Cs_0.33WO₃ナノ粒子を用いたNIR誘発ハイパーサーミアの最適化によるHepG2肝癌治療

要旨

ハイパーサーミアは、非侵襲性、副作用と毒性が最小限、実装が容易であるため、がん治療において最も患者に優しい方法の一つであり、光熱的にトリガーされる投与システムなどの新しい治療法の開発を促している。本研究では、Cs_0.33WO₃ナノ粒子（NPs）の光熱効果に関する変数、すなわち照射時間、光出力密度、NP濃度が、in vitroでのHepG2肝癌細胞株に及ぼす影響を検討し、近赤外（NIR）照射熱線量を策定した。具体的には、粒子特性サイズ120 nmのNPsを一連の酸化還元（REDOX）反応、熱アニーリング、ウェットグラインディングプロセスで合成し、動的光散乱（DLS）、エネルギー分散型X線分光法（EDS）、走査およびトンネル電子顕微鏡（SEMおよびTEM）、X線回折（XRD）、可視近赤外（VIS-NIR）分光光度法を用いて物理的、組成的、光学的、光熱的特性を評価した。NPsの細胞毒性とその照射パラメータをHepG2細胞で測定した。細胞をNPsとインキュベートすることでエンドサイトーシスの状態を確認し、細胞含有培養皿の培地温度を人体温度である約36.5 ℃に維持しながら、光熱線量の変数パラメータに対する細胞生存率の依存性を決定した。

はじめに

世界では、2018年だけで凶悪ながん疾患が約1000万の命を奪い、推定1800万の新規症例が追加された[1]。これまで、化学療法、放射線療法、手術切除、またはこれら3つの調整された組み合わせが、治療を受けたがん患者の5年生存率をわずか40%以上に改善してきた[2,3]。しかし、化学物質とイオン照射の毒性と有害性は、脱毛、心毒性、不妊、染色体異常など、数多くの副作用を必然的に引き起こす[4,5]。このような生命を脅かす結果は、NPs含有化合物を含む患者に優しい治療薬の開発を強く促している。

100 nm以下のサイズスケールにおける特異な材料系、構造、形状、原子化学量論に基づくナノテクノロジーは、量子化現象によって強化された前例のない化学的、物理的、生化学的特性を生み出し、すでに医学科学の多くの分野で前臨床およびin vitro応用を見出している[6,7]。化学療法の欠点があるにもかかわらず、NPsが送達キャリアとして機能することで、病変腫瘍への薬物放出の選択性が向上し、腫瘍細胞による薬物取り込みが促進され、健康な組織への累積毒性が大幅に軽減される[8,9]。また、NPベースのイメージングモダリティのアレイによって生成される画像品質は、より高い感度、より細かい空間分解能、より良い深度透過によって大幅に向上し、生体分布の解明、薬物取り込みの監視、腫瘍の局在化、治療効果の評価が可能になる[10]。診断機能に加えて、NPsが無線周波数（RF）アブレーションや光熱的にレンダリングされるハイパーサーミアなどの固有の物理的特性を活用すると、望ましい部位にさらなる損傷を効率的に誘導できる[11-13]。そのうち後者は、部位特異的投与、疼痛度の低さ、副作用の少なさ、組織焼損リスクの大幅な低減から一般的に好まれる。

