ゼオライト-酸化鉄ナノコンポジット容量型バイオセンサによる迅速IL-3敗血症検出

概要

敗血症は、重度の微生物感染に対する身体の過剰反応により引き起こされる極めて深刻な状態であり、致死的かつ生命を脅かす問題を引き起こします。感染と戦うため免疫系から血流に化学物質が放出されることで敗血症が生じ、炎症を引き起こし医療上の緊急事態となります。石炭火力発電所のフライアッシュから抽出された複合縦長ゼオライトと酸化鉄ナノコンポジットを用いて、容量型バイオセンサの表面特性を改善し、敗血症発作を特定しました。抗インターロイキン-3（抗IL-3）抗体をアミンリンカーを介してゼオライト-酸化鉄複合容量電極表面に固定化し、敗血症バイオマーカーであるIL-3と相互作用させました。ナノコンポジットの形態と化学組成はFESEM、FETEM、EDX解析で調べました。約30 nmの縦長ゼオライト-酸化鉄ナノコンポジットにより、線形曲線上でIL-3検出限界3 pg/mL（回帰係数R² = 0.9673、y = 1.638x - 1.1847）を達成しました。ナノ材料による抗体固定化量の増加と表面電流の改善により、用量依存範囲（3-100 pg/mL）でより低い検出限界が得られました。さらに、関連生体分子を用いた対照実験では容量変化が見られず、ヒト血清中のスパイクIL-3で容量増加が観察されたことから、IL-3の特異的かつ選択的な検出が確認されました。本研究は、IL-3を特定・定量する潜在的に有用な方法を示し、敗血症発作の診断に貢献します。

はじめに

敗血症は、身体が感染に対して過剰に反応したときに発生する致死的な状態です。敗血症発作により、体内で「サイトカイン」と呼ばれるシグナル伝達生体分子のレベルが上昇し、免疫細胞を引き寄せます。これらの細胞が増加するとさらに多くのサイトカインが分泌され、サイトカインストームがより多くの免疫細胞を動員します。初期感染を制御する代わりに、免疫因子が身体の臓器と組織を攻撃します。さらに、この感染は全身で連鎖反応を引き起こし、臓器不全と組織損傷をもたらします。特に、敗血症は肺、皮膚、尿路、消化管で始まり、他の臓器に広がって臓器障害を引き起こします。したがって、このプロセスを早期に阻止して他の臓器への攻撃を防ぐことが必要です。適切なバイオマーカーによる敗血症の早期特定は、患者への迅速な治療を可能にし、命を救うのに役立ちます。研究者たちは、インターロイキン-3（IL-3）炎症因子が、Toll様受容体活性化に続く自然免疫応答活性化（IRA）B細胞によって産生される敗血症発作と死亡の独立した予測因子であることを発見しました。さらに、IL-3の高レベルが敗血症患者の高い死亡率と関連し、IL-3が敗血症時の免疫調節とコルチコステロイドへの高反応性において主要な役割を果たすことが確認されました。本研究は、ゼオライト-酸化鉄（ゼオライト-鉄）ナノコンポジット修飾容量型電気化学センサを用いてIL-3レベルを定量することを目的としました。

バイオセンサによる生体分子検出は、標的または検出分子のトランスデューサ電極表面への固定化に大きく依存します。適切な配向でより多くの捕捉プローブが固定化されるほど、標的検出限界は低くなります。ほとんどの場合、捕捉プローブ固定化は物理吸着、静電相互作用、共有結合、ポリマーによる生体分子捕捉で行われてきました。しかし、これらの固定化法では固定化生体分子の再現性と生体適合性の達成が困難な場合があります。特に、RNA、DNA、アプタマー、ペプチドなどの小さな捕捉分子をセンシング表面に固定化することは複雑です。様々な研究者が効率的な固定化のために異なる技術を用いてきました。最近、ナノ材料がセンシング表面での生体分子固定化プロセスに非常に魅力的です。金ナノ粒子はポリスチレンELISA基板やアルミニウム電極など様々なセンシング表面に効率的に固定化され、抗体、タンパク質、DNA、アプタマーなどの標的分子を捕捉してきました。シリカ、アルミニウム、グラフェンも生体分子固定化に一般的に用いられる材料です。これらのナノ材料は捕捉分子の数を増やし、センシング表面での生体分子の生体適合性と安定性を向上させ、検出戦略の改善に役立ちます。最近、ゼオライト、粘土、ゾルゲルなどの無機材料がこれらの問題解決のために研究者の注目を集めています。さらに、グリーンアプローチによるナノ材料合成は、有害物質を使用せず低コストという大きな利点から強く推奨されています。また、調整されたアプローチでナノ材料の望ましいサイズと形状を実現できます。本研究はこのアプローチに沿って、ゼオライトナノ材料と単離鉄を組み合わせたナノコンポジットを作製しました。

