセロホスファチジルイノシトールアンカーを介する機構で細胞表面に発現するヘパラン硫酸プロテオグリカンである[1]。GPC3は発生期に様々な組織で発現するが、プロモーター領域のDNAメチル化により、ほとんどの成人組織では発現が少なくとも部分的に抑制されている[2]。しかし、HCC患者の約70%でGPC3タンパク質が過剰発現し[3,4]、Wntリガンドとの相互作用を介して古典的Wntシグナル伝達を刺激し[5]、Wnt/フリズルド結合を促進してHCC増殖を促進する[6]。古典的Wntシグナル経路の活性化は、HCC悪性形質転換に関連する最も頻繁なイベントの一つである[7,8]。GPC3のWntシグナル増強能に基づき、GPC3過剰発現が古典的Wnt経路を刺激しHCC増殖を促進すると仮定した。

GPC3のC末端部分（524-563）のエピトープを認識する治療用モノクローナル抗体hGC33は、マウスでのHepG2およびHuh-7皮下異種移植片で腫瘍増殖を抑制する[9,10]。hGC33は相補決定領域移植によりヒト化され、その抗がん効果はHepG2異種移植でhGC33と同等であり、臨床試験で使用されている[11]。これらの結果は、hGC33が重要な抗腫瘍活性を持ち、抗GPC3治療がWntおよび/または他のシグナル経路をブロックすることで、HCC細胞の増殖および/または生存を直接阻害することを示唆する。

しかし、HCCの複雑な病因により、GPC3単独ブロックの効果は限定的である[12]。したがって、HCC病因の詳細なメカニズムを探求し、HCC診断・予後の有望なバイオマーカーを特定することは、効果的な治療標的の提供と患者予後の改善に役立つ可能性がある。抗GPC3抗体がHCCの化学療法剤感受性を高めることが提案されている[13]。hGC33と標準化学療法薬の併用抗腫瘍活性が最近評価された[14]。ソラフェニブは、RAF/MEK/ERK経由の細胞シグナル伝達経路をブロックして腫瘍増殖を抑制し、腫瘍細胞増殖を直接阻害する新規経口分子標的HCC薬である[15,16]。しかし、ソラフェニブのインビボ非標的分布とHCCにおける異常活性化Wntシグナルが薬剤有効性を制限し副作用を増大させる[14-16]。WntはFrizzledファミリー受容体に結合し、細胞増殖、アポトーシス、遊走を制御する細胞内シグナル伝達を活性化し、HCCを含む多くの腫瘍で薬剤耐性を引き起こす[17-19]。

HepG2異種移植モデルでは、hGC33とソラフェニブの併用がソラフェニブ単独より腫瘍増殖抑制に有効である[15]。ポリマーナノキャリアによる薬物送達はがん治療で大きな注目を集めている。抗がん剤担持ナノキャリアは、インビボ非特異的分布と非特異的分解を防ぎ、薬物バイオアベイラビリティと抗腫瘍標的性を向上させ、薬物動態と評価を簡素化する[15,16]。様々なポリマーベースナノ粒子中で、ポリ（乳酸-共-グリコール酸）（PLGA）ベース製剤が理想的で安全な薬物キャリアと見なされている[17,18]。ポリエチレングリコール-b-ポリ(D,L-ラクチド-共-グリコリド)（PEG-b-PLGA）はポリエチレングリコールとPLGA共重合体に基づき、加水分解後安全無毒で、米国FDA承認済み[19-22]。したがって、PEG-b-PLGA共重合体ナノキャリアによる静脈注射は、標的送達達成と有効性向上の有望な戦略である。さらに、HCC細胞膜上のGPC3分子に対する特異的抗体hGC33の応用は、ナノ薬物のインビトロ・インビボ標的送達改善のみならず[18,19]、GPC3に関連するWntおよび/または他のシグナル経路をブロックし、がん細胞増殖および/または生存を阻害し、相乗的抗腫瘍活性を達成できる可能性がある。

本研究では、hGC33抗体修飾共重合体PEG-b-PLGAナノ粒子が、ソラフェニブ（hGC33-SFB-NP）のHCCへの送達をインビボ・インビトロで促進し、HCC活性標的による薬物動態変化で治療効率を改善できるかを検証した。粒子径、ゼータ電位、粒子形態、薬物包接効率、薬物担持能、インビトロ薬物放出により標的NPを包括的に評価。インビトロ標的能をHepG2肝腫瘍細胞の細胞取り込みで評価。生体内分布とhGC33-SFB-NPのHCCへの相乗治療効果を、ソラフェニブとSFB-NPと比較評価。結果、hGC33-SFB-NPがGPC3⁺ HCCを標的とし、WntとRas/Raf/MAPKシグナル経路阻害により細胞周期進行、細胞増殖、腫瘍浸潤を抑制し、肝がん進行を相乗的に抑制することを実証した。