現在まで、光照射によってハイパーサーミアを誘導できるNP材料系には、金（Au）、セシウムタングステート（CsWO₃）、酸化鉄、硫化銅、グラフェン、カーボンナノチューブがあり、細胞外または細胞内温度をその場で上昇させることでがん細胞に致死的なダメージを与える適用性を示している[14-18]。NP強化RFアブレーションと同様に、光子源の入射出力密度レベルは臨床的安全性と患者の快適性にとって重要な問題である[11]。国際非電離放射線防護委員会（ICNIRP）が2013年に発表したガイドラインによると、400-980 nmの可視光およびNIR波長範囲におけるヒト皮膚の最大曝露限度は0.2-0.726 W/cm²である[19]。それにもかかわらず、これまでのin vitroがん細胞研究で報告された光出力密度の多くは、皮膚組織の安全限度を大きく超えており、光照射に対する脆弱性の閾値が低い内部生体組織を治療する際には深刻な問題となり得る。例えば、がん細胞の効果的な破壊を示した金（Au）NPsのNIR光出力密度は、10分以内の照射で2-80 W/cm²の範囲であった[13,14,20-22]。同様に、グラフェン酸化物[18]、白金鉄（FePt）[23]、NaYF₄:Yb,Erナノ結晶[24]などの他の材料系も、150 mW/cm²以上を必要とした。

in vitro実験で比較的未開拓の材料であるCsWO₃ NPについて、いくつかの研究が、少なくとも0.72 W/cm²のNIR照射CsWO₃ NPsによる子宮頸がん細胞（Hela）の壊滅を報告している[15,25,26]。これはICNIRPが定める皮膚組織のNIR波長曝露限度の近傍にあり、長時間曝露では健康な組織に有害な影響を及ぼす可能性がある[19]。さらに、過去の研究では、治療用NP濃度、光曝露時間、光強度の組み合わせによって生成される培地温度が40 ℃を大きく超えており、健康なヒト細胞にとって耐え難いものであった。また、がん細胞の死亡率が詳細に明確にされていなかった。

CsWO₃ NPは、800 nmから2400 nmのNIR波長範囲で非常に吸収性が高く[27]、生物医学用途に機能的に適している。がん細胞排除における優れた効果が実証されているにもかかわらず、細胞毒性はまだほとんど不明であり、皮膚組織の安全光曝露限度内での光出力密度、低細胞毒性NP濃度、短い照射時間の投与処方はまだ欠けている。

本研究では、直径5.2 cmのシャーレで培養したHepG2肝癌細胞を、皮膚組織の光曝露限度内にある非細胞毒性NP濃度と光出力密度を用い、細胞培地温度を正常人体温度の36.5 ℃に維持しながらNIR照射で壊滅させることの可能性をin vitroで評価することを試みた。詳細には、平均特性サイズ120 nm付近のCs_0.33WO₃ NPsを、一連のレドックス反応、熱アニーリング、ウェットグラインディングプロセスで合成し、表面形態、結晶性、光学的および時間的光熱特性を評価した。さらに、中心波長980 nmで動作するNIR照射の照射時間、NP濃度、光出力密度という可変線量パラメータの光熱効果がHepG2がん細胞の生存率に及ぼす影響を検討・判断し、安全な治療線量の組み合わせを策定した。

方法

本研究では、ヒト原発腫瘍由来の第102世代HepG2肝癌細胞株を実験モデルとして培養し、NIR照射した自作Cs_0.33WO₃ NPsによる細胞毒性と、皮膚組織曝露の安全限度内かつ無毒性NP濃度での様々な熱線量の治療効果を評価した。