ゼオライトは、TO₄四面体とO原子で構成される結晶性ミクロポーラスアルミノシリケートです。大きな表面積、イオン交換能力、制御可能な疎水性/親水性、高い機械的・熱的伝導性により、生体分子固定化に有望な材料です。したがって、生体分子固定化プロセスにゼオライト材料を用いたバイオセンサ分野の様々な研究が確立され、グルコースセンサや尿素センサなどのバイオセンサ開発でより低い検出限界に到達しています。同様に、鉄ナノ材料は陽イオン交換特性の効果を高め、生体分子との相互作用による電流変化に迅速に応答します。本研究で使用した独自の組成を持つゼオライト-酸化鉄ナノコンポジットは、導電性の改善によりセンサの高性能をさらに向上させ、感度向上をもたらします。本研究では、石炭フライアッシュから抽出したゼオライト-鉄ナノ材料を容量電極の基板として利用し、捕捉プローブである抗IL-3抗体を固定化しました。以前のナノ材料を介した異なるインターロイキン検出と比較して、現在のセンシングシステムはいくつかの点で改善を提供します。例えば、電気化学センサにより適しており実験手順が少なく、表面化学修飾に適し、高い非ファウリング能力を示します。

容量型バイオセンサは、電極表面でプローブと標的の相互作用による引力を検出することで作られる電気化学センサです。標的生体分子がセンシング表面の固定化プローブと結合するとき、電極界面の誘電体層の変化を測定するのに役立ちます。電極と電解質間の容量はC = (2nε₀εA)/dで表されます（ε：誘電率、A：プレート表面積、ε₀：真空の誘電率、n：繰り返しフィンガー数、d：絶縁層厚）。非ファラデー容量型バイオセンサは、金属化によるタンパク質変性を回避し、標的とプローブの結合相互作用を改善します。様々な研究で、ヌクレオチド、重金属、タンパク質、有機分子など様々な標的分子の特定に容量型バイオセンサが利用されてきました。本研究では、ゼオライト-鉄修飾電極表面で非ファラデー容量型バイオセンサ実験を行いました。ゼオライト-鉄を(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン（APTMS）をアミンリンカーとして容量電極に固定化し、抗体のカルボキシル（COOH）基とアミン表面の引力で抗IL-3を表面に固定化しました。抗IL-3抗体修飾電極を用いてIL-3を定量し、敗血症発作を診断しました。

材料と方法

装置と試薬

フライアッシュはインドの火力発電所から入手しました。水酸化ナトリウムと硫酸はSigma Aldrich（米国ミズーリ州）から購入。(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン（APTMS）はMerck（米国ニュージャージー州）から入手。濾紙はThermo Fisher Scientific（米国マサチューセッツ州）から入手。IL-3と抗IL-3抗体はSanta Cruz Biotechnology（米国テキサス州）から入手。電界放出型走査電子顕微鏡（FESEM；Hitachi、S-4300 SE、日本）と電界放出型透過電子顕微鏡（FETEM；JEM-2100F、JEOL、日本）を用いて、以前の方法に従いゼオライト-鉄ナノ材料を解析しました。

ゼオライト-鉄ナノ材料の合成

ゼオライト-鉄ナノ材料は、フライアッシュから抽出した鉄、シリカ、アルミナを用いて合成しました。以下の3つの主要ステップを含みます：(1) 鉄粒子の分離、(2) ナトリウムアルミノシリケートの抽出、(3) ゾルゲル法によるゼオライト-鉄ナノ粒子の調製。

フライアッシュからの鉄分離

フライアッシュ25 gを蒸留水500 µLと混合し、磁気攪拌子で30分間攪拌しました。磁気攪拌子に付着した鉄粒子を分離し、分離粒子1 gを25%硫酸と混合し、50 °Cで1時間攪拌しました。その後、濾紙で鉄含有溶液と鉄粒子を分離し、ゼオライト-鉄ナノ材料合成のための酸化鉄ベースとして利用しました。

