ポリアニリンナノスケイン：革新的合成、包括的キャラクタリゼーション、高度レドックスセンシング

概要

ポリアニリンナノファイバーで構成されるポリアニリンナノスケイン（PANS）を開発した。PANSは、逐次的な抽出、加熱、膨潤プロセスによって調製された。X線光電子分光（XPS）、フーリエ変換赤外分光（FT-IR）、熱重量分析（TGA）、ブラウナウアーエメットテラー（BET）分析による組成解析の結果、PANSは有機材料のみで構成されることが示された。さらに、PANSは周囲の酸性環境に応じて吸収特性が変化し、この特性を利用して周囲のレドックス状態変化をセンシングする可能性を示した。

はじめに

花状無機構造は、触媒[1, 2]、バイオセンサー[3, 4]、セラノスティクス薬剤[5]など様々な用途で用いられてきた。これらの複雑構造を生成する合成戦略はいくつかある。第一のアプローチはテンプレートを用いるもので、例えばリポソームをソフトテンプレートとして枝状Ptシートの形成を誘導した例がある[6, 7]。第二のアプローチは、類似の原子配列を持つ表面が接近したときに生じる一次ナノ粒子の配向性付着現象に基づく。枝状PtRuナノ粒子の合成はこの原理に基づく[8]。第三のアプローチは、特定のキャッピング剤や界面活性剤を用いて無機材料の異方性成長を誘導するもので、ポリビニルピロリドンやセチルトリメチルアンモニウムブロミド存在下でのPtおよびAuマルチポッド合成が例である[9, 10]。さらに、Geらによる第一のアプローチ[2]以降、有機–無機ハイブリッド花状構造が精力的に研究されてきた。ハイブリッド花状構造の合成では、様々なタンパク質（酵素[11]、DNA[12]など）と金属イオン（Cu[13]、Ca[14, 15]、Mn[16]など）の組み合わせが用いられてきた。近年、強酸ドーピング[17]やポリウレタンナノファイバー[18]を用いたポリアニリン（PAni）ベースの花状構造合成や、窒素ドープ炭素材料[19, 20]、ポリアクリロニトリル[21]など有機材料のみで構成される花状構造の報告もある。

本研究では、主にPAniで構成される有機花状構造の調製法とその材料特性を報告する。代表的な導電性高分子であるPAniを有機成分として用いた。PAniは、独自のドーピング/脱ドーピングまたは酸化/還元プロセスにより、変換可能な光学特性を持つことで知られる[22]。この現象を利用し、我々の研究グループはPAni仲介ナノ構造を光熱エージェント[23]や生物医療用レドックスセンシングプローブ[24, 25]として報告してきた。特に、PAniの電子バンドギャップはドーピング/脱ドーピング状態で制御可能である[26]。ドーピングと脱ドーピング状態の差は、可視域におけるPAniの光学スペクトル変化をもたらす[24]。これらの状態は、強酸、ルイス酸、遷移金属、アルカリイオンなど様々なドーパントで調整可能である[23]。

PAniナノファイバーで構成され、糸玉のような形状をしていることから、花状PAni粒子をポリアニリンナノスケイン（PANS）と命名した。また、合成されたPAniは本質的に線維状・線状分子構造（糸のような）を形成しやすい。PANSは、PAniを含むN-メチル-2-ピロリドン（NMP）溶液にベンジルエーテル（BE）を加え、加熱と精製プロセスを経て合成された（図1a）。そして、PANSの色変化に基づいて周囲のレドックス状態変化を測定し、光学特性が変換されることを確認した（図1b）。しかし、これまで多くの報告が、様々なセンシングメカニズムを用いた蛍光比率法によるグルコース検出を行ってきた[27–29]。当方の知る限り、PAniの変換可能な光学特性を用いたグルコース検出に関する最新研究は不足している。

材料と方法

材料

ポリアニリン（PAni）Mw ~ 5000、ベンジルエーテル（BE）、グルコースオキシダーゼ（GOx、アスペルギルス・ニゲル由来、145,200 units/g）、D-(+)-グルコースをSigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）から購入。N-メチル-2-ピロリドン（NMP）とエタノール（EtOH）をDae-jung（韓国）から購入。デュルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）をWelgene（韓国）から、緩衝液（pH 4）をSamchun（韓国）から購入。その他すべての化学薬品と試薬は分析級。すべての合成プロセスには超純水（DW）を使用した。