Cs_0.33WO₃ NPsの合成

図1の左パネルは、セシウムタングステン酸化物（Cs_0.33WO₃）NP材料の合成手順のフローチャートを示す。簡単に言うと、前駆体化学物質である（NH₄)₂WO₄（Alfa Aesar、純度99.9%）とCsCl（Alfa Aesar、純度99.9%）をそれぞれ100 mLのDI水に溶解し、25 ℃で磁気撹拌機を用いて250 rpmで1時間定常撹拌しながら混合した。撹拌後、混合溶液を含むビーカーの温度を180 ℃に調整し、溶液の水分が完全に蒸発するまで焼成した。得られた乾燥白色粉末がCs_0.33WO₃材料の最終前駆体である。チラーをオンにした状態で、前駆体粉末を含む石英ボートを高温炉管の中心に装入し、炉管内の圧力を0.08 torrに引き下げた。その後、前駆体を500 ℃で加熱し、H₂とN₂の混合ガスを90:10 SCCM（標準立方センチメートル/分）の比率で流入させてレドックス反応を促進した。1時間後、H₂ガスの流入を止め、N₂ガス流量を100 SCCMに調整し、炉温度を800 ℃に上げて1時間熱アニーリングを行った。プロセス完了後、チラーと温度制御炉をオフにし、石英ボートを室温まで冷却して炉管から取り出した。石英ボートから得られた暗青色粉末がミクロン（μ）サイズのCs_0.33WO₃粉末である。粉末粒子の特性サイズをさらに縮小するため、μ粉末15 g、共重合体系分散剤3.8 g（凝集防止）、消泡剤10 μl、DI水で構成される150 gの混合溶液を調製し、600 gのジルコニアビーズを含むサンプルボウルに注ぎ、ナノグラインダー装置（Justnanotech Co.、台湾）に搭載した。回転数2400 RPM、温度15 ℃に設定し、0.1 mm ZrO₂ビーズでμ粉末を4時間、さらに0.05 mm ZrO₂ビーズで4時間グラインディングしてNPsを製造した。各グラインディングプロセスの総時間は4時間を超えないようにし、過度な流体粘度上昇や材料物理サイズの異常な変化を防止した。グラインディングプロセス後の最終溶液を0.22 μm孔径フィルターでろ過し、その後のすべての特性評価と実験に用いた。Cs_0.33WO₃ NPsの蛍光版（fNPs）は以下のプロトコルで作製した。28 mg/mL濃度のフルオレセイン2 mLと、1.5 mg/mLのCs_0.33WO₃ NP溶液2 mLをビーカーで混合し、超音波シェーカーのボウルに入れて15分間処理した。その後、NP溶液と分散剤を1:1.25の比率で混合し、さらに15分間超音波振動させた。得られた溶液をDI水で洗浄し、10,000 rpmで15分間遠心分離し、これを使用前に2回繰り返した。

材料合成、NPsとの細胞インキュベーション、がん細胞への光熱アッセイの実験手順の概略図。BCL、TEn、PDはそれぞれバイコンケーブレンズ、熱エンクロージャー、ペトリ皿の略語；赤矢印は図1のレーザービーム隣のビームプロファイル測定位置を示す

材料特性評価

その後、Cs_0.33WO₃ NPsの特性評価として、NPsの統計的特性サイズ、結晶構造、構造形態、輪郭形状、VIS-NIR光吸収率を、ゼータ電位分析（ZS90、Malvern、UK）、XRD（D2 Phaser、Bruker AXS GmbH、ドイツ）、内蔵EDSを備えたSEM（SU-5000、日立、日本）、TEM（JEM-2100F、JEOL、日本）、動的光散乱（DLS）（Delsa Nano C、Beckman Coulter、USA）、UV-VIS-NIR分光光度計（V-750、JASCO、日本）を用いてそれぞれ行った。XRDスペクトルは、試料にX線を20°-80°の角度範囲で走査速度4°/分で照射して取得した。試料からの走査角度依存性回折信号を測定し、粉末回折基準委員会（JCPDS）カードNo. 83-1334のCs_0.32WO₃標準XRDスペクトルと比較した。NPsの光熱特性の時間依存性を確認するため、980 nm波長のNIRレーザーと温度測定プローブで構成される簡易実験装置を用意し、NIR照射溶液によって生成される温度状態を調べた。検討溶液には、DI水希釈NP溶液と、細胞培養培地とのNP溶液混合物が含まれる。ペトリ皿内の試料の光学ビーム径は、ペトリ皿全表面を覆うように拡大し、推定光出力密度0.05 W/cm²を生成させ、それ以外は2 W/cm²のままとした。図1右パネルに示す光学セットアップを用いてNIR照射を行った。光学システムの中心は、4 mmのビーム径を5.2 cm（ペトリ皿表面径と同等）に拡大するバイコンケーブレンズに向けられたNIRレーザービームである。ペトリ皿は36.8 ℃に設定されたホットプレート上に置かれ、これは細胞増殖のための生理的温度である。また、ペトリ皿はプラスチック製円筒形エンクロージャーで囲まれ、周囲環境と培地の温度平衡を助ける。追加ファイル1：図S1は、図1のレーザービーム横の赤矢印で示されるビーム開口出口で測定されたNIRレーザービームの光学強度マッピングを示す。ビームプロファイルは光学強度の3D分布を示し、ペトリ皿開口部全体での光場の均一性を検証している。