材料と方法

材料

hGC33抗体、MTT、DAPI、JC-1、DMSOはSigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）から入手。1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩とN-ヒドロキシスクシンイミドはQiyun Biotech（中国広州）から入手。BCA蛋白定量キット、クマリン-6、Annexin V-FITC/PIアポトーシス検出キットはBeyotime Biotechnology（中国上海）から購入。PEG-b-PLGA-マレイミドジブロック共重合体（mal-PEG-b-PLGA；25,000-30,000 Da、PLGA、LA:GA、w/w；PEG、13-15%）はPolyscitech（米国インディアナ州ウェストラファイエット）から購入。PI3K抗体キット（9655#）、p-Akt抗体キット（9916#）、mTOR抗体キット（9964#）、Bcl-2ファミリー抗体キット（9942#）、アポトーシス抗体キット（9915#）、二次抗体（ゴート抗ラビット、抗マウス）はCell Signal Technology（米国マサチューセッツ州ダンバース）から購入。シクリンB1とサイクリン依存性キナーゼはAbcam Biological Technology（米国）から購入。ホスホ-Rb、サイクリンD1、チェックポイントキナーゼ1（CHK1）、P53、リン酸化乳がん感受性遺伝子1（p-BRCA1）、RAD51、シトクロムC、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP2、MMP9）抗体はAbcam（米国）から購入。その他すべての分析級化学薬品、試薬、溶媒は標準サプライヤーから入手し、精製せず使用。

細胞と動物

HCC細胞株HepG2（米国型培養コレクションATCC、バージニア州マナサス）を、10% FBS（HyClone、ユタ州ローガン）、80U/mLペニシリン、80μg/mLストレプトマイシン含有DMEM培地（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）で、5% CO₂、37℃、加湿雰囲気で培養。BALB/Cヌードマウス（20-22g、5-6週齢）を南京軍科生物技術有限公司（中国）から入手。SPF室で飼育。すべての動物飼育と処理は安徽理工大学動物飼育要件に従い実施。すべての実験プロトコルは安徽理工大学動物実験倫理委員会により審査・承認済み（承認番号：2019dw013）。

ナノ粒子（NPs）の調製

NPs調製のため、mal-PEG-b-PLGAとSFBまたはクマリン-6を秤量し、有機相（ジクロロメタン/アセトン＝3:2 v/v）に溶解。ポリビニルアルコール（PVA）溶液（5% w/v）に滴下しながら連続ボルテックス撹拌。プローブソニケーター（出力550W、8回）で氷上断続超音波処理し油水エマルション作製。エマルションをPVA（1% w/v）溶液に磁気撹拌下で添加。SFBおよびクマリン-6 NPsを8000rpm、30分遠心回収し、ミリQ水で3回洗浄。

抗体hGC33の遊離スルフヒドリル基とマレイミド基の反応によるチオエーテル結合でhGC33-NPを作製。hGC33抗体をマレイミド機能化NPsとモル比5:1（hGC33:mal-PEG-b-PLGA）で混合し、4℃で16時間連続撹拌下インキュベート。hGC33抗体のスルフヒドリル基とPEG鎖のマレイミド基の反応でhGC33をNPsに共役結合。非共役抗体をSepharose CL-4Bカラム通過で除去。BCAキット（Thermo Fisher Scientific）で効率的タンパク質共役を確認。

ナノ粒子（NPs）の特性評価

形態、粒径、包接効率（EE）、NPs安定性

TEM（H-600、Hitachi、東京）でNPs形態評価。薬物非担持hGC33-NPsと薬物非担持NPsをFTIR分光光度計（Thermo Nicolet、ウィスコンシン州マディソン）で臭化カリウム法測定。NPs平均粒径とゼータ電位をMalvern Zetasizer ZEN3600 Nano ZS（Malvern Instruments、英国）で20℃測定。薬物包接効率（EE）と薬物担持率（LC）を超濾過法で評価。サンプルを超濾過デバイス（100 kMWCO、Sartorius、ドイツ）にロードし、8000rpm、25分、4℃遠心で遊離薬物除去。同量サンプルをアセトニトリルに溶解し総薬物量確認。濃度をHPLCで測定（吸収波長266nm）。EE（%）=(担持薬物重量/総薬物重量)×100%。LC（%）=(担持薬物重量/NP重量)×100%。室温でのNPs安定性を理解するため、所定時間点（0.5、1、2、4、8、12、16、20、24時間）で動的光散乱（DLS）によりNPサイズ変化を評価（25℃）。

