敗血症検出におけるインターロイキン3用の縦方向ゼオライト-酸化鉄ナノコンポジット堆積容量バイオセンサー

はじめに

敗血症は、体が感染症にひどく反応したときに発生する致命的な状態です[1]。敗血症の発作により、体は「サイトカイン」と呼ばれる高レベルのシグナル伝達生体分子を生成し、免疫細胞を引き付けます。これらの細胞の数が増えると、より多くのサイトカインを分泌し、サイトカインストームはより多くの免疫細胞を動員します。最初の感染を制御する代わりに、免疫因子は体の臓器や組織を攻撃します。さらに、この感染症は全身で連鎖反応を引き起こし、臓器不全や組織損傷を引き起こします[2]。特に、敗血症は肺、皮膚、尿路、胃腸管で始まり、広く広がります。

他の臓器に、それは臓器の損傷につながります。したがって、他の臓器への攻撃を防ぐために、プロセスを早期に停止する必要があります。適切なバイオマーカーを使用した初期段階の敗血症の識別は、患者に迅速な治療を提供し、命を救うのに役立ちます。研究者らは、インターロイキン-3（IL-3）炎症性因子が、Toll様受容体の活性化に続く先天性応答活性化因子（IRA）B細胞によって引き起こされる敗血症の発作と死の独立した予測因子であることを発見しました。さらに、より高いレベルのIL-3が敗血症患者のより高い死亡率と関連していることが見出され、IL-3が敗血症中の免疫調節およびコルチコステロイドに対するより高い応答において主要な役割を果たすことが確認された。この研究は、ゼオライト-酸化鉄（ゼオライト-鉄）ナノコンポジットで修飾された静電容量電気化学センサーを使用して、IL-3のレベルを定量化することを目的としています。

バイオセンサーによる生体分子の検出は、トランスデューサーの電極表面へのターゲットまたは検出分子の固定化に大きく依存しています[3]。適切な方向で固定化されたキャプチャプローブの数が多いほど、ターゲットの検出限界が低くなります[4]。ほとんどの場合、キャプチャプローブの固定化は、物理吸着、静電相互作用、共有結合、およびポリマーとの生体分子の捕捉によって行われます[5、6]。上記の固定化方法では、固定化された生体分子の再現性と生体適合性を実現することが難しい場合があります。特に、RNA、DNA、アプタマー、ペプチドなどの小さな捕捉分子のセンシング表面への付着は複雑です[7、8]。さまざまな研究者が、効率的な固定化のためにさまざまな手法を使用しています。最近、ナノ材料は、センシング表面への生体分子の固定化のプロセスでの使用に非常に魅力的です[9、10、11]。金ナノ粒子は、ポリスチレンELISA基板やアルミニウム電極などのさまざまな検出面に効率的に固定化されており、抗体、タンパク質、DNA、アプタマーなどの潜在的な分子を捕捉しています。シリカに加えて、アルミニウムとグラフェンは生体分子の固定化に一般的に使用される材料です。これらのナノ材料は、捕捉分子の数を改善し、検出表面上の生体分子の生体適合性と安定性をもたらし、検出戦略の改善に役立ちます。最近、ゼオライト、粘土、ゾルゲルなどの無機材料がこれらの問題を解決するために研究者の注目を集めています。さらに、より環境に優しいアプローチによるナノマテリアルの合成は、危険物を含まない、より安価であるなどの大きな関連する利点のために非常に奨励されています[12、13、14、15]。さらに、調整されたアプローチを使用して、ナノ材料の望ましいサイズと形状を実現することができます。現在の研究はこのアプローチに沿っており、孤立した鉄と組み合わせてナノコンポジットを作成するゼオライトナノ材料を製造しました。