細胞毒性と光熱アッセイ

細胞培養サイクルを開始するために、Ham's F-12栄養混合液440 mLとDulbecco変法Eagle必須培地（HDMEM）、胎児牛血清（FBS）50 mL、L-グルタミン5 mL、ペニシリン-ストレプトマイシン（P/S）5 mLで構成される500 mLの培地溶液を、孔径0.22 μmのメッシュフィルターで滅菌して調製した。直径10 cmまたは5.2 cmの細胞含有ペトリ皿に、それぞれ8 mLと2 mLの培地を充填し、一次培養と継代培養に用い、5% CO₂、37 ℃の条件でインキュベーターで培養した。細胞増殖の観察と培地の更新は2日ごとに行った。

以下のケースの生存率を得るために：（1）外部入力なしのコントロール、（2）単独NIR照射、（3）NPsとのインキュベーション、（4）NPsインキュベーション後のNIR照射、培養皿の培地を吸引し、0.4 mLのトリプシンを加えてインキュベーターで約10分間放置した。細胞が皿壁から剥離したことを確認したら、細胞含有培地10 μLを培養皿から採取し、マイクロ遠心管内のトリプランブルー溶液10 μLに加え、リン酸緩衝液（PBS）で数回洗浄して残留浮遊NPsを除去した。その後、染色細胞溶液10 μLを注入孔からカウンティングプレートに充填し、ステレオ顕微鏡の焦点面で細胞を観察し、手動カウンターで計数した。細胞生存率に関するすべての図の各データポイントは、3回の実験試行（N=3）の平均値と標準偏差で示した。

NPsの細胞毒性評価と細胞生存率への光熱効果評価の準備として、5.2 cm皿の培地を除去し、適量の新しい培地中のNP溶液で再充填して、2、1.5、1、0.5 mg/mLのテスト濃度アレイを作り、実験前に1日間インキュベートした。

光熱アッセイに先立ち、細胞毒性評価を行い、NP濃度アレイに対する細胞応答を調べた。手順は以下の通り。細胞とNPsを含む培地をインキュベーターから取り出し、吸引した。予熱したPBS 1 mLでがん細胞を洗浄し、エンドサイトーシスを経なかった残留浮遊CsWO₃ NPsを吸引した。この手順を数回繰り返し、新しい培地でのNP誘導温度上昇による潜在的な細胞死がないことを確認した。光熱処理後、細胞毒性と光熱アッセイのための細胞計数手順を実施した。

結果

Cs_0.33WO₃ナノ材料の光学吸収率と光熱特性は、結晶構造、アニーリング後温度、原子化学量論、粒子特性サイズに大きく依存する[28,29]。

Cs_0.33WO₃ μ粉末の表面形態を特性評価するため、10,000倍拡大のSEM像を取得し、図2aの赤矢印で示される象徴的な柱状六方晶構造を視覚的に確認した。また、TEM像は図2bに示すようにμ粉末粒子の輪郭形状と特性サイズを示しており、その特性サイズは約1 μm以下である。NPsのロッド状幾何学と、120 nm付近を中心としたナノスケール特性サイズのDLS分布ヒストグラムも検証され、図2cと対応するインセットTEM像に示されている。また、μ粉末とNPsの結晶特性評価をXRDで行い、図2dに示す。μ粉末のXRDスペクトル（上段パネル）から、(002)、(102)、(200)、(112)、(202)、(212)、(004)、(220)、(222)、(204)、(400)、(224)面に沿った象徴的な結晶化面が、JCPDSカードNo. 83-1334のCs_0.32WO₃標準スペクトルとよく一致することが観察される。μ粉末の特性サイズが120 nmまで縮小すると、すべての回折ピーク強度が単調に減少し、強いNIR吸収を示す(102)面や(220)面などの特性ピークがスペクトル上で見えなくなるほど小さくなる。同様に、図2eに示される原子構成要素、セシウム（Cs）、タングステン（W）、酸素（O）の同定は、それらの原子存在を確認するだけでなく、最初に設計した化学量論に近いCs対Wの原子比率0.315を認証している。

