子宮頸がんにおける抗がん効果を高めるための葉酸受容体を標的としたバイオフラボノイドゲニステインをロードしたキトサンナノ粒子

背景

ヒト子宮頸がんは、主にヒトパピローマウイルス（HPV）に起因する、世界中の女性の生殖年齢で人気のあるがんの1つです[1]。 「国際がん研究機関」は、子宮頸がんの背後にある主な原因として、免疫防御の低下、喫煙、および不規則な性的活動を挙げています[2]。医療技術と診断の最新の進歩は、子宮頸がんの死亡率の低下に大きな影響を及ぼします。それにもかかわらず、このクラスの癌は、中国などの発展途上国で依然として増加しています。子宮頸がんの治療のために、2つの予防的HPVワクチン（GardasilとCervarix）が販売されています。しかし、それは成人患者にのみ有効性を示し、患者全体を応援することはできませんでした[3、4]。したがって、化学療法、手術、放射線療法などの治療オプションが定期的に使用されます。しかし、子宮頸がんの治療に効果的なものはありません。化学療法剤または他の小分子は、特異的に送達された場合、癌治療効率を改善することが報告されています[5]。

最近、化学療法薬に比べて毒性が低いことが知られているため、天然化合物が癌の治療において大きな注目を集めています[6]。特に、多くの植物に存在するフラボノイドは、抗炎症作用と抗癌作用を持っていると報告されています。ゲニステイン（4 '、5,7-トリヒドロキシイソフラボン）（GEN）は、その強力な抗癌特性のために注目を集めている潜在的に効果的な大豆イソフラボンです[7、8]。研究により、GENはプロテインチロシンキナーゼとNF-κBを阻害し、G2 / M期で細胞周期を停止させることが明らかになりました。これは、細胞増殖と癌細胞増殖に関連する遺伝子のダウンレギュレーションにつながります[9、10]。 G2 / M期停止は、癌細胞の遊走、浸潤を抑制し、細胞アポトーシスと細胞死を誘発します[11]。ただし、GENの臨床的可能性は、溶解度が制限されており（〜1.45μg / ml）、バイオアベイラビリティが制限されているために妨げられていました[12]。したがって、GENの物理化学的特性とその抗癌特性を改善する緊急の必要性があります。

ナノテクノロジーの医学への応用は、さまざまな小分子の抗癌特性を改善する能力があるため、ますます注目を集めています[13]。ナノ粒子への薬物のカプセル化は、高い安定性、強化された薬物負荷、より高い内在化、好ましい生体内分布、および改善された薬物動態などの多くの利点を提供します[14]。重要なことに、ナノ粒子は、腫瘍組織に優先的に蓄積することにより、カプセル化された化合物の抗癌効果を高めます。また、ナノ粒子は腫瘍細胞の多剤耐性（MDR）を逆転させる可能性があります[15、16]。本研究では、その優れた生分解性と生体適合性プロファイルのために、天然由来のキトサンナノ粒子を採用しました。さらに、キトサンの第一級アミン基は、水溶性や血液適合性などのいくつかの重要な特性を提供します。また、アミン基を使用してナノ粒子の表面を変化させることもできます[17]。ターゲットの特異性を高めるために、キトサンナノ粒子の表面に葉酸を結合させました。葉酸は、子宮頸がん細胞で過剰発現しているため、ターゲティングリガンドとして選択されました。葉酸受容体は、子宮頸がん細胞に多数または多数存在します。具体的には、FRs-αは正常細胞にも存在しますが、血液循環にさらされていませんが、癌細胞の場合は血液循環に非常にさらされているため、エンドサイトーシスを介して内在化される可能性のある葉酸結合ナノ粒子の魅力的なターゲットになりますメカニズム[18、19]。

本研究では、主に、FA結合キトサンナノ粒子にカプセル化することにより、FR-α過剰発現HeLa子宮頸がん細胞に対するGENの抗がん特性を高めることを目的としました。ナノ粒子は、粒子サイズ、形状、およびinvitro放出動態の観点から特徴づけられました。 FAのターゲティング効果は、HeLa癌細胞における細胞取り込みアッセイによって研究されました。 GENおよびGENをロードしたナノ粒子の抗癌効果は、細胞毒性アッセイ、生/死アッセイ、およびアポトーシス分析によって研究されました。