インビトロ薬物放出と細胞取り込みアッセイ

分子量カットオフ10kDa透析バッグでNPsからの薬物放出を調査。1mL NPsを透析バッグ（MWCO 8,000-10,000 Da、Spectrum Labs Inc.）にロード。透析バッグをPBSに浸漬し、磁気撹拌機で25℃撹拌。NPs薬物放出プロファイルを100mL 0.2Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH=7.4）で7日間測定。サンプル中薬物濃度をHPLC測定。後続研究で、hGC33-SFB-NPと同粒径のhGC33-クマリン6-NPを用いてhGC33-SFB-NP標的性を評価。HepG2（GPC3⁺）とLi-7（GPC3⁻）をhGC33-クマリン6-NPで0.5、2、4時間、37℃、5% CO₂でインキュベート。共培養細胞を洗浄、4%ホルムアルデヒドで10分固定、5μg/mL Hoechst 33,342で15分核染色し細胞内NP位置特定。共焦点顕微鏡（Olympus FV1000）で細胞内ナノ粒子画像解析。

インビトロ細胞効果

遊離hGC33（Ab）、遊離SFB、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NPの細胞毒性をMTT法で測定。対数増殖期HepG2（GPC3⁺）とLi-7（GPC3⁻）を96ウェルプレートに4000cells/well播種、37℃、5% CO₂で48時間培養。hGC33、遊離SFB、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NPで48時間処理。定時間共培養後、MTT法で抗細胞増殖活性測定[20]。各ウェル吸光度を490nm測定、半最大阻害濃度（IC₅₀）をSPSS 17.0で算出。

細胞浸潤能測定

対数増殖期細胞を6ウェルプレートに5×10⁴cells/well播種、吸引ヘッドでスクラッチ、無血清培地に交換。コントロール群と実験群で0、24、48時間の創傷治癒を記録。同時に同数細胞をTranswellチャンバーに播種し、遊離hGC33、遊離SFB、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NPで処理。下室に10% FBS培地500μL添加。24時間インキュベート後、チャンバー取り出し、4%パラホルムアルデヒド固定、0.1%クリスタルバイオレット染色。創傷治癒サイズと遊走細胞数を計測し遊走能評価。

細胞周期測定

6ウェルプレートで一晩インキュベート後、遊離hGC33（Ab）、遊離SFB、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NPで24時間処理。回収後エタノール固定。プロピジウムヨウ化物染色後フローサイトメトリー実施、modifit 3.0（Verity Software House）で細胞周期解析。

ウェスタンブロッティング

シグナル経路活性化状態と標的分子発現評価のため、6ウェルプレートで一晩インキュベート後、遊離hGC33、遊離SFB、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NPで24時間処理。各処理群細胞を回収、蛋白抽出・測定。BCA蛋白キット（Biosharp、合肥）で蛋白濃度測定・較正。サンプル蛋白を十二烷基硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離、PVDF膜に転写、無脂肪乳でブロッキング。一次抗体（1:1000希釈）を4℃一晩インキュベート、二次抗体（1:2000）を室温1時間インキュベート。ECL基質（Thermo Fisher Scientific）でバンド可視化、ゲル画像解析システムで画像表示、β-actinをコントロールとした。

インビボ抗腫瘍活性

遊離hGC33、遊離SFB、hGC33-null-NP、SFB-NP、hGC33-SFB-NPのインビボHCC増殖抑制を測定。安徽理工大学倫理委員会動物健康規定ガイドラインに従い、すべての実験を温度管理室（23±2℃）、12時間明/暗サイクルのケージ内BALB/cマウスで実施。5×10⁶生HepG2細胞含む50μL懸濁液を、5週齢雌性BALB/cマウス（20-22g）右腹部に皮下注射。腫瘍体積約50mm³到達時、マウスをランダムに6群（各群10匹）に分割。生理食塩水対照NS（200mg/kg null NP in 200μL PBS）、hGC33-null-NP（200μL PBS中、hGC33換算100μg/kg/回）、遊離hGC33（200μL PBS中、100μg/kg/回）、遊離SFB（SFB用量：8mg/kg/回）、SFB-NP（SFB用量：8mg/kg/回）、hGC33-SFB-NP（SFB換算8mg/kg/回、hGC33換算100μg/kg/回）を隔日尾静脈注射、10回投与。マウス体重と腫瘍サイズを4日ごと測定。腫瘍体積計算式：体積=0.5×L×W²（L、Wは腫瘍長径と短径）。投与4週間後、ジエチルエーテル麻酔下で腫瘍サイズと重量測定。さらに腫瘍、心臓、肝臓、腎臓、肺、脾臓を摘出、4%パラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋、切片、ヘマトキシリン・エオシン染色、デジタル顕微鏡で組織学的変化評価。

