アプタマー修飾金ナノ粒子共役体によるモリンの標的型pH応答性リポソーム送達：がん治療への応用

概要

本研究では、標的特性を有する抗がんナノ粒子であるアプタマー・金ナノ粒子（Apt-Au）修飾モリンpH感受性リポソーム（MSL）の合成を提案する。腫瘍微小環境は正常組織と異なり、一般的にpHが低いため、薬物の効果を阻害する要因となる。そのため、pH応答性薬物が注目を集めている。金ナノ粒子（AuNPs）は、微小サイズ、優れた生体適合性、容易な表面修飾、強力な細胞透過性により、薬物キャリアとしての可能性を秘めている。Apt-Au@MSLは優れた単分散性と腫瘍標的特性を示し、透析により弱酸性環境下で薬物を放出する。MTT法によるスクリーニングの結果、SGC-7901細胞の増殖を効果的に抑制できることが判明した。生体内実験では、Apt-Au@MSLの投与が移植マウスモデルにおける腫瘍増殖を抑制することを実証した。H&E染色とTUNELアッセイにより、Apt-Au@MSLが腫瘍アポトーシスを促進することがさらに確認された。Apt-Au@MSLは、活性酸素種（ROS）の過剰産生を誘発し、複数のシグナルクロストークを制御することでアポトーシスを誘導する可能性がある。血液生化学検査とH&E染色の両方から、これらの材料は生体内で無視できるレベルの急性毒性しか示さず、優れた生体適合性を有することが示唆された。強力な機能を備えたApt-Au@MSLは、将来の臨床がん治療における標的型抗がん材料として使用できる可能性がある。

はじめに

主要な死因の一つであるがん[1]は、多大な経済的損失と人類への害をもたらす。がん治療のためのスマートドラッグ開発に多大な努力が注がれてきた[2]。薬物が標的部位に到達するまで保護する能力を持つポリマーナノ粒子は、治療薬の送達改善に役立つ可能性がある[3]。治療薬を活性部位に確実に送達するため、高反応性ナノ粒子が用いられる。これらは、異なる生物学的刺激下で材料特性を変化させるよう設計可能である。反応性ナノ粒子は、外部刺激（温度、光など）および生物学的刺激（pH、酸化還元条件など）を用いて設計される。ナノ粒子の細胞内取り込み後にpH変化が生じるため、pH応答性ナノ粒子は研究の関心を集めてきた。pH応答機能は多様なポリマー構造に容易に組み込めるため、pH応答性ナノ粒子のセットを設計する材料としても注目されている。ナノ粒子は、表面化学の変化、粒子サイズや形状の変化、物質の分解・放出によってpHに応答する。このナノ粒子特性の変化は、細胞取り込みの制御と薬物の制御放出に利用できる。したがって、pH応答性ナノ粒子は治療薬送達システムの設計に強力な戦略を提供する。

モリン水和物（3,5,7,2′,4′-ペンタヒドロキシフラボン）（図1）は、中国漢方薬や植物から単離される天然活性物質[4]である。プロゲステロン化合物であり、植物におけるフェノールの二次代謝産物でもある。モリンは自然界に広く分布し、優れた抗酸化作用、抗がん作用[5]、顕著な抗炎症作用を発揮する。モリンの多様な応用可能性が大きな関心を集めている[6]が、その可能性は物質の低水溶性と低バイオアベイラビリティによって著しく制限されている[7]。

レシチン、セラミドなどで構成されるリポソーム（中空構造）は、両親媒性脂質分子からなる二重層構造を持つ[8]。リポソームは、生体適合性、機能性、副作用の軽減、大量の薬物封入能力など、望ましい特徴を備えている[9, 10]。親水性・疎水性両方の薬剤を効率的に運搬し、外部環境から保護し、標的組織領域へ正常に輸送できる[11]。pH感受性リポソームを用いて、腫瘍間質内で抗がん物質をpHトリガーで放出するよう設計することで、効能向上が図られている[12-15]。これらのpH感受性リポソームは、組織環境で薬物を放出し、がん組織のエンドソームのような酸性環境で急速に不安定化する特殊なリポソームである[16-18]。

腫瘍治療の選択性と有効性を高めるため、pH感受性リポソームを腫瘍標的ナノ粒子に修飾すべきである[19]。DNAアプタマーは最近、高選択性・高感度のバイオセンシング・イメージングセンサー、およびがん標的治療薬として開発されている[20]。一本鎖DNAアプタマーAS1411は、がん細胞核への高い結合親和性により化学療法薬として機能することが示されている[21]。このアプタマー（Apt）をAu NPsと組み合わせ、がん細胞核と相互作用できるApt担持Au NPsの二成分ナノ構造体を作製した。リポソーム・ナノ粒子ハイブリッドの設計が、多機能モダリティの作製に豊富なツールボックスを提供することも実証されている[22]。陽イオン性リポソームとAu NPsで構成されるハイブリッドリポソーム・Au NP小胞システムは、腫瘍間質内での薬物浸透改善と抗がん活性増強のために設計された[23, 24]。