メソッド

資料

ゲニステインはアラジンケミカルズ（上海、中華人民共和国）から購入しました。葉酸であるキトサン（85％脱アセチル化）は、中国のSigma-Aldrichから購入しました。 EDCとNHSは、中国のSigma-Aldrichからも購入しました。他のすべての化学物質は試薬グレードであり、変更なしで使用されます。

GENをロードした葉酸結合キトサンナノ粒子の調製

ナノ粒子を調製する前に、葉酸キトサンコンジュゲートを調製しました。簡単に説明すると、44.1 mgの葉酸を1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDAC.HCl）とN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）の混合物（モル比1：1.5：1.5）とともにDMSOに溶解しました。 ）。混合物を30分間撹拌して、官能基を活性化しました。有機溶液を、連続的に攪拌しながらキトサン溶液（０．５％ｗ ／ ｗ）に滴下して加えた。暗所で一晩撹拌を続けた。 1 Mの水酸化ナトリウムを加えることにより、pHをpH8に調整しました。最後に、混合物を遠心分離して黄色の沈殿物を分離し、炭酸ナトリウムで洗浄し、次に水で再度透析した。

ナノ粒子を調製するために、GEN、キトサン、およびキトサン-FAコンジュゲート（10：1）をDMSOに溶解しました。次に、DMSO溶液を連続的に攪拌しながら0.5％Tween80溶液に滴下した。混合物を3時間撹拌し、すべての溶媒が蒸発した後、懸濁液を4°C、10,000rpmで30分間スピンダウンしました。上澄みを除去し、HPLC法で評価した。サンプルは、25°Cで逆相C-18カラムを使用して、HPLC（LC 1100、Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ）で定量しました。メタノール/水の移動相（60/40、 v / v）を1 ml / minの流速で移動相として使用しました。

粒子サイズと表面形態分析

ナノ粒子の粒子サイズとサイズ分布は、Malvern Mastersizer 2000（Zetasizer Nano ZS90、Malvern Instruments Ltd.、英国）によって観察されました。分析前にサンプルを適切に希釈しました。すべての測定は3回行った。

ナノ粒子の表面形態は、透過型電子顕微鏡法（TEM、JEM-1230、JEOL、東京、日本）によって評価されました。簡単に説明すると、ナノ粒子分散液を2％PTXと混合し、TEMグリッドに配置し、低赤外線放射下で10分間乾燥させました。サンプルをリンタングステン酸（2％）で対比染色し、加速電圧100kVのTEMで観察しました。

インビトロ薬物放出研究

薬物放出研究は、透析法によって実施された。簡単に説明すると、5mg相当のGENナノ粒子を1mlの放出バッファー（PBS、pH 7.4）に懸濁し、透析チューブ（MWCO：3500）に移しました。透析チューブを、25mlの放出バッファーを含むFalconチューブに入れました。ファルコンチューブを37°Cで穏やかに攪拌しながらシェーカーに入れました。事前に指定された間隔で、特定の量のサンプルが採取され、新しいバッファーまたは培地と交換されました。放出媒体から放出された薬物は、HPLCによって研究されました。

細胞培養

ヒト子宮頸癌細胞株（HeLa細胞）はATCC、MS、USAから入手し、10％FBSと抗生物質混合物を含むDMEMで、5％二酸化炭素を含む加湿雰囲気下で37°Cで培養しました。

セルラー取り込み

ナノ粒子（GCNおよびFGCN）のターゲティング効率は、細胞取り込み分析によって研究されました。この研究では、使用した蛍光プローブはクマリン-6でした。細胞を96ウェルプレートに入れ、24時間付着させました。培地を除去し、GCNおよびFGCNを含む新鮮な培地と交換し、異なる間隔でインキュベートしました。次に、細胞をPBSで洗浄し、溶解し（Triton-X）、遠心分離し、上清を回収した。上清を使用して、マイクロプレートリーダー（GENios、Tecan、スイス）で蛍光強度を評価しました。吸収は、励起波長430 nm、発光波長485nmで測定されました。

細胞取り込みイメージング

共焦点レーザー走査顕微鏡（Olympus Fluoview FV-1000、東京、日本）を使用して、癌細胞における定性的な細胞取り込みを測定しました。 2×10 ⁵ 細胞を6ウェルプレートに播種し、24時間インキュベートしました。培地を取り除き、GCNとFGCNを含む新しい培地と交換し、2時間インキュベートしました。細胞をPBSで洗浄し、固定し、再度洗浄した。次に、CLSMを使用して細胞を観察しました。