物理的および材料特性評価。a SEMおよびb TEM像（μ粉末）、c NP特性サイズのDLS分布ヒストグラム、d μ粉末と120 nm NPsのXRDスペクトル、e 原子組成百分率付きEDSスペクトル。a、b、cのスケールバーはそれぞれ1.5 μm、200 nm、100 nm

材料特性評価に加えて、NPsの光学吸収スペクトルと温度上昇のタイムコース光熱変調を測定し、図3に示す。図3(a, b)では、NIR吸収率の濃度依存性と、NIR照射NP溶液による温度上昇プロファイルの濃度依存性を描いており、例えば1 mg/mLのタイムコース温度プロットは40 ℃を超え、少なくとも1時間安定して維持され、材料の光熱安定性と耐久性を確認している。同様に、図3cのタイムコース温度プロファイルは190分以内の5回の反復サイクルを示し、NP材料の光熱応答性を検証している。図3dでは、インキュベーターから取り出し、ホットプレート上に置いてNIR照射した培養培地とNP含有培養培地の時間的温度プロファイルが10分間で約37 ℃で安定し、純NP溶液の温度が24.6 ℃から10分後に33.6 ℃まで上昇した。したがって、NPの光熱機能を考慮し、以降の実験ではNIR照射を10分、30分、60分で実施し、実験セッション中のNPsの堅牢性を維持し、前臨床研究への潜在的適用性を確保した。

光学的および光熱的特性。a 光学吸収スペクトルとb、c キュベット内、d ペトリ皿内でのNIR照射NP溶液のタイムコース温度プロファイル。Ex記号はビーム拡大ケースのプロファイルを示す。（dではNP濃度1.5 mg/mL、光出力密度50 mW/cm²を使用）；cのNIR照射持続時間は1サイクルあたり15分

その後、50 mW/cm²で1時間と2時間照射し、0.5、1、1.5、2 mg/mL濃度のNPsと直接相互作用させることで、NIR照射時間とNP濃度を含む実験パラメータの非毒性線量を決定した。これらは図4a, bに示す。細胞生存率は2時間のNIR照射を通じて95%以上を維持し、980 nm光子への長期曝露に対する細胞の非毒性を確認した。また、1.5 mg/mL未満のNP濃度が非毒性であると決定された。

実験パラメータの細胞毒性アッセイ。HepG2細胞の生存率をa NIR照射時間、b 120 nm NPsの様々な濃度で投与した場合。NPインキュベーション期間は1日；各データポイントの3回実験試行（N=3）の標準偏差を示す

HepG2細胞にほとんどダメージを与えない1.5 mg/mL以下の濃度でがん細胞を投与する目的は、NP固有の毒性の影響なしに光熱線量のがん細胞への影響を調べるためである。NIR照射NPsががん細胞排除の実行可能な解決策となり得るかを検証するため、細胞を1.5 mg/mLのNPsで1日間インキュベートし、その後1時間NIR放射を照射した。図5d-fの明視野（BF）光学像から、曝露時間が1時間（e）または2時間（f）になると細胞数が明確に減少しているのがわかる。定量的には、照射時間が10分から1時間に増加するにつれて生存率が84.2%から58.4%へ単調に減少し、散布データポイント間によく線形トレンドラインがフィットし、照射2時間で生存率20%を予測している。さらに、図5hは1時間照射で、光出力密度が12.5から50 mW/cm²に増加すると生存率が73%から58%へ減少することを示し、NIR照射NPsががん細胞破壊における光熱トリガーとして機能することを確認している。