統計解析

データを平均±標準偏差（SD）で表示、SPSS 18.0で分散分析評価。対比較は両側Studentのt検定。P＜0.05で統計的有意差。

結果

NPs特性評価とインビトロ薬物放出

NP直径と表面特性が細胞取り込み、薬物放出、インビボNP分布に影響するため、調製NPを対応パラメータで特性評価。SFB-NP、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NPポリマーの形態、粒径、粒径分布を図1にまとめる。TEM観察によるhGC33-SFB-NP形態（図1a）は明確な核と曖昧なエッジを示し、hGC33がNP表面に存在することを示唆。SFB-NP、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NP粒径は100-150nm範囲で典型的単峰分布。hGC33-SFB-NP平均径（120.2±10.2nm）はhGC33-null-NP、SFB-NP、null NPよりわずかに大きい（図1a、表1）。hGC33-SFB-NPとhGC33-null-NP表面に薄い球状不明瞭な単層膜が存在し、抗体hGC33がNP表面に存在することを示唆。hGC33-SFB-NPとhGC33-null-NPのサイズ増大がhGC33膜存在を確認。¹H-NMR（図1b）でNP調製前のhGC33-SFB-NP合成を確認。5.2ppmと1.58ppmのピークは乳酸-CH₃プロトン、4.8ppmはグリコール酸-OCH₂-、3.6-3.8ppmはPEG反復単位-CH₂CH₂O-プロトンに帰属。PEG-b-PLGAとAb-PEG-b-PLGA NPs表面化学をFTIR分光法で研究（図1c）。PEG-b-PLGAポリマースペクトルでは、~1750cm⁻¹の強バンドがPLGA鎖のカルボニル基（C=O）伸縮に由来。2880cm⁻¹バンドはPEG鎖の-CH基伸縮。同時に2520cm⁻¹にピーク出現、hGC33抗体の-SH伸縮ピークと帰属。¹H NMRとFTIR結果が、抗体がPEG-b-PLGAポリマー主鎖にグラフトされていることを示した。

NPs特性評価。a TEMによるNPs特性評価、スケールバー100nm；b 合成hGC33-PLG-b-PEGの¹H NMRスペクトル（CDCl₃）；c hGC33-PEG-b-PLGAとPEG-b-PLGAのFTIRスペクトル；d PBS（pH=7.4）、37℃でのSFB-NPとhGC33-SFB-NP累積放出プロファイル；e 10% FBS含有DMEM培地中での14日間NPsサイズ変化；f PBS中での14日間NPsサイズ変化。SFB、ソラフェニブ；TEM、透過型電子顕微鏡；NPs、ナノ粒子；¹H NMR、¹H-核磁気共鳴分光法；FTIR、フーリエ変換赤外分光法

Li-7とHepG2細胞でのGPC3発現とhGC33-クマリン6-NP取り込み。培養プレート播種細胞をPBS洗浄後、100μg/mL hGC33-クマリン6-NPをDMEMで2、4、8時間インキュベート。核をDAPI染色、固定後共焦点レーザー走査顕微鏡で検出。免疫細胞化学でGPC3はLi-7細胞で検出されず、HepG2細胞で高発現。スケールバー50μm

興味深いことに、hGC33-SFB-NPとSFB-NPナノ粒子は10% FBS含有DMEM培地（pH=7.4）で約4日まで急速な薬物放出、その後比較的緩やかで安定した放出を示し、20日間の累積SFB放出はhGC33-SFB-NPで約77%、SFB-NPで約65%であった（図1d）。差異は、PEG-b-PLGAマトリックス表面の親水性分子が水和を増加させ加水分解を促進し、NP分解を加速するためと考えられる。調製NPs安定性を判定するため、hGC33-SFB-NP、hGC33-null NP、null-NP、SFB-NPを10% FBS含有DMEM培地（pH=7.4）とPBS（pH=7.4）に置いた。各種NPsサイズは2週間以上安定。SFBはhGC33-SFB-NPから14日間持続的安定に放出されたが、DMEM培地では10% FBSと比較し粒子サイズにわずかな変化あり（図1e、f）。hGC33-SFB-NP安定性はSFBの持続的生物学的役割に適する。