細胞毒性アッセイ

遊離GEN、GCN、およびFGCNの細胞殺傷効率は、MTTアッセイプロトコルによって研究されました。播種密度が1×10 ⁴ のHeLa細胞 細胞を96ウェルプレートに入れ、24時間付着させました。翌日、細胞を100μlの新鮮な培地で遊離のGEN、GCN、およびFGCNで処理し、24時間インキュベートしました。その後、培地を除去し、PBSで2回洗浄した。 MTT（5 mg / ml）を含む10マイクロリットルのDMEMを96ウェルプレートに入れ、4時間放置しました。 MTT溶液を吸い上げ、DMSOを加えて、生細胞に対応するホルマザン結晶を溶解しました。ホルマザンの吸光度は、プレートリーダー（Bio-Tek Instruments Inc.、USA）を使用して570nmの波長で研究されました。 IC50は、GraphPad Prizmソフトウェア（バージョン17）を使用して計算されました。

ライブ/デッドアッセイ

播種密度が2×10 ⁵ のHeLa細胞 細胞を6ウェルプレートに播種し、24時間インキュベートしました。翌日、細胞を100μlの新鮮な培地で遊離のGEN、GCN、およびFGCNで処理し、24時間インキュベートしました。その後、培地を除去し、PBSで2回洗浄した。細胞は、製造業者（Molecular Probes、USA）の指示に従って処理された。カルセインAMとエチジウムホモ二量体はそれぞれ、染色に使用される生細胞と死細胞の色素です。

統計分析

t を使用してデータを統計的に分析しました テスト。 P 0.05未満の値は、統計的有意性を示すために使用されました。すべての実験は3回行った。

結果と考察

ヒト子宮頸がんは、主にヒトパピローマウイルスに起因する、世界中の女性の生殖年齢で人気のあるがんの1つです。したがって、化学療法、手術、放射線療法などの治療オプションが定期的に使用されます。しかし、子宮頸がんの治療に効果的なものはありません。化学療法剤または他の小分子は、特異的に送達された場合、癌治療効率を改善することが報告されています。最近、化学療法薬に比べて毒性が少ないことが知られている天然化合物が癌の治療に大きな注目を集めています。ゲニステインは、その強力な抗がん作用により注目を集めています。ただし、GENの臨床的可能性は、溶解度が低く（〜1.43μg / ml）、バイオアベイラビリティが低いために妨げられていました。本研究では、主に、FA結合キトサンナノ粒子にカプセル化することにより、FR-α過剰発現HeLa子宮頸がん細胞に対するGENの抗がん特性を高めることを目的としました（図1）。

ゲニステインをロードした葉酸結合キトサンナノ粒子の調製の概略図

GENをロードしたナノ粒子システムの物理化学的特性評価

粒子システムのサイズとゼータ電位は、抗がん剤の細胞内在化と全身性能に重要な役割を果たします。動的光散乱（DLS）を使用して、GENをロードしたナノ粒子の粒子サイズとサイズ分布を決定しました（図2）。 GCNの平均粒子サイズは約140nmでしたが、FGCNは約165 nmであり、優れた多分散度指数を示しました。 FGCNの平均流体力学的直径は200nm未満です。これは、浸透と保持の効果を高めて腫瘍組織に浸透するのに十分です。粒子のサイズが小さいと、ナノ粒子の体からの急速なクリアランス特性（RES）に抵抗する可能性があります[20]。表面電荷は、懸濁液の形での粒子の安定性の重要な指標と見なされます。 GCNの平均ゼータ電位は+ 26mVでしたが、FGCNは+ 21.5mVでした。表面電荷のわずかな減少は、キトサンのアミン基の置換に起因する可能性があります。さらに、GCNとFGCNは、95％を超える高い捕捉効率を示し、全身アプリケーションへの適合性を示しています。 FGCNの粒子サイズとゼータ電位は3か月間保管しても変化しませんでした。これは、保管の安定性が高いことを示しています（図3）。

FGCNの透過型電子顕微鏡

リン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）におけるGCNおよびFGCNのinvitro放出プロファイル。放出された薬物の量をHPLC法で定量し、実験を3回行った

表面形態分析

最適化されたFGCNの表面形態はTEMによって特徴づけられました。ナノ粒子は球形の形態を示し、銅グリッドに均一に分布していました。 TEM分析で観察された粒子サイズはDLS観察と一致していました（図4）。