金ナノ粒子（Au NPs）は優れた薬物キャリアと見なされ、生体関連分子で修飾することでがん標的特異性を高められる[25]。Au NPsの表面修飾により、スルフィド基を持つアプタマーをAu-S共有結合でAu NPs表面に修飾でき、ナノゴールド表面の適切なスルフィド基をナノゴールド表面に結合できる[26]。工学・応用の観点から、リガンド結合型金ナノ材料は、標的同定、検出、治療を促進する強力なプラットフォームを提供する。

本研究では、モリンを封入したpH感受性リポソームを用い、その表面にAu-Aptを組み立てた（Apt-Au@MSL、図3a）。低水溶性・低バイオアベイラビリティを特徴とするモリンを変換した。作製したApt-Au@MSLの形態、サイズ、その他の特性を評価した。新規ナノ粒子は腫瘍標的特性と高い抗がん活性を示した。Apt-Au@MSLの抗がん活性をin vitroおよびin vivoで検討した（図2）。

材料と方法

材料

L-α-ホスファチジルコリン（PC）、コレステロール（Chol）、コレステリルヘミサクシネート（CHEMS）、モリン（≥99.99%）、クエン酸ナトリウム（99.9%）、HAuCl₄·3H₂O（≥99.9%）、ポリビニルピロリドン（PVP、分子量40,000）、NaOH（≥98.0%）、HCl（37%）をSigma-Aldrich Chemical Co.（米国）から購入した。ジスルフィド修飾AS1411アプタマーはTaKaRa（中国大連）により合成された（配列：5′-HS-T-(C6-S-S-C6)-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3′）。チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド（MTT）、ヨウ化プロピジウム（PI）、カルセイン、Alexa Fluor 488 Annexin VをSigma-Aldrich Chemicalから購入。全ての水溶液は二重蒸留水で調製。その他の試薬は市販の最高グレードを使用。

Au NPsの合成

HAuCl₄·4H₂O（1%）1mLをMilli-Q水（pH=5.5）25mLに溶解し、PVP 50mgを添加。得られた溶液を三口フラスコ（150mL）に移し、機械攪拌下でマイクロ波（MW）照射を5分間実施。その後、クエン酸ナトリウム溶液（1%）1.5mLを速やかに添加し、さらに3分間MW照射。遠心分離（10,000rpm、5分）で溶液を回収。

Apt-Au NPsの合成

トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンを用いてアプタマーのジスルフィド結合を切断。30分後、アプタマー溶液（100μL、100μM）をAu NPs溶液（10mL、5nM）に添加し、24時間インキュベートしてAu-Apt NPsを形成。1日後、NaCl溶液（500mM）2.5mLを2回、4時間間隔で添加して塩析[27]。

pH感受性リポソームの調製

卵黄PC、CHEMS、Cholをモル比33:13:5、モリン5%で膜水和法によりリポソームを調製。卵黄PC、CHEMS、Chol、モリン2mgをCHCl₃ 8mLに溶解し、40℃でロータリーエバポレーターにより有機溶媒を除去。モリン・リポソームの場合、得られた薄い脂質膜を2%（w/v）PBSで水和し、氷冷プローブ超音波処理で15分間処理。最終リポソームをコロイド系で合成・安定化。Apt-Au@モリンpH感受性リポソーム（Apt-Au@MSL）の場合、脂質膜を5%デキストロース中の475μg/mL Au-Apt NPsで水和し、超音波処理[23]。

特性評価

紫外可視分光光度法（UV-Vis、S-3100フォトダイオードアレイ、Scinco Co.、韓国）、フーリエ変換赤外分光法（FT-IR、Nicolet iS50、米国Thermo Fisher Scientific）を実施。Apt-Au@MSLの形態を透過型電子顕微鏡（TEM、HT7700、日立、日本）で観察。モリン放出率をUV-vis分光法で測定。モリン・リポソームとApt-Au@MSLの形態を走査型電子顕微鏡（SEM、S-4800、日立、日本）でも観察。動的光散乱（DLS）とゼータ電位測定で、モリン・リポソームとApt-Au@MSLの光学的特性とサイズをBrookhaven ZetaPALS電位アナライザーで評価。

細胞培養

ヒトがん細胞株SGC-7901、BGC-823、A549、HeLa、MCF-7、Hs68をATCCから購入し、10%胎児牛血清含有RPMI培地で37℃、5% CO₂条件下で培養。