大きなゼータ電位はNP間の強い静電反発相互作用を引き起こしNP分散系安定性を維持する[23,24]。表1に示すように、hGC33-SFB-NP、hGC33-null-NP、SFB-NPゼータ電位はそれぞれ−18.2±2.2mV、−18.5±1.8mV、−15.9±2.1mVであり、抗体hGC33糖蛋白中のアルデヒド基、カルボキシル基、リン酸基由来の負電荷が原因と考えられる。負電荷NPsはNP懸濁液高安定性をもたらす。また、正常生理環境で細胞表面は負電荷帯電しているため、調製NPsは低電荷細胞を反発し、組織・細胞毒性が低い。さらに、null-NPとSFB-NP粒径分布（ポリ分散性指数[PDI] 0.18、0.19）は、hGC33-null-NP（PDI=0.21）とhGC33-SFB-NP（PDI=0.23）よりわずかに小さいが有意差なし。NPs粒径は良好な均一性を示す。NPs粒径、粒径分布、ゼータ電位は表1にまとめる。SFB包接効率と担持率結果により、非共役GPC3抗体hGC33を超遠心分離で除去し、hGC33抗体のNPs結合効率を評価。BCA蛋白解析でhGC33抗体NPs結合効率79.5%±2.9%を確認。

hGC33-クマリン6-NPがGPC3⁺ HCC細胞株HepG2を効果的に標的化

NPsのhGC33抗体がGPC3特異的標的能を保持するか検証するため、GPC3⁺ HepG2とGPC3⁻ Li-7を標的細胞、hGC33-クマリン6-NPをトレーサーナノ粒子として、2、4、8時間インキュベート。PBSで3回洗浄、DAPIで核染色、固定後Leica蛍光顕微鏡（DMi8、ドイツ）で撮影。同インキュベーション時間でHepG2細胞緑色蛍光強度がLi-7細胞より有意に高く（図2）、HepG2細胞内取り込みhGC33-クマリン6-NP量が有意に多いことを示す。結果は、hGC33-クマリン6-NP上のhGC33抗体がGPC3標的能を保持し、ナノ粒子内在化を媒介することを実証。HepG2とLi-7細胞のGPC3発現を間接蛍光と細胞化学染色で検証。HepG2細胞でGPC3過剰発現、Li-7細胞でGPC3非発現（図2）。

hGC33-null-NPがHepG2細胞増殖を抑制

hGC33修飾NP（hGC33-null-NP）がHCC増殖抑制可能か判定するため、GPC3陽性HCC細胞株HepG2と陰性細胞株Li-7の細胞増殖抑制を測定。hGC33-null-NPとhGC33の両方が、24時間処理後GPC3陽性HCC細胞株HepG2増殖を抑制したが、hGC33の方がhGC33-null-NPよりHepG2抑制効果が有意に高かった（図3a）；一方、hGC33-null-NPとhGC33はGPC3陰性Li-7細胞株増殖に影響しなかった（図3b）。hGC33-null-NP（0.1μM hGC33換算）とhGC33（0.1μM）のHepG2細胞増殖に対する代表的タイムコースを図3cに示す。hGC33がGPC3認識C末端ペプチドであるため、hGC33がhGC33-null-NPよりHepG2抑制に優れる。結果は、hGC33-null-NP中のhGC33分子が空間障害効果を持ち、エピトープへのhGC33結合能に影響する可能性を示唆。

hGC33、null-NP、hGC33-null-NPによるHepG2とLi-7細胞増殖抑制。a GPC3陽性HepG2細胞をhGC33、null-NP、hGC33-null-NPで処理した増殖試験。b GPC3陰性Li-7細胞をhGC33、null-NP、hGC33-null-NPで処理した増殖試験。0-2.5μM hGC33、null-NP、hGC33-null-NPで1日間インキュベート。MTT法で細胞増殖測定、未処理細胞で標準化。全値は平均±SD。対照群（0μM）抗体非処理と比較、*P＜0.01。c hGC33処理（1.0μM）におけるHepG2のhGC33、null-NP、hGC33-null-NP応答代表結果

hGC33-null-NPがHepG2細胞周期を抑制

hGC33-null-NPナノ粒子上に修飾されたhGC33抗体の分子活性メカニズム理解のため、hGC33-null-NP処理HepG2細胞周期進行を研究。HepG2細胞株で、hGC33-null-NPとhGC33がG1期細胞割合を有意に増加（図4a、b）、両者がG1期細胞周期停止誘導可能示唆。さらに、hGC33-null-NPとhGC33がHepG2細胞でサイクリンD1発現を有意にダウンレギュレート（図4c、d）。

hGC33-null-NPとhGC33がHepG2細胞でG1期細胞周期停止誘導とサイクリンD1発現抑制。a hGC33-null-NPとhGC33処理各群代表細胞周期図。b hGC33-null-NPとhGC33処理各群細胞周期解析。HCC細胞を0.5μM hGC33またはhGC33-null-NP（hGC33モル濃度基準）でインキュベート。*P＜0.05、hGC33-null-NPまたはhGC33細胞G1期を0時間細胞と比較。c,d hGC33-null-NPまたはhGC33処理後、コントロール群と比較しHepG2細胞でサイクリンD1有意ダウンレギュレート