HeLa子宮頸がん細胞におけるGCNおよびFGCNの細胞取り込み分析。 a 蛍光法によるナノ粒子の細胞取り込みの定量分析。 b 共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM）ベースの細胞取り込み分析。クマリン-6を蛍光プローブとして使用しました

インビトロ薬物放出動態

ＧＣＮおよびＦＧＣＮからのＧＥＮの放出は、透析法を使用して実施された。 PBSを使用して放出研究を実施し、生理学的状態をシミュレートしました。予想通り、GCNとFGCNのリリースプロファイルはほぼ同じでした。両方の製剤は、GENの制御放出プロファイルを示し、単相放出動態を示しました。 24時間の終わりに、薬物の約35〜40％が両方のナノ粒子システムから放出されました。 GEN放出率の傾向は研究期間の終わりまで続き、最終的に、薬物の約90％が放出されました。表面の葉酸抱合は、薬物の低放出に影響を及ぼし、抱合物質の存在の影響を示します。 ＮＰからの薬物の制御放出は、外部放出媒体への薬物の経路長の延長に起因することが報告されている。全体として、pH 7.4の条件での薬物の徐放は、薬物の多くが無傷であり、時間とともに腫瘍組織に蓄積することを示唆しています。

インビトロ細胞取り込み研究

GENの細胞内濃度は、癌細胞でその細胞毒性作用を引き出すために非常に重要です。したがって、NPシステムの細胞取り込みの可能性は治療効果の観点から非常に重要です。クマリン-6をロードしたGCNとFGCNを異なる時点で癌細胞にインキュベートしました。両方のNPシステムは、4時間で最大の細胞取り込みを伴う、時間依存の細胞取り込みを示しました。予想通り、葉酸受容体を標的としたFGCNは統計的に（ p <0.05）HeLaがん細胞での細胞取り込みが高い。繰り返しになりますが、ほとんどの場合、FGCNの主な取り込みは、リガンドと対応する受容体との相互作用を促進する可能性があり、HeLa細胞に多数存在する粒子表面でのFAの利用可能性によるものです[21]。

細胞への取り込みは、顕微鏡画像によってさらに確認されます。細胞を適切な製剤でインキ​​ュベートし、2時間インキュベートしました。見られるように、高い蛍光強度は、GCN処理された細胞のそれと比較して、FGCNに曝露された癌細胞で観察された。これらの結果は、葉酸結合FGCNが、リガンド受容体（FA-FR-α）の認識により、癌性のHeLa細胞に対して特異的な親和性を持っていることを示しています。

インビトロ細胞毒性

HeLa癌細胞に対するGEN、GCN、およびFGCNのin vitro細胞毒性活性は、MTTアッセイプロトコルによって研究されました。見られるように、GENのナノ製剤は、遊離のGENのそれと比較して、癌細胞を殺すのにより効果的でした。しかしながら、すべての製剤は、癌細胞において典型的な用量依存的な細胞毒性効果を示した。予想通り、葉酸タグ付きナノ製剤は統計的に（ p <0.05）非標的製剤と比較して高い細胞毒性効果。 FGCNの優れた抗がん効果は、細胞内環境での薬物濃度を高める可能性のある、がん細胞における特定の受容体を介したナノ粒子の内在化に起因していました。さらに、カプセル化された化合物の放出を制御するナノ粒子の能力も、FGCNの高い細胞毒性に寄与した。 IC50値を使用して、癌細胞に対する製剤の実際の細胞毒性効果を評価しました。一般的に、元の細胞の半分を殺すのに必要な濃度です。結果は、GCNで処理した場合にGENのIC50値が33.8から26.5μg/ mlに減少したことを示しました。重要なことに、24時間のインキュベーション後にFGCNで処理すると、IC50値は14.6μg/ mlに減少しました。ナノ粒子はMDR効果を低下させることが報告されており、P糖タンパク質によって媒介される細胞からの流出を低下させることにより、GENの抗がん効果を高めることが期待されています。 FGCNの優れた抗がん効果は、HeLaがん細胞への高い細胞取り込みと一致していました[22]。

顕微鏡分析

癌細胞の形態素解析は、抗癌剤による治療後に実施されました。製剤を癌細胞に曝露し、24時間インキュベートしました。対照細胞は正常であり、ウェルプレートのカバースリップ上に広がっていたが、製剤処理群では細胞が収縮した。細胞毒性アッセイと一致して、癌細胞の形態は、製剤ごとに異なっていました。示されているように、FGCN処理細胞は数が少なく、形態が丸く、製剤の細胞毒性が高いことを示しています。 GCNはまた、癌細胞への取り込みがかなり高いため、癌細胞に顕著な変化を引き起こしました。結果は、キトサンでコーティングされたナノ粒子が子宮頸がんの治療に有益であることを明確に示しています（図5）。