ゼオライトは、TO ₄ で構成される結晶性ミクロポーラスアルミノケイ酸塩です。 四面体とO原子[16]。それは、そのより大きな表面積、イオン交換の能力、制御可能な疎水性/親水性、および高い機械的および熱的伝導性のために、生体分子の固定化のための有望な材料です。そのため、生体分子固定化プロセスにゼオライト材料を使用したバイオセンサー分野のさまざまな研究が確立され、グルコースセンサーや尿素センサーなどのバイオセンサーを開発するための検出下限に達しました[17、18、19]。同様に、鉄ナノ材料は陽イオン交換特性の効果を改善し、生体分子との相互作用の際の電流変化に迅速に応答します。この研究で使用された独自の組成のゼオライト-酸化鉄ナノコンポジットは、センサーの高性能を向上させ、導電率の向上により感度をさらに向上させます。この研究は、炭鉱のフライアッシュから抽出されたゼオライト-鉄ナノ材料に焦点を当て、それらを静電容量電極の基板として利用して、抗IL-3抗体である捕捉プローブを固定しました。さまざまなインターロイキンの以前のナノマテリアルを介した検出と比較して[20、21、22]、現在のセンシングシステムはいくつかの方法で改善を提供します。たとえば、電気化学センサーへの適合性が高いため、必要な実験手順が少なくて済み、表面の化学的機能化への適合性と高い非汚染性を示します。

静電容量式バイオセンサーは、電極表面で相互作用するプローブとターゲットの間の引力を記録することによって作成された電気化学センサーです。容量性バイオセンサーは、ターゲット生体分子が検出面に固定化されたプローブと結合しているときに、電極界面の誘電体層の変化を測定するのに役立ちます[23]。電極と電解質の間の静電容量は C で表されます =（2 nε ₀ εA ）/ d 、ここでε ：誘電率、 A ：プレートの表面積、ε ₀ ：自由空間の誘電率、 n ：繰り返しの指の数、および d ：絶縁層の厚さ[24、25]。非ファラデー容量性バイオセンサーは、金属化によって引き起こされるタンパク質の変性を回避し、ターゲットとプローブの結合の相互作用を改善するのに役立ちます[26、27]。さまざまな研究が容量性バイオセンサーを利用して、ヌクレオチド、重金属、タンパク質、有機分子などのさまざまな標的分子を特定しています[23、28、29、30、31]。この研究では、ゼオライト-鉄で修飾された電極表面で非ファラデー静電容量バイオセンサー実験を実施しました。ゼオライト-鉄はアミンリンカーとして（3-アミノプロピル）-トリメトキシシランを介して静電容量電極に付着し、次に抗IL-3はアミン表面とカルボン酸（COOH）基の間の引力を介して表面に付着しました。抗体。抗IL-3抗体修飾電極を使用して、IL-3を定量化し、敗血症の発作を診断しました。

材料と方法

装置と試薬

フライアッシュはインドの火力発電所から受け取った。水酸化ナトリウムと硫酸はSigmaAldrich（Missouri、USA）から購入しました。 （3-アミノプロピル）-トリメトキシシラン（APTMS）は、Merck（NJ、USA）から入手しました。ワットマン濾紙はThermoFisher Scientific（マサチューセッツ、米国）から入手しました。 IL-3および抗IL-3抗体は、Santa Cruz Biotechnology（Texas、USA）から入手しました。電界放出型走査電子顕微鏡法（FESEM;日立、S-4300 SE、日本）および電界放出型透過型電子顕微鏡法（FETEM; JEM-2100F、JEOL、日本）を使用して、前述の方法でゼオライト-鉄ナノ材料を分析しました[ 32]。

ゼオライト-鉄ナノ材料の合成

ゼオライト-鉄ナノ材料は、フライアッシュから抽出された鉄、シリカ、およびアルミナを使用して合成されました。この手順には、次の3つの主要なステップが含まれていました。（1）鉄粒子の分離。 （2）アルミノケイ酸ナトリウムの抽出; （3）ゾルゲル合成法によるゼオライト-鉄ナノ粒子の調製。

フライアッシュからの鉄の分離

フライアッシュの25gアリコートを500µLの蒸留水と混合し、マグネチックスターラーを使用して30分間撹拌しました。マグネチックスターラーに付着した鉄粒子を分離した後、分離した粒子1 gを25％硫酸と混合し、50℃で1時間撹拌しました。次に、鉄含有溶液と鉄粒子をワットマン濾紙で分離し、酸化鉄のベースとして利用して、ゼオライト-鉄ナノ材料を合成しました。