HepG2、Huh-7、Li-7細胞でのWnt活性化

HCC細胞での古典的Wnt/β-カテニンシグナル活性化理解のため、各HCC細胞株：HepG2（GPC3⁺⁺）、Huh-7（GPC3⁺）、Li-7（GPC3⁻）でWntリガンドと受容体クリプル蛋白質（フリズルド、FZDまたはFrz）発現を検出。Wnt3aとβ-カテニン経路伝達FZD受容体が全細胞株で発現、特にHepG2とHuh-7で高発現（図5）。

HCC細胞株でのWnt3a、FZD1、FZD3発現

hGC33-null-NPがWnt3a誘導Wntシグナル伝達依存性細胞増殖を抑制

一部研究でGPC3細胞外部分がWnt共受容体となり、Wnt/β-カテニンシグナル活性化と伝達促進可能と示唆。したがって、HepG2（GPC3⁺）、Huh-7（GPC3⁺）、Li-7（GPC3⁻）を抗Wnt3a抗体、hGC33、hGC33-null-NP添加50% Wnt3a DMEM培地で48時間共インキュベートし、MTT法で細胞増殖測定。hGC33とhGC33-null-NPでWnt/β-カテニンシグナル活性化がブロックされ、HepG2とHuh-7のWnt3a調整培地での増殖が抑制されたが、Li-7では抑制されなかった。Li-7増殖はおそらくLi-7細胞表面にGPC3がないため（図6）。結果は、hGC33とhGC33-null-NPナノ粒子が細胞膜GPC3分子に特異的に結合し、Wnt3a促有糸分裂活性を部分的に中和し、Wnt/β-カテニンシグナル経路を阻害することを示す。しかし、hGC33-null-NPナノ粒子による増殖抑制はhGC33より弱かった。ナノ粒子空間構造がhGC33-null-NPに干渉し、NPs上hGC33分子機能を制限し、GPC3とWnt3a相互作用を完全にブロックできない可能性。

HCCでのGPC3活性化Wntシグナル伝達。50% Wnt3a DMEM培地に抗Wnt3a抗体、hGC33、hGC33-null-NP添加。HepG2（GPC3⁺⁺）、Huh-7（GPC3⁺）、Li-7（GPC3⁻）を48時間共インキュベート、MTT法で細胞増殖測定。データは平均±SD（*P＜0.01）

hGC33-null-NPがHepG2とHuh-7細胞でのWnt3a誘導シグナル伝達を抑制

hGC33-null-NPのHCC細胞Wnt/β-カテニンシグナルへの影響理解のため、hGC33またはhGC33-null-NP処理HepG2とHuh-7細胞蛋白を抽出。ウェスタンブロット結果、hGC33-null-NP処理後、pYAPとpβ-カテニンレベル上昇、YAPとβ-カテニンレベル低下。さらに、hGC33-null-NP群でサイクリンD1、CD44、VEGF、c-MYCレベルがコントロール群より低下、しかしhGC33処理より劣る。HepG2とHuh-7で同様効果観察（図7）。

hGC33-null-NPまたはhGC33によるWnt3a誘導β-カテニンシグナル阻害。a コントロール群と比較し、hGC33-null-NPまたはhGC33処理HepG2とHuh-7でWnt/β-カテニンシグナル経路阻害、β-カテニンとYAP減少、リン酸化β-カテニンとリン酸化YAP分子増加し細胞質で不安定化・分解。核内β-カテニン維持困難でサイクリンD1、CD44、VEGF、c-MYC発現駆動低下、これら蛋白レベル低下。b hGC33-null-NPまたはhGC33によるWnt/β-カテニンシグナル経路阻害メカニズムパターン

