酸化チタンセンサーによる頭頸部がんの早期ナノ検出を実現

概要

頭頸部がんは、喉頭（声帯）、口腔、咽頭（喉）、鼻腔、唾液腺を覆う扁平上皮細胞に由来する多様な疾患です。後期診断は患者の生存率に大きく影響するため、適切なバイオマーカーによる早期発見が必須です。扁平上皮癌抗原（SCC-Ag）は循環血清腫瘍バイオマーカーであり、頭頸部がん患者で高値を示し、腫瘍体積と高い相関があります。本研究では、SCC-Ag抗体を用いて酸化チタン（TiO₂）修飾櫛形電極センサー（IDE）上でSCC-Agの検出と定量を行いました。SCC-Agの検出限界は100 fMでしたが、抗体を金ナノスター（GNS）と共役させると10 fMまで向上し、10倍の改善を達成。興味深いことに、この感度向上は他の基板と比較して1000倍高いものでした。さらに、2種類のコントロールタンパク質を用いた特異性解析では、抗体がSCC-Agのみを認識することが確認され、IDE-TiO₂センシング表面での特異的検出が示されました。

はじめに

頭頸部がんは頭頸部領域での異常な細胞増殖を示し、広く報告されています。咽頭、口腔、口腔粘膜・上皮、唾液腺、鼻腔に由来し[1]、世界で6番目に多いがんであり、年間644,000人以上が罹患しています[2]。多くの患者が進行期に診断され、生存率に大きく影響します。早期発見は生存率とQOL改善のために不可欠です。血清腫瘍マーカーは頭頸部がんの診断とフォローアップ治療の管理に用いられてきました。扁平上皮細胞から放出される主要な扁平上皮癌抗原（SCC-Ag）は、がん患者で上昇し、婦人科、肺、食道、肛門がんなど扁平上皮関連がんの有望な腫瘍マーカーとして知られています[3, 4]。頭頸部がんにおいて、高いSCC-Agレベルは転移、再発、死亡率と関連すると複数の研究で示されています[5-7]。下咽頭、口腔、喉頭のがんでは血清SCC-Agが有意なリスク因子となります[8, 9]。また、SCC-Agレベルと頭頸部がん患者の腫瘍体積に相関があります[10]。SCC-Agレベルを定量化し、頭頸部がんの状態を特定して早期治療につなげることが賢明です。本研究は、SCC-Ag抗体によるナノ粒子修飾櫛形電極（IDE）センサーでのSCC-Ag低濃度検出に焦点を当てています。

IDEは低コスト、携帯性、高感度といった有望な特徴を持つ電気化学バイオセンサーであり、環境モニタリングや医療診断など幅広い応用があります[11, 12]。センシング表面の電気的特性向上は生体分子検出を改善します。ナノ材料はバイオセンサーのセンシング表面での生体分子検出強化に広く用いられています。ナノ材料は微小サイズ、大きな表面積、優れた熱・電気伝導性、生体分子との親和性を持ち、バイオセンサー分野への応用に大きな可能性を秘めています[13, 14]。ナノ材料の応用には主に2つの目的があります：表面機能化と、分析対象物質や標的との共役による検出向上です[15]。金は確立されたナノ材料の一つで、表面プラズモン共鳴、導波路モードセンサー、電気化学センサー、比色法など様々なセンサーに応用されています[16-18]。銀、グラフェン、銅、チタンナノ材料も様々な医療応用に用いられています。環境に優しい半導体で低コストな酸化チタン（TiO₂）はワイドバンドギャップを持ち、ここではSCC-Ag検出のためのIDE表面修飾に利用しました。TiO₂の高い電気的・光学的特性により、スーパーキャパシタ、光触媒、光電変換に広く用いられています[19-23]。さらに、親水性と大きな表面積は表面修飾に適し、生体分子の低濃度検出を助けます。本研究では、生体分子相互作用時の電流フローを向上させるため、IDEセンシング表面にTiO₂をコーティングしました。SCC-Ag検出感度向上のため、抗体を金ナノスター（GNS抗体）と共役させ、TiO₂コート表面に固定化しました。金ナノ材料共役生体分子は高い安定性を示し、適切に配向した表面固定化生体分子を提供することで検出限界を改善することが証明されています[24, 25]。また、単一金粒子により多くの生体分子を固定化できるため、より高レベルの標的分子を引き寄せられます。本研究では、TiO₂（表面修飾用）とGNS（抗体共役用）という2種類のナノ材料を用いて、IDEセンシング表面でのSCC-Ag検出を改善しました。GNSの適用により、より大きな表面積でより多くの抗体を捕捉し、現在のセンサー性能を向上させることが期待されます。