フライアッシュからのアルミノケイ酸ナトリウムの抽出

アルカリ抽出法を用いて、アルカリ抽出法によりフライアッシュからアルミノケイ酸ナトリウムを抽出した[33]。まず、25gの鉄で分離したフライアッシュを500µLの2 M水酸化ナトリウムと混合し、100°Cで6時間撹拌しながら加熱しました。溶液を冷却した後、アルミノケイ酸ナトリウム（混合物中の溶液）をワットマン濾紙で分離した。ろ過した溶液をゼオライトを合成するためのベースとして使用しました。

ゾル-ゲル法で合成されたゼオライト-鉄ナノ材料

抽出された鉄とアルミノケイ酸ナトリウムは、ゾルゲル法によってゼオライト-鉄ナノ材料を合成するためのベースとして使用されました。最初のステップでは、pH12のアルミノケイ酸ナトリウム200mLを含むビーカーを、攪拌しながらホットプレートに置きました。次に、溶液をｐＨ７に達するまで少量の鉄溶液を滴下することにより、ｐＨ１の鉄溶液で滴定した。ｐＨ７で、白色ゲルが形成され、このゲルを一晩連続的に攪拌して、均一に分布したゼオライト－鉄ナノ粒子を得た。 。翌日、遠心分離（10,000× g ）によりゲルを分離しました。 10分間）、25％エタノールと蒸留水で洗浄します。最終生成物を100°Cで1時間乾燥させて、ゼオライト-鉄ナノ材料からなる粉末を得ました。ゼオライト-鉄ナノ材料の表面は、FETEMとFESEMによって特徴づけられました。ゼオライト鉄中の元素を特定するために、エネルギー分散型X線（EDX）分析も実施されました。

ゼオライト-鉄のアミン修飾と静電容量電極表面の機能化

アミンは、シランカップリング剤APTMSによってゼオライト-鉄の表面にコーティングされました。このために、1 gのゼオライト-鉄を1％KOHと10分間混合した後、余分なKOHを蒸留水で除去しました。その後、KOH処理したゼオライト-鉄を1％APTMSと混合し、混合物を加熱した攪拌機に一晩置いた。翌日、ナノ材料をエタノールで洗浄し、遠心分離（10,000× g ）によって分離しました。 10分間）。このAPTMS-ゼオライト-鉄は、IL-3を識別するために静電容量電極表面に取り付けられました。この固定化のために、APTMS-ゼオライト-鉄をヒドロキシル化電極に滴下し、RTで3時間維持しました。ゼオライト-酸化鉄ナノコンポジット、APTMS、および検出面の間の結合は、生成された酸化物基とのシランカップリングによるものでした。一般に、シランカップリングは、酸化物グループが利用できる複数のアームで発生し、ゼオライト-酸化鉄ナノコンポジット、APTMS、および検出表面の間に結合を生じます。これらの複数のリンケージにより、検出面に空間配置が形成されます。エタノール、続いて水で表面を洗浄した後、抗IL-3抗体固定化プロセスを実行してIL-3と相互作用させました。

抗IL-3修飾静電容量電極表面でのIL-3の測定

上記の表面は、抗体が付着したときに利用可能なCOOH基との反応を可能にするアミンテザリングによって形成されました。 IL-3は、抗IL-3固定化静電容量電極表面で同定されました。このために、100 pg / mLのIL-3をPBSバッファーで希釈し、抗体修飾電極表面に滴下しました。抗体を固定化した後、残りの非結合表面をPEG-COOH（1 mg / ml）でブロックしました。 PEG-COOHが結合すると、抗体-APTMSと同様の反応が起こります。静電容量値は、IL-3との相互作用の前後に記録されました。 IL-3とその抗体との結合については、値の違いが考慮されました。さらに、検出限界を計算するために、IL-3を3〜50 pg / mLで滴定し、抗体修飾表面に個別に滴下しました。他の実験手順は、前述のように実行されました。各IL-3濃度の静電容量値の差を計算してプロットし、R ² によるIL-3の検出を計算しました。 価値。 IL-3が抗体固定化表面に付着すると、真の相互作用が起こります。