hGC33-SFB-NPまたはhGC33がEMT阻害によりHCC細胞遊走を減弱

HCCは世界で最も致死的ながんの一つ、発生率増加傾向。ソラフェニブは進行HCC患者の唯一承認標準治療で、生存率改善実証済み。しかし、臨床的・前臨床的観察から、薬剤耐性急速発現によりソラフェニブ療法有効性限定的。したがって、ソラフェニブ耐性獲得メカニズム解明がHCC研究主要課題。近年、HCC進行と薬剤耐性発現における上皮間葉転換（EMT）役割への注目増大。EMTは上皮から間葉細胞への形質転換で、転移・浸潤能付与、幹細胞様特性獲得、アポトーシス・老化減少、免疫抑制促進、がん発生・進行参加。E-カドヘリン発現喪失が発癌とEMT鍵ステップとされる。EMTは発生的多段階分子・細胞再プログラミング過程で、がん細胞が攻撃性獲得に利用。主にE-カドヘリン、ケラチン、ムチン、ZO-1（タイトジャンクション蛋白）ダウンレギュレート、ビメンチン、α-平滑筋アクチン（α-SMA）、フィブロネクチン（FN）、MMPs（マトリックス分解）、N-カドヘリン、スネイル、スラッグ、ツイスト、Rho、TGF-β、FGF、I型コラーゲン、II型コラーゲンアップレギュレートにより、浸潤、転移、抗アポトーシス等EMT特徴的腫瘍表現型達成。これら蛋白発現変化は主にWnt/β-カテニンとRas/Raf/MAPKシグナル経路活性化に関与。

本実験で、NPベクター表面hGC33抗体がWnt3a誘導β-カテニンシグナル伝達阻害、β-カテニン、CD44、血管内皮増殖因子（VEGF）、サイクリンD1、c-MYC発現ダウンレギュレート可能示した。さらに、hGC33-SFB-NPがRas/Raf/MAPKシグナル経路活性化阻害、HCC細胞増殖とアポトーシス抑制。hGC33とSFBが相乗効果でEMT阻害、HCC細胞遊走減少（図8）。

hGC33-SFB-NPによるEMT阻害効果。a コントロール群と比較しhGC33-SFB-NP処理群で細胞遊走減少。光学顕微鏡写真（倍率×200）。エラーバーは3回独立実験標準偏差。*コントロール群比較、p＜0.01。b コントロール群比較、hGC33-SFB-NP処理HCCでEMT関連蛋白スネイル、ビメンチン、MMP-2減少、E-カドヘリン増加。c EMT分子メカニズム。EMT、上皮間葉転換；MMP-2、マトリックスメタロプロテアーゼ-2；SFB、ソラフェニブ；NP、ナノ粒子

hGC33-SFB-NPがインビボで肝細胞がん増殖抑制と腫瘍保持マウス生存率改善

hGC33-SFB-NPインビボ抗腫瘍活性評価のため、HepG2とHuh-7細胞を雌性BALB/cヌードマウス右腹部と背部にそれぞれ皮下接種。腫瘍異種移植片増殖約30mm³到達時、マウスをランダムに群分け（hGC33-SFB-NP、hGC33-null-NP、SFB-NP、遊離hGC33、遊離SFB、対照群、各群n=5）しHCC抑制効果評価。図9a、bより、hGC33-SFB-NPがPBS対照と他処理群と比較しマウス腫瘍増殖有意抑制。PBS対照と比較し、hGC33-null-NP、SFB-NP、遊離hGC33、遊離SFBも一定程度HCC抑制、遊離hGC33と遊離SFBが直接WntシグナルとRas/Raf/MAPKをそれぞれ阻害し、一定程度HCC細胞増殖抑制可能なため。ナノ粒子修飾hGC33（hGC33-null-NP）は化学結合でナノ表面に連結されるが、GPC3分子標的化とWnt活性阻害に影響なし。ナノ粒子担持SFB（SFB-NP）は細胞内取り込み後分解され、共重合体からSFB放出しHCC増殖抑制。総じて、hGC33-SFB-NPのHepG2細胞移植片抑制効果はHuh-7より強く、おそらくHepG2がGPC3分子発現するため。

hGC33-SFB-NPのHCC異種移植ヌードマウスへの効果とマウス体重変化。肝がん細胞を各ヌードマウス背部皮下接種（n=10）。10日後、腫瘍保持マウスをPBS（対照）、遊離hGC33、遊離SFB、hGC33-null-NP、SFB-NP、hGC33-SFB-NPで処理。腫瘍サイズ（a,b）とマウス体重（c,d）を指定時点監視

各処理群ヌードマウス体重も測定（図9c、d）。対照群体重徐々減少。遊離hGC33、遊離SFB、SFB-NP、hGC33-null-NP処理群体重も進行性減少、対照群と有意差なし。しかし、hGC33-SFB-NP処理HepG2とHuh-7保持ヌードマウス体重わずか減少、治療サイクル中比較的安定維持。これら結果は、新規hGC33-SFB-NPナノ薬がヌードマウスで有意毒性なく、ナノキャリア担持SFBと表面修飾hGC33が加法的乃至相乗的抗腫瘍効果生成支持。