HeLa癌細胞におけるGEN、GCN、およびFGCNのinvitro細胞毒性分析。細胞をそれぞれの製剤で処理し、24時間インキュベートしました。 ** p <0.01は、FGCNとGEN.Aの統計的差異です

ライブ/デッドアッセイ

個々の製剤の細胞毒性の可能性は、生/死アッセイによってさらに研究された。薬物治療（24時間）後の生存細胞と死細胞の量を緑色の蛍光強度から視覚化しました。カルセインAMとエチジウムブロマイド色素は、製剤で処理された細胞に適用される代表的な生細胞マーカーと死細胞マーカーです。薬物治療後に存在する残りの生細胞は、カルセインを取り込み、緑色の蛍光灯（488 nm）を放出します。示されているように、未処理の細胞は高い蛍光強度（緑色の蛍光）を示し、遊離GENの処理も成長中の細胞を減少させませんでした。一方、FGCNは生細胞が少なく、死細胞が多い（蛍光強度が低い）ことから、強力な効果を示しています。 FGCN治療群の高い細胞死率は、癌細胞におけるより高いナノ粒子の内在化に起因していました。結果は細胞毒性アッセイと一致しています（図6）。

GEN、GCN、およびFGCNによる治療後のHeLaがん細胞の形態素解析

アポトーシス分析

この研究では、GENの細胞内濃度を高め、子宮頸がん細胞の抗がん効果を向上させることができる、独自の葉酸受容体を標的とした送達システムを設計しました。したがって、遊離GEN、GCN、およびFGCN NPのアポトーシス誘導特性を分析するために、細胞をアネキシンV / PI二重染色後のフローサイトメトリーによって評価しました。図7は、遊離GENで処理された細胞が癌細胞のアポトーシスを誘導しなかったことを示していますが、GCN（〜22％）はこれらの癌細胞のアポトーシスを誘導するのに効果的でした。予想通り、FGCNは癌細胞の顕著なアポトーシス（〜55％）を示し、その優れた抗癌効果を示しています。製剤のより高い抗癌効果は、対応する受容体に対するリガンドの特異的親和性によるものであり、これにより、癌細胞内の薬物濃度が増加した。結果は、キトサンでコーティングされたナノ粒子が子宮頸がんの治療に有益であることを明確に示しています。抗がん剤のナノテクノロジープラットフォームは、がん細胞の毒性を高め、抗腫瘍剤の治療効果を高めました（図8）。

GEN、GCN、およびFGCNで処理した後のHeLa癌細胞の生/死アッセイ。緑色の蛍光は生細胞を示します

GEN、GCN、およびFGCNで処理した後のHeLa癌細胞のアポトーシス分析。フローサイトメーターを使用して、細胞アポトーシスの割合を分析しました。 ** p <0.01は、FGCNとGENの統計的差異です

結論

この研究では、子宮頸がん細胞へのバイオフラボノイド、ゲニステイン（GEN）の特異的送達のために、新規の葉酸結合キトサンナノ粒子が処方されました。 FGCNは、HeLa細胞においてGCNよりも高い内在化の可能性を示しました。その結果、FGCNはHeLa細胞に対して特異的な親和性を持ち、より良い治療に貢献することが明らかになりました。葉酸タグ付きナノ製剤は、非標的製剤と比較して優れた細胞毒性効果を示しました。一貫して、GENのIC50値は、24時間のインキュベーション後にFGCNで処理した場合、33.8から14.6μg/ mlに減少しました。アポトーシス研究は、FGCNナノ粒子が抗癌活性に関してGCNまたは遊離GENのいずれかであることを示しました。全体として、結果は、送達システムへの葉酸抱合が、全体的な癌治療に有益である子宮頸癌の生存に大きな影響を与える可能性があることを明らかにした。臨床動物モデルに関する研究は、本研究の次のステップの見通しを示します。

略語

EPR：

浸透と保持の強化

FGCN：

葉酸共役GENをロードしたキトサンナノ粒子

FR：

葉酸受容体

GCN：

GENをロードしたキトサンナノ粒子

GEN：

ゲニステイン