フライアッシュからのナトリウムアルミノシリケート抽出

アルカリ抽出法でフライアッシュからナトリウムアルミノシリケートを抽出しました。まず、鉄分離済みフライアッシュ25 gを2 M水酸化ナトリウム500 µLと混合し、100 °Cで6時間攪拌加熱しました。溶液冷却後、ナトリウムアルミノシリケート（混合物中の溶液）を濾紙で分離しました。ろ液をゼオライト合成のベースとして使用しました。

ゾルゲル法によるゼオライト-鉄ナノ材料合成

抽出した鉄とナトリウムアルミノシリケートをベースに、ゾルゲル法でゼオライト-鉄ナノ材料を合成しました。第一ステップで、pH 12のナトリウムアルミノシリケート200 mLを含むビーカーをホットプレート上で攪拌下に置きました。次に、pH 1の鉄溶液を滴下しながら滴定し、pH 7まで調整しました。pH 7で白色ゲルが形成され、一晩連続攪拌して均一に分散したゼオライト-鉄ナノ粒子を得ました。翌日、遠心分離（10,000×g、10分）でゲルを分離し、25%エタノールと蒸留水で洗浄しました。最終生成物を100 °Cで1時間乾燥し、ゼオライト-鉄ナノ材料からなる粉末を得ました。ゼオライト-鉄ナノ材料の表面はFETEMとFESEMでキャラクタリゼーションしました。エネルギー分散型X線（EDX）分析も実施し、ゼオライト-鉄中の元素を同定しました。

ゼオライト-鉄のアミン修飾と容量電極表面の機能化

シランカップリング剤APTMSによりゼオライト-鉄表面にアミンをコーティングしました。ゼオライト-鉄1 gを1% KOHと10分間混合し、余分なKOHを蒸留水で除去しました。その後、KOH処理済みゼオライト-鉄を1% APTMSと混合し、加熱攪拌機で一晩反応させました。翌日、エタノールで洗浄し、遠心分離（10,000×g、10分）で分離しました。このAPTMS-ゼオライト-鉄をIL-3特定のために容量電極表面に固定化しました。APTMS-ゼオライト-鉄を水酸基化電極に滴下し、室温で3時間放置しました。ゼオライト-鉄酸化物ナノコンポジット、APTMS、センシング表面の結合は、生成した酸化基とのシランカップリングによるものです。一般にシランカップリングは酸化基に利用可能な複数のアームで起こり、ゼオライト-鉄酸化物ナノコンポジット、APTMS、センシング表面間のリンケージを生成します。これらの複数のリンケージにより、センシング表面上に空間配置が形成されます。エタノールと水で洗浄後、IL-3と相互作用する抗IL-3抗体固定化プロセスを実施しました。

抗IL-3修飾容量電極表面でのIL-3測定

上記表面はアミンテザリングにより形成され、抗体結合時に利用可能なCOOH基と反応します。IL-3を抗IL-3固定化容量電極表面で特定しました。IL-3を100 pg/mLでPBS緩衝液に希釈し、抗体修飾電極表面に滴下しました。抗体固定化後、未結合表面をPEG-COOH（1 mg/ml）でブロッキングしました。PEG-COOH結合時も抗体-APTMSと類似の反応が起こります。IL-3との相互作用前後で容量値を記録しました。値の差をIL-3とその抗体の結合として考慮しました。さらに、検出限界を計算するため、IL-3を3〜50 pg/mLで滴定し、抗体修飾表面に独立して滴下しました。他の実験手順は前述の通りです。各IL-3濃度での容量値の差を計算し、プロットしてR²値でIL-3検出を計算しました。IL-3が抗体固定化表面に結合すると、真の相互作用が起こります。

ゼオライト-鉄修飾容量電極表面でのバイオファウリングとIL-3選択的測定

3つの異なる生体分子条件（非免疫抗体またはコントロールタンパク質の存在、IL-3抗体の不在）でバイオファウリング実験を行いました。第一に、IL-3抗体の代わりに非免疫抗体を使用；第二に、IL-3の代わりにコントロールタンパク質を使用；第三に、IL-3抗体なしで実施。IL-3抗体とIL-3の特異的相互作用のために容量値を比較しました。選択性実験は、ヒト血清1:100希釈液にIL-3をスパイクし、抗IL-3修飾電極表面に滴下して行いました。各IL-3濃度での容量変化を記録し、IL-3の選択的特定を確認しました。再現性は、同一バッチ製造の類似デバイスで3回繰り返し（三重測定）実験を行って確認しました。プローブ固定化表面の保存寿命と安定性も測定しました。