考察

hGC33-SFB-NPの標的HCC治療適合性検証のため、モデル共役体について、インビトロでHCC細胞ヒトグリカン-3結合能、GPC3陽性HCC細胞増殖・遊走・Wnt/β-カテニンシグナル伝達阻害能、インビボでグリカン-3過剰発現HCC阻害能を検証。

hGC33のFc領域遊離スルフヒドリル基とマレイミド機能化PEG-b-PLGA（mal-PEG-b-PLGA）を安定チオエーテル結合形成で架橋し、GPC3特異的抗体hGC33をmal-PEG-b-PLGAナノ粒子と共有結合。共役化はGPC3陽性HCC標的化の前提条件。NPs直径・ゼータ電位変化（レンズ検出）、hGC33-SFB-NP細胞内取り込み等一連実験でhGC33-SFB-NPのHepG2（GPC3⁺）細胞標的性検証。結果は抗体hGC33結合活性が共役化で変化しないこと示す。

共焦点顕微鏡で、PEG-b-PLGA NP表面修飾hGC33のGPC3⁺ HepG2とGPC3⁻ Li-7食作用効果直接検出。HepG2とLi-7をhGC33-クマリン6-NP共培養後、HepG2緑色信号強度がLi-7より有意高く、HepG2内ナノ粒子多いこと示す。この所見は、PEG-b-PLGA NP表面修飾hGC33抗体がHCC細胞表面グリカン-3に特異的結合し内在化されることと整合。hGC33修飾NP内在化効率は細胞表面GPC3抗原発現レベル依存。

標準MTT法で肝腫瘍細胞増殖抑制効率測定。hGC33-null-NPとhGC33両方がGPC3陽性HCC細胞株HepG2増殖抑制、しかしhGC33-null-NPとhGC33はGPC3陰性Li-7増殖に影響なし（図3b）。動物レベルで、hGC33-null-NPまたはhGC33単独がHuh-7とHepG2異種移植片増殖一定程度抑制、hGC33-SFB-NPがマウスHuh-7とHepG2肝腫瘍異種移植片増殖停止誘導。hGC33-null-NPがGPC3陽性肝腫瘍細胞有意抑制所見は、PEG-b-PLGA NP表面修飾hGC33のHCC細胞増殖抑制効果が細胞表面GPC3抗原発現依存的であること示す。

GPC3はWntとYAPシグナル等HCC病因多くの経路調節[25-27]。GPC3はWntリガンドと相互作用し、Wnt共受容体となりWnt/フリズルド結合促進しHCC増殖促進可能[28,29]。ナノ薬表面修飾hGC33の肝腫瘍細胞Wntシグナル経路への影響さらに検証。遊離hGC33同様、ナノ薬表面修飾hGC33が、GPC3発現HepG2とHuh-7細胞でWnt誘導シグナル伝達ブロックのみならず、Wnt3a誘導β-カテニンとYAPシグナル伝達阻害により肝腫瘍細胞増殖抑制。先行研究でYAP発現がHCCでβ-カテニンにより転写レベル調節されること示唆[30,31]。本研究で遊離hGC33とナノ薬表面修飾hGC33がWnt3a誘導YAP活性阻害、Yap/TAZがβ-カテニン複合体から放出され古典的Wntシグナル伝達開始可能示唆[32,2]。典型的WntとYAPが多様機構でクロストークすること示唆。hGC33-null-NPとhGC33比較で、hGC33-SFB-NPがインビトロ・インビボでより強い抗増殖・抗遊走能示す。したがって、hGC33はHCC細胞特異性決定のみならず、腫瘍増殖関連キーワードシグナル（Wnt/β-カテニン、Wnt/YAPシグナル経路）ブロックによりSFBのHCC細胞増殖・遊走抑制効果増強。

結論

肝細胞がん細胞で過剰発現する膜タンパク質グリカン-3に対する抗体hGC33が、ソラフェニブ担持ポリエチレングリコール-b-PLGAポリマーナノ粒子（hGC33-SFB-NP）のがん細胞グリカン-3結合を増強。抗体修飾ナノ粒子投与により、Wnt誘導シグナル伝達とRas/Raf/MAPKシグナル経路を相乗的に阻害、肝細胞がん細胞をサイクリンD1発現ダウンレギュレートによりG0/1期停止、上皮間葉転換阻害によりがん細胞遊走減弱。hGC33-SFB-NPがインビボで肝がん増殖抑制、腫瘍保持マウス生存率改善。