材料と方法

試薬と生体分子

SCC抗原（45-55 kDaのアイソフォームを持つ糖タンパク質）をRandox Life Sciences（マレーシア）から、抗SCC抗体をNext Gene（マレーシア）から購入。(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン（APTES）、エタノールアミン、アルブミン（主要血液タンパク質、45 mg/mL、血液タンパク質の50-70%、分子量66.5 kDa）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 7.4）、チタン(IV)イソプロポキシドをSigma Aldrich（米国）から購入。セルピン（広く分布するセリンプロテアーゼ阻害剤、分子量40-50 kDa）をSino Biological（中国）から購入。金ナノスターはShanらの方法で合成[26]。全試薬・化学薬品はメーカー推奨条件で保存。

櫛形電極の作製

IDEの基本設計と作製は先行報告に従いました[27]。シリコンウェハーを標準洗浄液で洗浄後、従来のウェットエッチング法でアルミニウムIDE電極を堆積。ポジ型フォトレジストを堆積し、熱酸化を実施。フォトリソグラフィ技術でアルミニウムを堆積。3ステップ：ステップ1で1200 rpm、10秒、ステップ2で3500 rpm、20秒、その後500 rpm、10秒。紫外線（UV）露光でIDEパターンを試料表面に転写。RD-6現像液で15秒現像。フォトレジスト除去で未露光領域を除去。現像試料を100℃でベークし、不要な水分除去とSiO₂層とアルミニウムの密着性向上。最後に23秒のアルミニウムエッチャントで未露光領域を除去、アセトンで洗浄。最終表面をTiO₂で修飾しSCC-Agを検出。作製IDE表面を高倍率顕微鏡と3Dナノプロファイラで観察。関連システムで50倍拡大で画像取得。

IDEセンシング表面へのTiO₂コーティング

作製IDE表面にTiO₂溶液をコーティング。チタン(IV)イソプロポキシドを前駆体としてTiO₂溶液を調製。エタノールとチタン(IV)イソプロポキシドを混合し5分間激しく攪拌。安定化剤（酢酸100 μL）を攪拌下で滴下、ホットプレートで85℃加熱。モル比を9:1:0.1（エタノール:TIP:酢酸）で固定。3時間混合後、透明溶液を得て24時間エージング。スピンコーターで2000 rpmで二酸化ケイ素（SiO₂）基板に滴下。コーティング後、175℃で15分乾燥、450℃で1時間アニール。3層コーティングでTiO₂薄膜が十分な厚さを得ます。

GNS共役抗SCC-Agの調製

SCC-Ag抗体をリンカーの16-メルカプトウンデカノ酸（16-MDA）を用いてGNSに固定化。まず、5 mMの希釈16-MDAをGNS 100 μLと混合、室温（RT）で30分放置。GNSと結合した16-MDAを13,000×g、5分遠心分離で除去。回収した金ペレットをEDC（400 mM）とNHS（50 mM）を1:1比で15分間室温インキュベートで活性化。未結合EDCとNHSを13,000×g、5分遠心分離で除去。活性化GNSペレットを回収し抗体を共役。200 nMのSCC-Ag抗体をEDC-NHS活性化GNSと混合、RTで1時間。未結合抗体を13,000×g、5分遠心分離で除去。GNS共役抗体を4℃で保存し、UV-Vis分光法で共役を確認。480-560 nm領域でスキャンし、ピーク極大値を確認。