結果と考察

敗血症は免疫系で多くの化学物質が放出され、広範な炎症を引き起こし、最終的には臓器損傷に至る状態です。図1aは、敗血症に関連する状態の判定のため、抗IL-3修飾容量電極表面でのIL-3特定の概略図を示します。APTMS修飾ゼオライト-鉄を用いて捕捉抗体をセンシング電極表面に固定化しました。ゼオライト-鉄表面のAPTMSは、ナノ材料上のアミンと電極表面のOH基の相互作用で電極表面に固定化されました。抗体はゼオライト-鉄のCOOHとアミンを介して表面に連結されました。ゼオライト-鉄はセンシング電極上により多くのAPTMSを固定化するのを助け、結果として容量電極表面により多くの抗体を捕捉します。様々な研究で、センシング表面での捕捉プローブ固定化が標的分子の検出限界低減に重要な役割を果たすことが示されています。本研究では、ゼオライト-鉄ナノ材料を用いて抗IL-3抗体をセンシング電極表面に固定化しました。適切な配向でのより多くの抗IL-3抗体固定化が、IL-3のより低い検出限界達成に役立ちます。

FESEMとFETEMによるゼオライト-鉄ナノ材料の形態解析

図1c、d（インセット）は、異なる倍率でFESEMにより得られたゼオライト-鉄ナノ材料の形態像とEDX元素分析を示します。得られたゼオライト-鉄ナノ材料は滑らかで均一に分布し、密に積層した縦長ナノ構造を持ちます。このナノ構造のサイズは約30 nmで、ナノコンポジットが均一な形状で適切な距離に良く分布していることがわかります。FETEM像も、形成されたゼオライト-鉄ナノコンポジットについてFESEMと類似の形状を証明しています（図2a、b）。EDX結果は、合成ゼオライト-鉄ナノコンポジットにFe、Al、Si、Oが存在することを確認しました（図2c、d）。Si、Al、Fe、Oの主要元素原子パーセントはそれぞれ3.46%、0.78%、2.13%、24.39%でした。このFESEMとEDX結果はゼオライト-鉄ナノ材料の形成を確認しています。

IL-3測定のためのセンシング電極調製

抗IL-3抗体の容量バイオセンサへの固定化は、各生体分子固定化後の容量レベル変化で確認しました。図3aは、抗体がゼオライト-鉄修飾表面に固定化される過程での容量変化を示します。図3aに示す通り、KOHテザリング容量電極表面の容量値は1.74 × 10⁹ nFで、APTMS-ゼオライト-鉄を滴下後2.02 × 10⁹ nFに増加しました。この容量増加はナノ材料のセンシング電極への固定化を確認します。さらに、抗IL-3抗体添加で容量値が3.42 × 10⁹ nFに劇的に増加しました。この大きな増加は、APTMS修飾ゼオライト-鉄上により多くの抗体が固定化されたためです。また、ナノ材料がセンシング電極表面上でより多くのAPTMSとともに適切に配列し、最終的により多くの抗体を引き付けました。最後にブロッキング目的でPEG-COOHを添加し、容量は3.64 × 10⁹ nFに増加しました。センサは表面電荷の変化、最終的に容量の変化に基づいて動作します。表面電荷変化は分子固定化/相互作用に応じて変化します。各分子は異なる電荷を持ち、センサの容量に影響を与えます。したがって、容量の差を測定に用いました。センシング電極表面でのIL-3抗体の高い占有率により、より大きな容量変化が観察されました（図3b）。PEG-COOHは、センシング電極表面でのIL-3の非特異的結合を減らし、偽陽性結果を排除します。様々な研究で、センシング表面のPEGベースポリマーが生体適合性を改善し、信号対雑音比を低減し、固定化生体分子の適切な配向を提供し、センサの検出限界低減につながることが証明されています。APTMS表面が他の生体分子を静電的に引き付けるため、PEG-COOHでゼオライト-鉄ナノ材料上の過剰APTMS表面を覆い、バイオファウリングを低減しました。この抗IL-3修飾表面を用いてIL-3を特定しました。

