卵巣癌細胞の高感度かつ迅速な検出のための柔軟なグラフェンベースのバイオセンサーのデモンストレーション

はじめに

卵巣がんは2番目に多い婦人科がんであり、婦人科がんの中で最も高い死亡率を示します[1、2]。これまでのところ、卵巣癌の非特異的症状と効果的な早期スクリーニング法の欠如のために、卵巣癌患者は一般的に非常に遅く診断されています。炭水化物抗原CA125と組み合わせた画像は、手術または化学療法後の再発の検出、診断に使用できます。 CA125は、多くの要因の影響を受け、偽陽性の予測値が高いため、卵巣がんの単一の正確なマーカーではありません。卵巣癌の再発の診断に使用したCA125の上昇（> 35U / mL）の感度は70％未満です[3]。超音波検査と放射線検査もまた、早期発見と再発診断において十分な感度も特異性もありません。 I期とII期の卵巣がんの5年生存率はそれぞれ90％と70％です[4]。外科的治療と補助療法の進歩にもかかわらず、進行期の卵巣がんの5年生存率は30％未満です[4]。卵巣がんの早期発見は明らかに高い5年生存率に関連しており、再発の早期診断も重要です。 TP53自己抗体、DNAメチル化アッセイ、マイクロRNAアルゴリズム、Papのような細胞学的分析などのいくつかの新しいアプローチは、卵巣癌の早期発見の感度を改善することが報告されています[5]。ただし、卵巣がんのすべての病期に対してより感度の高い新しい検出方法を開発することは緊急ですが、それでも困難です。

最近の研究者は、初期の腫瘍が癌細胞から血流に流れ込み、転移を引き起こす可能性があることを発見しました[6]。細胞は、原発腫瘍、再発、または循環腫瘍細胞と呼ばれる転移からの血管内侵入を介して末梢血流に入り、固形腫瘍の診断または予後バイオマーカーとして使用できます[7]。 CTCは末梢血ではまれであり、検出方法には高い感度と特異性が必要です。近年、免疫磁気分離、マイクロ流体分離、フィルターベースの方法、およびリガンド標的PCRがCTCの検出で報告されました[8、9、10、11]。現在まで、Janssen Diagnosticsの細胞検索システムは、米国食品医薬品局（FDA）が承認した唯一のCTC検出方法であり、転移性乳がん、結腸直腸がん、および前立腺がんの患者を監視するために使用できます[12、13、14]。卵巣癌におけるCTCの検出は、非侵襲的な診断方法を提供し、生検が困難な場合に利点があります。しかし、卵巣がんの初期段階でのCTCの検出率はまだ低いです。より高い感度でCTCを検出するための新しい方法が依然として必要です。卵巣がん患者のCTCを簡単に検出できれば、腫瘍の早期発見、再発のモニタリング、治療効果の両方に役立つ可能性があります。

二次元半導体であるグラフェンは、2004年にAndreGeimとKostiaNovoselovによって分離されました[15]。最近、グラフェンのような2D材料は、センシングとバイオセンシング、エネルギー変換と貯蔵、触媒作用、複合材料とコーティング、エレクトロニクスと生物医学の分野で広く適用されています[15]。グラフェンセンサーは、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、炭水化物抗原19–9および15–3を検出するために開発された、その独特の構造と優れた電気的性能により、癌バイオマーカーを検出する有望な候補です[16、17、18、19 ]。剛性SiO ₂ 上に製造された従来のグラフェンベースのバイオセンサーとの比較 貴重な設備を使用した従来のフォトリソグラフィー、電極蒸発、リフトオフ、センサーパッケージプロセスによる/ Si基板では、高感度で迅速な検出速度を備えた柔軟なグラフェンベースのバイオセンサーを製造するための低コストで簡単なアプローチを開発することが重要です。

このような問題に対処するために、ここでは、PET基板上にグラフェンベースの柔軟なバイオセンサーを製造するための新規で簡単なアプローチを開発します。 2つの電極は、銀ペーストを使用してグラフェン/ PET上に直接製造され、セルプールはシリコーンゲルを使用して直接構築されました。この柔軟なバイオセンサーは、フォトリソグラフィープロセスや貴重な設備を必要とせずに、どの実験室でも手作業で作ることができます。驚いたことに、私たちのグラフェンベースの柔軟なバイオセンサーは、高感度を示し、卵巣癌細胞を迅速に検出することができます。私たちの知る限り、卵巣癌細胞を検出するための柔軟なグラフェンベースのバイオセンサーに関する報告はまだありません。