TiO₂-IDE表面へのGNS抗体固定化

TiO₂コートIDE表面をAPTESでアミン修飾し、GNS抗体を固定化。3%（30%エタノール希釈）APTESをTiO₂表面に滴下、RTで3時間。30%エタノールで3回洗浄し未結合APTES除去。抗体固定化のため、上記同様に活性化ステップ実施。抗体またはGNS抗体を表面に滴下、1時間待機し固定化完了。PBS緩衝液で5回洗浄し未結合抗体を完全除去。これらの抗体/GNS抗体修飾表面でSCC-Agを検出し比較。GNS抗体固定化TiO₂表面を原子間力顕微鏡（AFM）、電界放出型透過電子顕微鏡（FETEM）、エネルギー分散型X線（EDX）分析で解析[15]。AFM観察は5 μmスケール、SEMは100 nmスケール、15 kV動作。EDXで表面元素を確認。

抗体/金ナノスター抗体表面でのSCC抗原検出

SCC-Ag検出のため、抗体またはGNS抗体修飾TiO₂-IDE表面を1 Mエタノールアミンでブロッキングし、抗体フリー表面領域をマスキング、RTで30分。エタノールアミンブロッキング表面に1 nM SCC-Agを相互作用させ、SCC-Ag添加前後の電流応答を観察。検出限界評価のため、SCC-Agを10 fMから1 nMまで滴定し、抗体またはGNS抗体修飾表面に個別に滴下、電流応答を記録。実験は3回繰り返し統計処理。線形スイープ電圧0-2 V、ステップ電圧0.01 Vで測定。検出限界（LOD）はバックグラウンド信号に対する最低濃度（S/N = 3:1）と定義、すなわちLOD = ベースライン標準偏差 + 3σ。

SCC-Agの選択的検出

SCC-Agとその抗体の選択的相互作用を確認するため、2種類のタンパク質（セルピンとアルブミン）でコントロール実験を実施。これらのコントロールタンパク質を1 nM濃度で抗体またはGNS抗体修飾表面に滴下、相互作用前後の電流変化を観察。これらの電流レベルをSCC-Agの抗体およびGNS抗体による特異的検出と比較。その他のコントロール実験として、SCC-AgとGNS単独の相互作用、非免疫抗体標識GNSでコートしたTiO₂-IDE表面とのSCC-Ag相互作用を実施。実験は3回繰り返し統計処理。線形スイープ電圧0-2 V、ステップ電圧0.01 Vで測定。

結果と考察

頭頸部がんは鼻、口、喉頭、副鼻腔内外に発生する様々な腫瘍として記述されます[28]。適切なバイオマーカーによる早期診断と治療は患者生存率向上に必須です。SCC-Agは頭頸部がんの適切な血清バイオマーカーとして見出されており、ここではその抗体によるTiO₂修飾櫛形電極（IDE-TiO₂）センサー上でのSCC-Ag検出と定量を行いました。TiO₂は生体分子相互作用時の電流応答向上に用いられます。他のナノ材料と比較して、TiO₂は電極沿いの表面での活性的振る舞いと電気触媒活性向上により電気化学センサーで魅力的とされます[29-31]。さらに、表面により安定性を与え、電極による応答の再現性とピーク電流増加による検出限界向上をもたらします。この正の特徴を利用し、本研究ではIDE表面にTiO₂をコーティング（IDE-TiO₂）して電流フローを改善しました。もう一つのナノ材料GNSを用いて抗SCC-Ag抗体をIDE-TiO₂表面に固定化し、検出限界向上を図りました。金共役生体分子固定化表面が標的検出を改善することが証明されているため[32, 33]、ここではSCC-Agを抗体とGNS抗体修飾IDE-TiO₂表面で検出し比較しました。一般にナノ粒子表面積増加により生体分子結合が向上します。この文脈で、GNSは球状金ナノ粒子より大きな表面積を持ちます。このアイデアを実装するため、GNSを用いて感度向上を図った実験を行いました。