ポリアニリンナノスケイン（PANS）の合成

純粋な製品の合成プロセスは以下の通り：PAni（250 mg）をNMP（20 mL）に溶解し、BE（40 mL）を加えた。混合物を200 °Cで1時間予熱し、さらに300 °Cで30分加熱した。反応液を室温で3時間冷却した。結果として得られた溶液をEtOHで洗浄し、3000 rpmで10分遠心分離して沈殿物を分離した。その後、溶液をEtOHに再分散させた。次に、EtOHに溶解した溶液を透析膜（MWCO: 3,500 Spectra/Por® 6, SPECTRUM® LABORATORIES, Rancho Dominguez, CA, USA）で24時間透析した。透析後、15,000 rpmで30分遠心分離した。沈殿物をDW（30 mL）に再溶解した。PANSの最終濃度は8.33 mg/mLと計算された。

PANSのキャラクタリゼーション

PANSの形態は、透過型電子顕微鏡（TEM, JEM-1011, JEOL Ltd, 日本）と走査型電子顕微鏡（SEM, JSM-6701F, JEOL Ltd, 日本）で評価した。X線光電子スペクトルはK-alphaシステム（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）で記録した。フーリエ変換赤外スペクトル（FT-IR Spectrum Two, PerkinElmer, Waltham, MA, USA）分析で合成PANSの特徴的バンドを確認し、動的光散乱法（ELS-Z, Otsuka electronics, 日本）でPANSのサイズ分布を分析した。さらに、ブラウナウアーエメットテラー分析装置（Autosorb-iQ 2ST/MP, Quantachrome Instruments, Boyton Beach, FL, USA）でPANSの表面積と細孔容積を測定し、熱重量分析装置（SDT-Q600, TA instrument, New Castle, DE, USA）で重量変化を分析した。また、UV-Vis分光光度計（Optizen 2120UV, MECASYS Co., 韓国）でPANSの吸光度を分析した。

PANSを用いたグルコースセンシング

まず、GOx濃度をDPBSで15 mg/mLに調整し、グルコースをpH 4緩衝液で希釈した。グルコースの最終濃度をそれぞれ40, 20, 10, 5, 1 mg/mLに設定した。そして、PANS（1.67 mg/mL）1 mLに、GOx（15 mg/mL）20 μLとグルコース（40, 20, 10, 5, 1 mg/mL）80 μLを混合した。混合溶液中のグルコース最終濃度は、それぞれ2.91, 1.45, 0.73, 0.36, 0.07 mg/mLと計算された。PANS、GOx、グルコース混合液の吸光度をUV-Vis分光光度計で分析した。