抗IL-3抗体表面でのIL-3測定と定量

IL-3を抗IL-3修飾容量電極センシング表面で定量しました。最初に高濃度IL-3（100 pg/mL）を抗体修飾表面で試験し、容量値が3.74 × 10¹⁰ nFから13 × 10¹⁰ nFに増加しました。この増加はIL-3と抗IL-3抗体の相互作用を確認します（図4a）。同様の実験をIL-3濃度3〜50 pg/mLで行いました。図4bに示す通り、容量値は4.56 × 10¹⁰ nF、5.84 × 10¹⁰ nF、6.64 × 10¹⁰ nF、8.39 × 10¹⁰ nF、12 × 10¹⁰ nFに増加しました。IL-3濃度増加に伴い容量値が徐々に増加することが確認されました（図5a）。各IL-3濃度での容量値の差を計算し、Excelシートにプロットし、IL-3検出をR²値0.9673で3 pg/mLとして計算しました（図5b）。抗IL-3と相互作用する異なる濃度のIL-3（3-100 pg/mL）で線形用量依存応答が見られました。しかし、さらに高濃度で滴定すると試料は飽和しました。

APTES-ゼオライト-鉄修飾容量電極でのバイオファウリング/非ファウリング

バイオファウリングはあらゆる種類のバイオセンサで最大の問題であり、センシング表面での標的の偽陽性特定を引き起こします。BSA、エタノールアミン、PEGベースポリマーなどのブロッキング剤は、センシング表面でのバイオファウリングを減らす一般的な分子です。本研究ではPEG-COOHをブロッキング剤として用い、3つの異なる対照実験（IL-3抗体なし、非免疫抗体あり、コントロールタンパク質（IL-8）あり）でバイオファウリング効果を確認しました。図6aに示す通り、全3つの対照実験で容量値の増加が見られず、バイオファウリングなしでIL-3の特異的検出が確認されました。

ヒト血清中のIL-3スパイクと安定性

異なる濃度のIL-3をヒト血清にスパイクし、同じ実験手順で実験を行い、実生活でのIL-3特定を確認しました。図6bに示す通り、ヒト血清中のスパイクIL-3は、IL-3濃度増加とともに明確に容量値を増加させました。この結果は、抗IL-3修飾容量電極による選択的IL-3特定を確認します。

再現性を考慮すると、センシング表面は最小誤差値で良好に振る舞います。製造センシング表面固定ナノ材料の動作寿命は、デシケーター内での適切な保存で3ヶ月間延長可能です。しかし、プローブ固定化後、表面は2週間安定でしたが19%の安定性低下傾向があり、3週目から急激に安定性低下が始まりました。現在利用可能なセンサとの比較研究を行い、高性能を証明しました。結果は、いくつかの点で同等またはより良好に振る舞うことを示しています（表1）。

結論

敗血症は生命を脅かし、圧倒的な免疫反応を伴い、極めて危険で全身に影響を及ぼします。本研究は、容量電極上での敗血症バイオマーカー（IL-3）の特定を実証しました。石炭フライアッシュ修飾容量電極から抽出したゼオライト-鉄ナノ材料を用いて、生体分子のセンシング電極結合時の電流流れを増加させました。アミン修飾により抗IL-3抗体をゼオライト-鉄に固定化しました。抗体修飾電極でIL-3検出を行い、IL-3検出限界3 pg/mLに到達しました。更なる対照実験で容量値増加が見られず、IL-3の特異的検出が確認され、ヒト血清中のスパイクIL-3選択実験で明確な容量増加が示されました。この実験手法はIL-3レベルを定量し、敗血症発作の診断に役立ちます。

データと材料の入手可能性

すべてのデータは制限なく完全に入手可能です。

略語

IL-3:

インターロイキン-3

pg:

ピコグラム

mL:

ミリリットル

µL:

マイクロリットル

M:

モル

FESEM:

電界放出型走査電子顕微鏡

FETEM:

電界放出型透過電子顕微鏡

EDX:

エネルギー分散型X線

IRA:

自然免疫応答活性化

COOH:

カルボキシル基

DNA:

デオキシリボ核酸

RNA:

リボ核酸

ELISA:

酵素免疫測定法

APTMS:

(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン

KOH:

水酸化カリウム

PEG:

ポリエチレングリコール