表面キャラクタリゼーションとGNS抗体固定化

図1にIDE-TiO₂センシング表面でのSCC-Ag検出の概略を示します。図1aに示すように、まずIDEセンシング表面をTiO₂でコーティングし、抗体をGNS共役あり/なしで固定化。これらの抗体修飾表面でSCC-Agレベルを検出。検出前に、UV-Vis分光法でGNS-抗体共役を確認。GNSの抗体共役前後の所望波長域スキャンプロファイルを測定。固定化後、シフトが535 nmから545 nmへ移動したことが明確に確認されました（図1b）。この結果は抗体がGNS表面に固定化されたことを確認します。一方、作製センシング表面を形態学的に観察。図2aに高倍率顕微鏡像、図2bに3Dナノプロファイラ像を示します。両画像でギャップと電極領域が明確に示され、フィンガーを形成。ギャップとフィンガーの配列は均一で完全でした。

a SCC-Ag検出の概略図。IDE-TiO₂表面をAPTESでアミン修飾し抗体またはGNS抗体を固定化。APTESのアミノ基が抗体のカルボキシル基と反応。SCC-Agを抗原領域での相互作用で検出し比較。b UV-Vis分光測定。480-560 nm領域でスキャン、ピーク極大値約530 nm。GNS抗体あり/なしを矢印で表示

a 高倍率顕微鏡像（50倍）。b 3Dナノプロファイラ像（50倍）。電極とギャップ領域を表示。ギャップを星印で表示。均一配列は作製成功を示す。c AFM像。TiO₂とGNSを暗い点と明るい点で明確に識別。d FETEM像。e EDX分析。表面で検出された元素を表示

抗体とGNS抗体固定化TiO₂-IDEセンシング表面の比較

SCC-AgをTiO₂-IDE表面で抗体またはGNS抗体固定化表面により検出。GNSのTiO₂表面への付着をAFM、SEM観察、EDX分析で確認（図2c）。AFM観察でTiO₂とGNSが暗い点と明るい点で明確に識別されました。これはSEMとEDX分析で支持され、顕著な金ピークと適度なチタンピークが観察されました。これらの結果はGNSがTiO₂表面に存在することを証明します。図3にアミン修飾IDE-TiO₂センシング表面での抗体とGNS抗体の固定化プロセスを示します。TiO₂修飾IDEセンシング表面の電流レベルは4.65E-12（図3a）。APTES添加後、5.37E-11に増加；この電流増加はAPTESによるアミン修飾を示します。抗体固定化時、電流レベルは5.375E-11から1.05E-9に変化。電流差は1.04E-9（図3a）。この固定化はAPTESのアミノ基と抗体のCOOH基の化学的相互作用によるものです[18]。電流変化が抗体のAPTES修飾表面への結合を確認。その後、残存表面を1 Mエタノールアミンで覆い、センシング表面への生体分子非特異的結合によるバイオファウリング効果を低減。同様にGNS抗体をTiO₂-IDE表面に固定化。GNS抗体をAPTES修飾表面に固定化時、電流レベルは4.41E-12から1.23E-9に増加（図3b）。抗体をGNS表面に固定化した場合、アミン修飾表面でより高い応答を示しました。これは単一GNS表面により多くの抗体が結合し、この複合体がアミン修飾表面に強く結合するためと考えられます。この結合は、APTESのアミノ末端基がGNS上のクエン酸基を置換し、APTES修飾IDE表面に化学的に固定されることによるものです[34]。センシング表面での生体分子検出は主に2要因、すなわち相互作用分子の結合親和性と分子のセンシング表面への適切な固定化に依存します。センシング表面へのより多くの生体分子固定化は、標的の低濃度検出を劇的に改善します。本研究では、IDE-TiO₂表面に抗SCC-Ag抗体を固定化するためGNSを用い、より多くの抗体結合機会を高め、効率的なSCC-Ag検出を実現しました。