材料と方法

グラフェンフィルムの成長と転写

この研究では、化学蒸着（CVD）によってCu箔（Alfa Aesar、No。13382）の表面にグラフェン膜を成長させました[20]。まず、Cu箔の表面酸化物を20％塩酸溶液で5分間除去しました。次に、Cu箔を脱イオン水で数回洗浄した後、窒素流で乾燥させた。洗浄した銅箔を石英ボートに載せ、CVD炉の石英管に入れました。炉室は1×10 ^–2 までポンプダウンされました Pa。炉の温度を1000°Cまで20分間上昇させ、50 sccmで99.999％H ₂ 次に、50 sccmの99.999％メタンをチューブに導入して、大面積のグラフェン膜を20分間成長させました。最後に、CVD炉をCH ₄ で室温まで冷却しました。 / H ₂ ガスの流れ。

大面積のグラフェン/ Cu箔は、多くの望ましい部分に切断されました。次に、PMMAをグラフェン/ Cu箔の表面にスピンコーティングし、PMMA /グラフェン/ Cuサンドイッチ状構造を形成しました。続いて、下にあるCu箔を1 M FeCl ₃ でエッチングしました。 解決。 PMMA /グラフェンをDI水中で30分間洗浄した後、PET基板に転写しました。最後に、PMMAをアセトンで除去し、グラフェン/ PETサンプルを取得しました。

グラフェンベースのバイオセンサーの製造

グラフェンベースのバイオセンサーの製造手順は次のとおりです。まず、銅箔上の約1cm×2cmのグラフェン膜をPMMA支援湿式転写法により1cm×2cmのPET基板に転写しました。次に、銀ペーストを使用して、グラフェン/ PETフィルムの中心付近に2つの電極を作製しました。最後に、がん細胞溶液の電気的応答をテストするために、長さと幅が数ミリメートル、高さが約1 mmのセルプールを、電極の端にシリコンゲルで構築しました。セルプールのシリコンゲルが完全に固化したら、Agilent 4155B半導体アナライザを使用して、グラフェンバイオセンサーが正常に機能するかどうかを確認できます。

SKOV3卵巣がん細胞の培養

SKOV3卵巣癌細胞シリーズ（西中国第二付属病院の公立研究所から提供）を、5％COの条件下で10％子牛血清（MRC、米国）を含むRPMI-1640（トランスジーン、フランス）完全培地で培養しました。 ₂ および37°C。

細胞溶液の調製と電気的測定

癌細胞は細胞培養培地で特定の濃度に希釈されました。測定用の溝にピペットで50μLの細胞溶液を取ります。電気信号は、Agilent4155B半導体アナライザによって記録されました。

結果と考察

10×10cm ² の写真 Cu箔上の大面積CVD成長グラフェン膜を図1aに示します。図1aから、明るい金属色の裸のCu箔と比較して、グラフェン/ Cuの色が少し暗いことがわかります。グラフェン/ Cuの対応するラマンスペクトルを図1bに示します。図1bに示すように、ラマンピークは1580 cm ^-1 および2680cm ^-1 グラフェン膜のGおよび2Dピークに対応します。グラフェン膜の品質をさらにチェックするために、SiO ₂ に転写された単層グラフェン膜のラマンスペクトルを測定しました。 / Si基板、図1cに示すように。 I の比率がわかります _G および私 _2D 0.5未満であり、グラフェンの厚さが単分子層であることを確認します。また、Dピークが非常に低く、ほとんど観察できないことも観察できます。これは、グラフェン膜の品質が非常に高く、欠陥が非常に少ないことを示しています。

a 裸のCu箔（左パネル）とCu箔上に成長したグラフェン（右パネル）の写真、 b グラフェン/ Cuのラマンスペクトル、および c グラフェン/ SiO ₂ のラマンスペクトル / Si

PET基板上の柔軟なグラフェンバイオセンサーの写真を図2に示します。癌細胞溶液を細胞プールに追加し、2つの銀ペースト電極からグラフェンバイオセンサーの電気信号を取得できます。細胞培養培地とCTC溶液の電気的応答を測定しました。