光熱アッセイ。NP濃度1.5 mg/mLでNIR照射と共に投与したHepG2細胞の生存率。a–c上段とd–f下段のBF光学像のスケールバーはそれぞれ200 μmと100 μm。各データポイントの3回実験試行（N=3）の標準偏差を示す

さらに、このような光熱作用が細胞内か細胞外かという不確実性に対処するため、fNPsを調製し、同じ洗浄とインキュベーション手順を行い、fNPsの細胞内存在を観察した。図6は、fNPsあり（実験群）およびなし（対照群）でインキュベートした細胞の共焦点BF（b, e）および蛍光（a, d）像とそれらの重ね合わせ合成像（c, f）を示す。明らかに、fNPs非インキュベーションの対照細胞は無視できる緑色蛍光を示し、これは主に細胞自己蛍光に起因する。対照的に実験群では、画像内で見つかったすべての細胞質に緑色蛍光の分布が遍在している。対照および実験試料の画像の平均蛍光強度も定量化され、図6gのヒストグラムに示されている。エンドサイトーシスされたfNPsの蛍光は、対照の少なくとも9倍強い。

光学共焦点像。HepG2細胞をfNPsあり（実験群、上段a–c）およびなし（対照群、下段d–f）でインキュベートした場合のa、d 蛍光、b、e BF、c、f 合成光学像を、g 平均蛍光強度のヒストグラムとともに示す。スケールバーは20 μm；レーザー励起波長は488 nm

考察

電磁波を用いた治療的ハイパーサーミアの概念は1900年代初頭にさかのぼり、一部の悪性腫瘍の退縮に成功したが、発熱誘導性抗菌剤の有用性と、関心のある局所腫瘍への精密なアクセスが欠けていたため、衰退した[30]。1980年代になって、ハイパーサーミア治療後に代謝変化、腫瘍微小循環の変化、酸分解など多くの側面が発見され、がん細胞に致死的影響を与えることがいくつかのin vitro研究で明らかになり、関心が再燃した[31]。メカニズムとしては、印加温度が42 ℃を超えるとがん細胞が壊死しアポトーシスが減少する直接的細胞毒性に加え、血流速度の低下に伴う冷却能力の低下と低pH（<6.8）が、がん細胞を加熱に対してより感受性高くし、結果としてより高い細胞殺傷率をもたらす[32,33]。しかし、臨床的には、数世紀にわたる非特異的局在化の欠点により、ハイパーサーミアは化学療法や放射線療法と併用されたときにのみ治療効果が高まることが分かっている[34,35]。

正確な標的化とモニタリングを可能にし、表面電荷、蛍光、光熱変換など幅広い物理的特性を持つNPベース材料は、ハイパーサーミア応用におけるこのような不正確さのニッチにうまく適合する。しかし、多くのNIR照射NP材料ががん細胞研究で有用性を証明しているにもかかわらず、CsWO₃ NPsの場合のように、光曝露の安全限度が十分に検討されていないことが多い。CsWO₃ NPsは、図4bに示すように、Ag、Au、グラフェンなどの一般的なNP材料（それらの閾値は1 μg/mLのオーダー[18,36,37]）と比較して、1.5 mg/mLで比較的低い細胞毒性を示すが、800 nmから2400 nmの波長範囲で強いNIR吸収を持つにもかかわらず、Hela細胞の効果的な破壊には依然として0.7 W/cm²を必要とする[15,25,26]。

本研究は、皮膚組織のNIR曝露限度内で、NP濃度、照射時間、光出力密度の関数として、in vitro HepG2がん細胞に対する効果的なNIR照射トリガー型Cs_0.33WO₃ NPベース熱線量処方を考案することを目的とする。