ゼオライト-鉄修飾静電容量電極表面でのIL-3の生物付着と選択的測定

生物付着実験は、非免疫抗体または対照タンパク質の存在およびIL-3抗体の非存在を含む3つの異なる生体分子条件下で実施されました。最初のケースでは、IL-3抗体の代わりに、非免疫抗体が使用されました。 2番目の実験では、IL-3の代わりにコントロールタンパク質を使用しました。最後の実験はIL-3抗体なしで行われました。静電容量値は、IL-3抗体とIL-3の特異的相互作用について比較されました。選択的実験は、ヒト血清の1：100希釈液にIL-3をスパイクし、それを抗IL-3修飾電極表面に滴下することによって実施しました。静電容量の変化を各IL-3濃度について記録し、IL-3の選択的同定を特定しました。再現性は、同じバッチ製造で作られた同様のデバイスで実験を3回（3回）繰り返すことによって確認されました。プローブが固定された表面の寿命と安定性も決定されました。

結果と考察

敗血症は、免疫系で多くの化学物質が放出される状態であり、臓器の最終的な損傷を伴う広範な炎症を引き起こします。図1aは、敗血症に関連する状態を判断するための、抗IL-3修飾静電容量電極表面でのIL-3識別の概略図を示しています。 APTMS修飾ゼオライト-鉄を使用して、捕捉抗体を検出電極表面に付着させた。ゼオライト鉄の表面のAPTMSは、ナノ材料のアミンと電極表面のOH基との相互作用によって電極表面に固定化されました。図1bは、高倍率の顕微鏡で撮影した、静電容量センサーの表面電極の損傷を確認しています。抗体は、COOHとゼオライト-鉄のアミンを介して表面に結合しました。ゼオライト-鉄は、検出電極に多数のAPTMSを付着させるのに役立ち、静電容量電極表面でより多くの抗体を捕捉するのに役立ちます。さまざまな研究により、検出表面へのキャプチャプローブの固定化が、ターゲット分子の検出限界を下げる上で重要な役割を果たすことが示されています。この研究では、ゼオライト-鉄ナノ材料を使用して、抗IL-3抗体を検出電極表面に付着させました。適切な方向で抗IL-3抗体をより高度に固定化すると、IL-3の検出下限に到達するのに役立ちます。

a 抗IL-3修飾静電容量検出面でのIL-3同定の概略図。 APTMS修飾ゼオライト-鉄を使用して捕捉抗体を付着させ、IL-3と相互作用させました。ブロッキング剤としてPEG-COOHを使用した。 b 高倍率顕微鏡による静電容量検出面の形態素解析。 c FESEMによるゼオライト-鉄の形態素解析。ナノ材料は、均一な分布で縦方向に形成されました。 d EDX分析。主な元素であるSi、Al、Fe、Oの存在が見られました。図の挿入図は、低倍率のFESEMによって取得されました

FESEMおよびFETEMによるゼオライト-鉄ナノ材料の形態素解析

図1c、d（挿入図）は、さまざまな倍率でFESEMから得られたゼオライト-鉄ナノ材料の形態学的画像とEDX元素分析を示しています。得られたゼオライト-鉄ナノ材料は滑らかで均一に分布しており、縦方向のナノ構造が密に積み重なっている。このナノ構造のサイズは〜30 nmであり、得られた画像は、ナノコンポジットが均一な形状で配置され、適切な距離に十分に分布していることを示しています。また、FETEM画像は、形成されたゼオライト-鉄ナノコンポジットに対してFESEMによって得られたものと同様の形状を示しました（図2a、b）。 EDXの結果により、合成されたゼオライト-鉄ナノコンポジットにFe、Al、Si、およびOが存在することが確認されました（図2c、d）。 Si、Al、Fe、およびOの主要な元素原子の割合は、それぞれ3.46、0.78、2.13、および24.39％であることがわかりました。このFESEMとEDXの結果は、ゼオライト-鉄ナノ材料の形成を確認しています。

a でのゼオライト-鉄のFETEM画像 50nmスケールおよび b 200nmスケール。ナノ材料は均一な分布で形成されました。 c 主要元素Si、Al、Fe、C、およびOの存在を確認するEDX分析