グラフェン/ PETバイオセンサーの写真

このような液体の電流応答の時間依存性は、セルプールに入れる前後の0.01Vの固定電圧で記録されます。図3に示すように、このような液体を浸す前に、電流が一定に保たれていることがわかります。そのような液体がセルプールに入れられると、電流は急速に減少し、その後ゆっくりと新しいバランスを保ちます。応答はηとして定義されます =（ I ₀ − 私 ）/ 私 ₀ * 100％、ここで I ₀ は液体を浸す直前の電流であり、 I ある時点で液体を浸した後の最大（または最小）値です。そのような液体を入れると、書記素の抵抗が増加することがわかります。裸細胞培養培地、および浸漬溶液200の前後のCTC溶液の電気的応答は、それぞれ2.96％と37.04％です。明らかに、裸の細胞培養培地と比較して、30細胞/ mlでもCTC溶液の電気的応答は非常に重要であり、これは柔軟なグラフェンベースのバイオセンサーが癌細胞の検出に非常に敏感であることを示唆しています。

a 裸細胞培養培地の電気的応答、および b 30個の細胞を含むがん溶液

裸細胞培養培地と30がん細胞/ mlのCTC溶液の電気信号の時間依存性を図3からさらに分析します。図4に示すように、裸細胞培養培地と比較して、電気信号がCTCソリューションの応答（30セル/ mlでも）は非常に感度が高く、高速です。細胞溶液を浸した後、5％、10％、15％、20％、25％、30％の応答に達するのに、2.1、2.0、4.5、7.5、10.5、28.5秒しか必要ありませんが、対応する細胞培養の応答は培地は0.15から1.3％にしか増加しません。つまり、柔軟なグラフェンバイオセンサーは、5秒以内の迅速で高感度な検出に非常に適しています。

細胞培養培地とCTC溶液の電気的応答の時間依存性

さらに、10,000（10 K）/ mlの同じ濃度の2種類のCTCがん細胞（SUDHL8細胞とOCILYS細胞）の電気的応答を調査しました。図5に示すように、傾向が少し異なり、電気的応答に大きな違いがある2つの異なる癌細胞の電流の時間依存性。つまり、グラフェンバイオセンサーは、さまざまな癌細胞を識別するために使用されることが期待されています。

さまざまながん細胞の電気的応答の時間依存性： a SUDHL8、および b OCILYS

10,000（10 K）/ mlおよび100K / mlのさまざまな細胞濃度のSUDHL8がん細胞溶液の電流と応答の時間依存性も調査されました。図6に示すように、がん細胞濃度の低い溶液はより高い電流を示すことがわかります。これは、がん細胞が絶縁性である傾向があり、より多くの細胞が導電性に有益ではないことを示唆しています。 2つの濃度の溶液の応答の時間依存性は同様の変化傾向を示し、低濃度の溶液の応答は高濃度の溶液の応答よりも少し高くなっています。これらの結果は、バイオセンサーを使用して、さまざまな濃度のがん溶液を特定できることを示しています。

電流の時間依存性（ a ）と応答（ b ）10Kおよび100K細胞/ mlの濃度が異なるSUDHL8がん細胞の場合

上記のように、結果は、安価で柔軟なグラフェンベースのバイオセンサーが、細胞培養培地および癌溶液、異なる癌細胞および異なる濃度の癌細胞溶液に対して異なる応答を示すことを示し、これは、そのような柔軟なグラフェンベースのバイオセンサーが有望であることを示唆しているCTC卵巣がん細胞の検出と識別に使用されます。

結論

特に卵巣癌の効率的な早期発見方法を開発するために、PET基板上に非常に単純なグラフェンベースの柔軟なバイオセンサーを開発します。この柔軟なバイオセンサーは、細胞プールと2つの電極で構成され、細胞溶液の添加前後の電気信号を比較します。これは、高感度と高速検出速度を示します。それは、細胞培養培地および癌溶液、異なる癌細胞および異なる濃度の癌細胞溶液に対して明らかに異なる応答を示す。私たちの研究は、柔軟なグラフェンベースのバイオセンサーが、CTC卵巣癌細胞を高感度かつ迅速に検出/識別するために使用されることを約束していることを示しています。

データと資料の可用性

著者は、関連するすべてのデータが記事とその補足情報ファイルに含まれていることを確認できます。

略語

CA：

炭水化物抗原

CTC：

循環腫瘍細胞

PET：

ポリエチレンテレフタレート

FDA：

食品医薬品局

CVD：

化学蒸着