実験はNPsの合成から始まり、レドックス反応、アニーリングプロセス、ウェットグラインディング法を含む段階的合成手順が図1に概説されている。レドックス反応は、適切な物理環境において、WO₆の八面体構造リングにCsのような大きな三元素を取り込み、特異な結晶構造の形成と金属分子化合物への自由電子の取り込みを可能にし、これがNIR吸収時の強力な光熱変換の本質的理由である[26,27]。また、その後のアニーリングとウェットグラインディングプロセスは、結晶形成を洗練させ、粒子特性サイズを縮小し、NIR光熱変換をさらに向上させる。その後、合成NP溶液は一連の物理的・材料特性評価を経て、平均特性サイズ120 nm（NIR吸収の重要な最適化）を検証し、原子組成を認証した（図2）。さらに、0.5、1、1.5 mg/mLのゼータ電位測定値はそれぞれ-53.2 mV、-54.3 mV、-60.1 mVであった。一般的に、エンドサイトーシスはほとんどのNPタイプの主要な侵入経路であり、非食食細胞に対する陽イオン性およびイオン性NPsの取り込み率は中性実体より高いが、前者の方が後者より優れている[38]。また、多くの先行報告で負電荷NPsが非食食細胞に対して毒性が低いことが分かっており[39,40]、光熱線量に伴う過剰な細胞内NP蓄積を低毒性で考慮する際に有益なメリットである。

HepG2細胞への光熱アッセイのトーンを設定するために、NPsの光熱ヒーターとしての堅牢性、周囲環境と平衡状態にある飽和温度での1時間以上の長期安定性、3時間以内の5連続サイクルでの再現性を実証した（図3b, c）。また、周囲温度（公称25 ℃）の影響を除外してNPのハイパーサーミア自体のがん細胞投与効果を定量化するため、ホットプレートを37 ℃に設定し、すべての細胞アッセイをその上で実施することで実験装置を校正し、純培養培地とNP含有培養培地の時間的光熱特性が37.1 ℃で維持されることを確認した（図3d）。その後、照射時間とNP濃度に対する細胞毒性の依存性を別々に調べ、図4に示すように、2時間以上のNIR照射と1.5 mg/mLでは5%未満の細胞死であり、1.5 mg/mLが致死濃度への転換点であることを示した。NP濃度を1.5 mg/mLに固定し（以降の光熱アッセイ全体で使用）、医療ハイパーサーミアの熱線量を可変投与時間と光出力密度の関数として定義した。図5は、NIR照射を0、1、2時間実施したときの低倍率（a-c）と高倍率（d-f）での細胞殺傷作用を示し、見かけ上の細胞数減少が図5gの細胞生存率定量解析とよく一致し、線形トレンドラインが2時間照射で80%の細胞死を予測している。同様に、増分光出力密度による細胞生存率低下も図5hで実証されている。最後に、図6のBF、蛍光、重ね合わせ合成像（蛍光分析ヒストグラム提示）で明確に描写されているように、fNPsのエンドサイトーシスが検証された。

結論

要約すると、本研究はCs_0.33WO₃ NPsの材料合成と特性評価、直接NPs相互作用のin vitro細胞毒性アッセイ、およびNIR照射との併用アッセイを提示し、NPsのエンドサイトーシスとHepG2がん細胞破壊におけるNIR照射NPsの有効性を証明した。さらに、本研究はHepG2がん細胞に対するNIR照射Cs_0.33WO₃ NPs溶液の組み合わせ線量を提案する：NP濃度1.5 mg/mL、照射時間30分〜1時間、NIR照射光出力密度50 mW/cm²未満。これは皮膚組織のNIR曝露安全限度を大きく下回り、がん細胞死亡率を40%近くまで達成可能であり、患者に優しい個別化医療の開発に潜在的に適用可能である。臨床現場でのこのような研究には、特定のがん細胞タイプの表面受容体を認識する分子による表面修飾などの追加対策が必要となるだろう。