IL-3測定用の検出電極の準備

静電容量バイオセンサーへの抗IL-3抗体の固定化は、各生体分子の固定化後に静電容量のレベルを変更することによって確認されました。図3aは、ゼオライト-鉄で修飾された表面に抗体が付着する過程での静電容量の変化を示しています。図3aに示すように、KOHでつながれた静電容量電極表面は1.74×10 ⁰⁹ の静電容量値を示します。 nF、およびAPTMS-ゼオライト-鉄の滴下後、2.02×10 ⁰⁹ に増加しました。 nF。この静電容量の増加により、ナノ材料が検出電極に付着していることが確認されました。さらに、抗IL-3抗体を添加すると、静電容量値は3.42×10 ⁰⁹ に大幅に増加しました。 nF。このより高い増加は、APTMS修飾ゼオライト-鉄への抗体固定化の量が多いために認められました。さらに、ナノ材料は、検出電極表面上に多数のAPTMSを備えた適切な配置を示し、最終的にはより多くの抗体を引き付けました。最後に、ブロッキングの目的でPEG-COOHが追加され、静電容量が3.64×10 ⁰⁹ に増加することがわかりました。 nF。センサーは、表面電荷の変化、そして最終的には静電容量の変化に基づいて機能します。表面電荷の変化は、分子の付着/相互作用によって異なります。各分子は異なる電荷を運び、センサーの静電容量に影響を与えます。そのため、静電容量の差を考慮して測定しました。検出電極表面でのIL-3抗体の占有率が高いため、静電容量の変化が大きくなっています（図3b）。 PEG-COOHは、検出電極表面でのIL-3の非特異的結合を減らし、偽陽性の結果を排除するのに役立ちます。さまざまな研究により、検知面のPEGベースのポリマーは生体適合性を改善し、信号対雑音比を低下させ、検知面に固定化された生体分子の適切な配向を提供し、センサーの検出限界を下げることが証明されています[34,35、 36,37]。 APTMS表面は他の生体分子を静電的に引き付けるため、PEG-COOHを使用して、ゼオライト-鉄ナノ材料の余分なAPTMS表面を覆い、生物付着を減らします。この抗IL-3修飾表面は、IL-3を同定するために利用されました。

a ゼオライト-鉄修飾表面への抗体付着のプロセス。静電容量の値は、各分子の固定化後に増加しました。 b 静電容量の違い。抗IL-3抗体の固定化は、静電容量値のより高い変化を示しました。値は、3回の読み取り値を3回使用して平均化されました。 [ゼオライト-IO-ゼオライト-酸化鉄]

抗IL-3抗体表面でのIL-3の測定と定量化

IL-3は、抗IL-3修飾静電容量電極検出面で定量化されました。最初に、高濃度のIL-3（100 pg / mL）が抗体修飾表面でテストされ、静電容量値が3.74×10 ¹⁰ から増加しました。 nFから13×10 ¹⁰ nF。この増加により、IL-3と抗IL-3抗体の相互作用が確認されます（図4a）。同様の実験が、3〜50 pg / mLのIL-3濃度で実施されました。図4bに示すように、静電容量の値は4.56×10 ¹⁰ に増加しました。 nF、5.84×10 ¹⁰ nF、6.64×10 ¹⁰ nF、8.39×10 ¹⁰ nF、および12×10 ¹⁰ nF。 Il-3の濃度が高くなると、静電容量の値が徐々に大きくなることがわかりました（図5a）。静電容量値の差が計算され、Excelシートにプロットされ、IL-3の検出は3 pg / mL、R2値は0.9673と計算されました（図5b）。抗IL-3と相互作用すると、さまざまな濃度のIL-3（3〜100 pg / mL）で線形の用量依存性応答が見られました。ただし、さらに濃度を滴定すると、サンプルは飽和しました。