IDE-TiO₂表面での固定化プロセス。a 抗体、b GNS抗体。表面修飾は3% APTESから開始、EDCとNHS活性化で抗体固定化；1 Mエタノールアミンで未結合抗体領域をブロッキング。測定には0-2 V、0.01 Vステップの線形スイープ電圧。各固定化後の適切な電流変化が抗体とGNS抗体のセンシング表面への結合を確認

抗体またはGNS抗体によるIDE-TiO₂表面でのSCC-Ag比較検出

抗体GNSがIDE-TiO₂表面で効率的な固定化を示すため、同濃度1 nM SCC-Agを両表面で検出し電流レベル変化を比較。図4aに抗体修飾表面での1 nM SCC-Ag検出を示します。検出前に抗体修飾表面をブロッキング剤エタノールアミンで覆い、生体分子の非特異的結合を回避。エタノールアミンでの電流変化は4.65E-12。1 nM SCC-Ag添加後、電流レベルは1.33E-9に増加。これらの電流変化はSCC-Agの抗体への結合を明確に示します。GNS抗体表面では、エタノールアミンでの電流レベルは1.33E-11；1 nM SCC-Ag添加後、1.62E-9に増加（図4b）。同濃度SCC-AgでGNS抗体の方がより高い電流変化を示しました。これはGNSを介してIDE-TiO₂表面により多くの抗体が結合しているためと考えられます。

SCC-Ag検出：a 抗体、b GNS抗体。上記ステップまで実施したIDE-TiO₂表面で1 Mエタノールアミンブロッキング後。測定には0-2 V、0.01 Vステップの線形スイープ電圧。1 nM SCC-Ag相互作用後、両ケースで電流レベル増加；同時にGNS抗体でより高い電流変化を示す

抗体またはGNS抗体によるIDE-TiO₂表面でのSCC-Ag検出限界

抗体またはGNS抗体修飾表面でSCC-Agの明確な検出が得られ、両表面で検出限界を推定し比較（図5a, b）。10 fMから1 nMのSCC-Ag濃度を希釈し、これら表面に個別に滴下し電流変化を記録。図5aに抗体修飾表面での異なる濃度SCC-Ag結合を示します。エタノールアミン後、10 fM SCC-Agを相互作用させたが電流変化なし。濃度を100 fMに増加させると、4.65E-12から6.54E-11へ微弱な電流変化。さらに1 pM、10 pM、100 pM、1 nMに増加させると、電流レベルはそれぞれ4.69E-10、7.91E-10、8.78E-10、1.33E-9に増加。濃度増加に伴い結合も増加することを明確に示します。3σに基づき検出限界を計算すると100 fM（図6a）。

a 抗体、b GNS抗体での濃度依存的相互作用。上記ステップまで実施したIDE-TiO₂表面で1 Mエタノールアミンブロッキング後。測定には0-2 V、0.01 Vステップの線形スイープ電圧。SCC-Ag濃度10 fM-10 nMを両表面で相互作用させ電流変化を観察。各ステップで10 mM PBS（pH 7.4）5反応容量で洗浄。濃度増加に伴い両ケースで電流レベルが漸増。GNS抗体では10 fMから電流変化、抗体のみでは100 fMから変化。両ケースとも1 nM SCC-Agで飽和。濃度さらに増加させても有意な電流変化なし

抗体およびGNS抗体修飾表面での異なる濃度SCC-Agによる電流変化比較。a SCC-Ag検出限界の線形回帰グラフ。抗体（赤線）とGNS抗体（青線）を表示。検出限界はGNS抗体で10 fM、抗体のみで100 fM。b SCC-Agと抗体相互作用による電流変化。全濃度でGNS抗体表面の方が高い電流変化。測定には0-2 V、0.01 Vステップの線形スイープ電圧。エラーバーは3回測定（n=3）の平均値、標準偏差は±0.1-0.15×10⁻⁹ A範囲。検出限界（LOD）はバックグラウンド信号に対する最低濃度（S/N=3:1）、すなわちLOD=ベースライン標準偏差+3σ