結果と考察

PANSの形態をTEMとSEM像で確認した（図2）。PANSは階層構造を持つ球状を示した。PANS合成プロセスでは、まずPAniをNMPに溶解し、BEをPAni/NMP溶液に添加した。NMPとBEでのPAni溶解度差により、PAniが混合液へ抽出されるため、このプロセスを「抽出プロセス」と呼んだ。抽出プロセス後、PAniは線維状を示し、これはPAni分子間の分子間近接性によるものと考えられる（図2第一行、Additional file 1: Fig. S1も参照）。その後、混合物を200 °Cで1時間、300 °Cで30分逐次加熱した（「加熱プロセス」）。NMPの沸点は約203 °Cであるため、加熱プロセス後はPAniがBE中に存在することになる。加熱後、PAniは抽出プロセス時より多く核生成し、PANSの形状は球状に近づいた。また、PANS表面が皺になり始めたが、多くのPANS粒子が凝集していた（図2第二行、Additional file 1: Fig. S1も参照）。その後、PANSをエタノール（EtOH）で洗浄および膨潤させた（図2第三行、Additional file 1: Fig. S1も参照）。膨潤プロセス後、EtOHがPAni分子間に挿入されるため、分子間距離も増加する。したがって、PANSは個別粒子として存在し、階層構造も持つようになった。PANS調製の理想的条件を確認するため、PAni濃度も制御した（Additional file 1: Fig. S2）。各合成プロセス（抽出、加熱、膨潤プロセス）におけるPAni供給量に応じたTEM像解析も実施し、PAni供給量が減少すると（50.0 mg/mLから12.5 mg/mLへ）、PANSはより疎に形成されることがわかった。さらに、PAni供給量50 mg/mLでの90°傾斜SEM像により、PANSの階層構造が明確に確認された（Additional file 1: Fig. S3）。PANS形成メカニズムの詳細研究のため、PAni溶解度試験を優先的に実施した（Additional file 1: Fig. S4）。PAniは疎水性で知られ、NMPのような水混和性極性非プロトン性溶媒に溶解する[24]。PAniがNMPに溶解したとき線維状が観察された。一方、BEとEtOH中のPAniはNMP中より凝集度が高く粒子サイズも大きかった。さらに、EtOH中のPAniは各PAni分子と疎に相互作用する可能性がある。吸収スペクトル測定によるPAni溶解度試験でも、EtOHがBEと脱イオン水（DW）の中で最も溶解度が高かった。裸PAni分子はDWにほとんど溶解しない。また、PAniの分子量（Mw）による別条件実験も実施した（Additional file 1: Fig. S5）。Mw 5 kDaの場合、PANSは他の条件（Mw 10 kDa、50 kDa）よりスケイン様構造を示した。他の場合、Mw 5 kDaのようにPAniは核生成せず、これはPAniのNMPへの溶解度差に起因する現象と考えられる。つまり、PAniのMwが増加するとNMPへの不溶性が高まり、PAniナノファイバーがNMP中に存在しなくなり、結果として十分なPAniナノファイバーが存在しないため、PANSのスケイン様構造も形成されない。これらの結果から、PANSの形成は以下のように仮説立てられる：（1）裸PAniはDWに全く溶解しない；（2）PAniはNMPに最も溶解しやすい；（3）BE添加による溶解度差でPAniがNMPから抽出される；（4）加熱プロセスでPAni/(NMPとBE)混合物からNMPが気化する；（5）結果溶液をEtOHで洗浄し、EtOHがPAni分子間に挿入される；（6）PANS粒子が膨潤し、DW中で良好に分散する。

PANSの特性を調べるため、まず高分解能TEM（HRTEM）像解析を行った（図3a）。PANSは多数のPAniナノファイバーで構成される糸玉様形態を示した。PANSの分子構造を検証するため、裸PAni（bPAni）とPANSのX線光電子分光（XPS）分析を行った（図3b、Additional file 1: Fig. S6も参照）。C1sコアレベルスペクトルは4つのピークに脱畳み込み可能：C=O/C–O（286.7 eV, 1）、C–N⁺/C=N⁺（285.8 eV, 2）、C–N/C=N（285.0 eV, 3）、C–C/C–H（284.4 eV, 4）。C1sの脱畳み込みはGolczakらの先行データ[30]に基づく。特に(3)と(4)の分布変化が顕著で、これはPANS中の窒素割合が増加したことを意味する。この現象は、PANS構造中にNMPが存在し、このNMP分子がPAni分子間相互作用に影響しPANS形成に寄与することに起因する可能性がある。PANSの分子構造をさらに調べるため、bPAniとPANSのフーリエ変換赤外（FTIR）スペクトルも解析した（図3c、Additional file 1: Fig. S7も参照）。1290 cm⁻¹（芳香族C–N伸縮）、1490 cm⁻¹（ベンゾイド環のC=CおよびC=N伸縮）、1590 cm⁻¹（キノイド環のC=CおよびC=N伸縮）のピークがbPAniとPANSの両方で確認された。PANS特有の1670 cm⁻¹のピーク（図3cのアスタリスク）は、NMP中の第三級アミンに起因する可能性があり、このピークはNMPのFTIRスペクトルでも観察された（Additional file 1: Fig. S7）。bPAniとPANSの熱重量分析（TGA）結果から、PANSはPAniだけでなく他の分子も含むことが明らかになった（図3d）。bPAniの分解は約350 °Cで観察されたが、PANSの分解点は約200 °Cで、NMPの沸点と一致する。XPSからTGAまでの結果（図3b–d）は、PANSが純粋なPAniだけでなく、PAniとNMPなどの他の有機化合物で構成されることを示している。また、PANSの表面積と細孔容積をBET分析で測定した（図3e）。PANSは9.486 ± 0.728 m²/gの表面積と0.044 ± 0.004 cm³/gの細孔容積を示した（参考値：bPAniは6.358 ± 0.682 m²/g、0.019 ± 0.001 cm³/g）。これらの結果は、PANSが裸PAniより多孔質で高い表面積/体積比を持つことを意味する。水溶液中でのPANSの動的水力直径分布は799 ± 85 nmであった（図3f）。図3のこれらの結果は、PANSがPAniとNMPのみからなる有機化合物のみで構成され、階層構造を持つことを示している。