抗IL-3修飾表面でのIL-3の測定。 a 100 pg / mLのIL-3の同定。 IL-3を滴下した後、静電容量に明らかな変化が見られました。図の挿入図は回路図​​を示しています。 b 抗IL-3抗体への異なるIL-3濃度の滴定。 IL-3のすべての濃度で、静電容量の変化が認められました

a 各IL-3濃度の静電容量値。 IL-3濃度を上げると、静電容量値が徐々に増加します。 b 各IL-3濃度の静電容量値の差。値はExcelシートにプロットされ、IL-3の検出限界は3 pg / mLと計算されました。値は、3回の読み取り値を3回使用して平均化されました

APTES-ゼオライト-鉄修飾静電容量電極の生物付着/非付着

生物付着は、あらゆる種類のバイオセンサーの最大の問題であり、検出面上のターゲットの誤検出につながります。 BSA、エタノールアミン、PEGベースのポリマーなどのブロッキング剤は、センシング表面の生物付着を低減する一般的な分子です。本明細書では、ブロッキング剤としてPEG-COOHを使用し、生物付着効果は、3つの異なる対照実験、すなわち、IL-3抗体なし、非免疫抗体あり、および対照タンパク質（IL-8）ありで確認された。図6aに示すように、3つの対照実験はすべて静電容量値を高めることができず、生物付着のないIL-3の特定の同定を示しています。

a IL-3の特異的検出。対照分子は静電容量値の増加を示さず、IL-3の特異的検出を示しています。 b ヒト血清中のIL-3のスパイク。ヒト血清のスパイクは、IL-3濃度の増加とともに静電容量を増加させました。この結果は、IL-3の選択的検出を裏付けています。値は、3回の読み取り値を3回使用して平均化されました

ヒト血清および安定性におけるIL-3のスパイク

異なる濃度のIL-3をヒト血清に添加し、同じ実験手順を行って、実際の状況でIL-3を同定しました。図6bに示すように、ヒト血清中のスパイクされたIL-3は、IL-3の濃度が高くなると、明らかに静電容量値が増加しました。この結果は、抗IL-3修飾静電容量電極による選択的なIL-3同定を裏付けています。

再現性を考慮すると、検出面は最小のエラー値で適切に動作します。製造されたセンシング表面に付着したナノ材料の動作寿命は、デシケーターに適切に保管することで3か月延長できます。ただし、プローブを取り付けた後、表面は2週間安定しており、安定性の19％を失う傾向があり、安定性の喪失は3週目から急激になりました。現在のセンサーの高性能を証明するために、現在利用可能なセンサーとの比較研究が行われ、その結果は、いくつかの例で同等であり、より良い動作をすることを示しています（表1）。

結論

敗血症は生命を脅かし、圧倒的な免疫反応を伴い、非常に危険であり、全身に影響を及ぼします。この研究は、静電容量電極上の敗血症バイオマーカー（IL-3）の同定を実証しました。ゼオライト-鉄ナノ材料は、生体分子が感知電極に結合する際の電流の流れを増加させるために、石炭フライで修飾された静電容量電極から抽出されました。ゼオライト-鉄に抗IL-3抗体を結合させるためにアミン修飾を行った。 IL-3の検出は抗体修飾電極で行われ、IL-3の検出限界である3 pg / mLに達しました。さらなる対照実験は、静電容量値の増加を示すことができず、IL-3の特異的検出を確認し、ヒト血清中のスパイクされたIL-3を用いた選択的実験は、静電容量の明らかな増加を示した。この実験方法は、IL-3レベルを定量化し、敗血症発作の診断に役立ちます。

データと資料の可用性

すべてのデータは制限なしで完全に利用可能です。

略語

IL-3：

インターロイキン-3

pg：

ピコグラム

mL：

ミリリットル

µL：

マイクロリットル

M：

モル

FESEM：

電界放出型透過型電子顕微鏡

FETEM：

電界放出型走査電子顕微鏡

EDX：

エネルギー分散型X線

IRA：

先天性応答活性化因子

COOH：

カルボン酸

DNA：

デオキシリボース核酸

RNA：

リボース核酸

ELISA：

酵素免疫測定法

APTMS：

（3-アミノプロピル）-トリメトキシシラン

KOH：

水酸化カリウム

PEG：

ポリエチレングリコール