同濃度SCC-AgをGNS抗体修飾表面で独立に相互作用させました。10 fM SCC-Ag滴下時、電流が1.33E-11から3.74E-11へ明確に変化。この結果は、抗体のみのケースでは検出できなかった10 fM SCC-AgがGNS抗体固定化表面で明確に相互作用することを示します。さらに濃度を100 fM、1 pM、10 pM、100 pM、1 nMに増加させると、電流レベルはそれぞれ4.69E-10、9.23E-10、1.41E-9、1.48E-9、1.62E-9に更増加（図5b）。統計計算の標準偏差は±0.1-0.15×10⁻⁹ A範囲。両表面でのセンシング比較では、GNS抗体修飾表面がテストした全SCC-Ag濃度でより高い電流変化を示しました（図6b）。3σに基づき検出限界は10 fM（図6a）、これは抗体のみ修飾表面比10倍優れた（より低い）検出です。統計計算の標準偏差は±0.1-0.15×10⁻⁹ A範囲。先行研究ではSCC-Agがストロンチウムナノ粒子やグラフェンなど異なるナノ材料で評価されていますが、これら表面は本研究比約1000倍低い感度でした[35]。

抗体/GNS抗体修飾表面でのSCC-Ag選択的検出

SCC-Agの選択的検出を、血流中に豊富な2種類のコントロールタンパク質（セルピンとアルブミン）と比較。セルピンは異なる人体生理機能と生物学的プロセスを果たすプロテアーゼ阻害剤、アルブミンは45 mg mL⁻¹で血清タンパク質の50-70%を占めます。図に示すように、これら2コントロールタンパク質とSCC-Agを1 nM濃度で抗体またはGNS抗体表面に個別に滴下（図7a）；両ケースとも電流変化はSCC-Agのみで観察され、抗体がSCC-Agのみを認識することを示し、特異的検出を確認。コントロールタンパク質相互作用では有意な電流変化なし。この実験は現在の実験セットアップがSCC-Agを特異的に検出/診断できることを確認。さらなる裏付けとして、SCC-AgとGNS単独の相互作用、非免疫抗体標識GNSでコートしたTiO₂-IDE表面とのSCC-Ag相互作用という他のコントロール実験を実施。特異的相互作用と比較して有意な電流変化は観察されませんでした（図7b）。

a 抗体およびGNS抗体修飾表面でのSCC-Ag選択的検出。C1-セルピンとC2-アルブミンとの相互作用を実施。上記ステップまで実施した表面で1 Mエタノールアミンブロッキング後。値は3回測定平均。両ケースとも抗体のみSCC-Agを認識、特異的検出を示す。b コントロール測定。特異的相互作用と非特異的相互作用を比較。明確な識別を確認。測定には0-2 V、0.01 Vステップの線形スイープ電圧。エラーバーは3回測定（n=3）平均値、標準偏差は±0.1-0.15×10⁻⁹ A範囲

結論

頭頸部がんは口腔、咽頭、唾液腺領域に影響を与える一般的ながんです。適切なバイオマーカーによる診断は患者への必要な治療提供とQOL改善に必須です。SCC-Agはがんの重要なバイオマーカーの一つとして見出されており、ここではチタン酸化物コート櫛形電極センシング表面（IDE-TiO₂）でSCC-Agを検出しました。SCC-Ag抗体をIDE-TiO₂表面に固定化しSCC-Agを検出。検出限界は100 fM、抗体を金ナノスター（GNS抗体）と共役させることで更なる検出限界向上を達成。検出限界は10倍改善（10 fM）、これはアミン修飾TiO₂表面にGNSを介してより多くの抗体が結合したためと考えられます。さらに、2種類の異なるタンパク質でコントロール実験を行い、抗SCC-Ag抗体がそれらを認識しないことから、SCC-Agの選択的検出が示されました。実証されたIDE-TiO₂センシング表面は頭頸部がん診断を助け、早期発見の戦略として採用可能です。