PANSを変換可能な光学プローブとしての可能性を調べるため、吸収スペクトルを用いてPANSの色変化を解析した。PAniナノ粒子、薄膜、シートなどの構造における吸収特性の変化は、ドーピング/脱ドーピング状態の変化によってよく知られている。PAniのドーピング/脱ドーピング状態は、強酸、ルイス酸、遷移金属、アルカリイオンなど様々なドーパントで調整可能である[31, 32]。PANSも周囲pH値の変化に応じて同様の特性を示した（図4）。低pH（< pH 2）では、PANSはエメラルジン塩（ES、緑色）状態に遷移し、ベンゾイド環のπ–π*遷移とポラロンバンド遷移がそれぞれ約480 nmと800–900 nmに存在することで示された[33]。pH値が上昇すると、480 nmと800–900 nmのピーク吸光度は徐々に減少し、約680 nmに強い吸収ピークが観察される。680 nmの吸収ピークは、PAniの三環式ベンゾイド部の最高被占軌道から、PAniのエメラルジン塩基（EB）状態における局在化キノイド環と周囲の2つのイミン窒素の最低空軌道への励起に帰属される[34]。PANSのESとEB状態をより正確に区別するため、EBとES状態の代表的ピーク波長位置における吸光度比（λ₆₈₀/λ₄₈₀）を計算した（図4c）。pH値が10から4へ低下するにつれ吸光度比はほぼ1.06で維持され、pH 4から1への低下で劇的に約0.88まで減少した。これらの結果は、PANSのスペクトル変化が周囲環境の変化による特定のレドックス状態変化を評価するために利用可能であることを示している。

周囲環境の変化による特定のレドックス状態変化をセンシングするPANSの能力を調べるため、グルコースとGOxを代表的候補として選択した。グルコース濃度を0.00から2.91 mg/mLまで増加させると、PANS溶液の色が青から緑へ変化した（図5a）。PANSの吸収スペクトルも解析した（図5b）が、スペクトル形状変化はpH変化実験（図4）ほど顕著ではなかった。この現象は以下の式で説明できる：

グルコース + H₂O + O₂ →(GOx) グルコン酸 + H₂O₂ (1)

H₂O₂ + PANS (EB) → 2e⁻ + O₂ + PANS (ES) (2)

式(1)では、グルコースがGOxにより酸化され、グルコン酸と過酸化水素が生成される。式(2)では、生成した過酸化水素がEB状態のPANSを還元し、ES状態へ変化させる。しかし、吸光度比（λ₆₈₀/λ₄₈₀）の値は0.98〜0.86の間で形成され、この結果はPANSが中間状態（λ₆₈₀/λ₄₈₀ = 0.98）とES状態（λ₆₈₀/λ₄₈₀ = 0.86）に存在することを示している（図5c）。グルコースとGOxの反応は代表的なレドックス反応であり、過酸化水素を生成し、さらに水素イオンと電子を生じることで知られている。これらの結果は、PANSが水素イオンと電子でドープされることを示している。その結果、ベンゾイド環のπ–π*遷移が480 nmのショルダー形成として吸収スペクトルに観察される。総じて、この結果はPANSがグルコースなどの酵素検出に利用可能であることを示している。PANSは他の酵素活性の検出や、生物学的システム内のレドックス活性確認にも利用できると考えられる。

結論

要約すると、PAniファイバーで構成されるスケイン形状PANSの調製を達成し、その形成メカニズムも提案した。PANS合成プロセスは、逐次的な抽出、加熱、膨潤プロセスを含む。PANSの組成分析により、有機材料のみで構成されることが確認された。さらに、pH値変化とグルコース・GOxの組み合わせにより、PANSが周囲レドックス状態変化のセンシング用変換可能光学プローブとして機能する可能性が確認された。本研究は、新しいクラスの3D形状ナノ構造の合成および、周囲レドックス状態変化をセンシングするナノバイオセンサーへの道を拓くものである。

データと材料の入手可能性

本研究で生成・分析されたすべてのデータは、この掲載論文に含まれています。