In vitro抗がん活性試験

SGC-7901、BGC-823、A549、HeLa、MCF-7、Hs68を96ウェルプレート（2.0×10³細胞/ウェル）に播種し、Apt-Au@MSLを様々な濃度（0、5、10、15、20、30μg/mL）で培養。Au NPsとモリンを対照群とした。無処理群をブランク群とした。96ウェルプレートを湿潤インキュベーターで培養。インキュベーション後、MTT溶液（5mg/mL）9.6mLを各ウェルに添加し、さらに2時間培養。各群を3重試験し、平均OD値と薬物濃度曲線からIC₅₀値を算出。共焦点蛍光顕微鏡で各群の輝度を取得[28]。

細胞接着をリアルタイム細胞電子センシングシステム（RT-CES；ACEA Biosciences, Inc.）で75時間、10分ごとにモニタリング。細胞接着測定のため、各ウェルに細胞（1.0×10⁴細胞/ウェル）と新鮮な培地を最終体積200μLで播種し、Apt-Au@MSL溶液（10、20、30μg/mL）で10時間インキュベート後、さらに12時間培養[29]。ブランク群は無処理細胞、対照群はモリンとモリン・リポソーム群とした。

蛍光顕微鏡観察

SGC-7901細胞を48ウェルプレートで一晩培養（37℃、5% CO₂）。その後、Apt-Au@MSL溶液（10、30μg/mL）で異なる濃度・12時間処理。対照群はモリンとモリン・リポソーム群。培地を除去し、ブランク群は無処理細胞。PBSで3回洗浄。生死細胞共染色（LIVE/DEADアッセイ）で染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で蛍光画像を取得（カルセイン-AM：Ex=488nm、Em=515nm；PI：Ex=535nm、Em=615nm[30]）。

アポトーシス細胞死解析

Apt-Au@MSLの抗がん効果測定のため、6ウェルプレートの各ウェルにSGC-7901細胞（1.0×10⁵細胞/ウェル）を播種し、Apt-Au@MSL溶液（5、10、20、30μg/mL）で12時間培養。ブランク群は無処理細胞、対照群はモリンとモリン・リポソーム群。処理後、細胞を回収しPBSで2回洗浄。PIとAnnexin V-FITCで染色し、CytoFLEXアナライザー（Beckman Coulter）で解析（PI：Ex=535nm、Em=615nm；Annexin V-FITC：Ex=488nm、Em=525nm[31]）。

細胞壁破壊の研究

抗がんアッセイにおける細胞壁破壊を研究するため、SGC-7901細胞を6ウェルプレートで培養（37℃、5% CO₂）。無処理細胞をブランク群とした。Apt-Au@MSL（5、10、20、30μg/mL）で12時間培養後、トリプシン-EDTA溶液（0.25%）で処理。全細胞（培地中の浮遊細胞含む）を2000r/min、5分で遠心回収。回収細胞を2.5%グルタルアルデヒド溶液で4時間後固定[32]。固定細胞をアセトン勾配系列で20分間脱水。最終的に一連の手順を経て銅グリッドにマウントし、TEM（HT-7700、日立、日本）で観察。

ウェスタンブロット解析

SGC-7901細胞のタンパク質発現をウェスタンブロット解析で検出。SGC-7901細胞（4.0×10⁵細胞/ウェル）を9cm培養皿に接種し、20μg/mL Apt-Au@MSLで1、6、12、24時間処理。処理後、細胞を回収し、氷上で細胞溶解バッファーに1時間懸濁。混合物を11,000g、4℃、10分で遠心分離し、全細胞タンパク質を含む上清を回収。BCA法で上清の総タンパク質濃度を測定。タンパク質をローディングバッファーに再懸濁し、100℃で10分間沸騰。同量タンパク質（40μg/レーン）を含むサンプルをSDS-PAGE（10%トリシンゲル）で電気泳動。100V、1.5時間でニトロセルロース（NC）膜に転写。5%脱脂乳を含むTBST（0.1% Tween-20含有Tris緩衝生理食塩水）で1時間ブロッキング。NC膜を一次抗体、二次抗体の順でインキュベート。ECLウェスタンブロット検出試薬でターゲットタンパク質バンドを可視化。β-actinをタンパク質ローディングと転写の内部対照として使用。Quantity-Oneソフトウェアでタンパク質発現を定量し、バンド下に発現率を表示[33]。

動物モデル

BALB/c雄ヌードマウス（約17g）を南京大学モデル動物研究センターから購入し、無菌環境（特定病原体フリー動物）で飼育。SGC-7901細胞懸濁液（100μL、1×10⁶/mL）をヌードマウスの肩部に皮下注射して腫瘍モデルを確立。腫瘍細胞皮下注射15日後に腫瘍の明視画像を生成。全動物実験は安徽農業大学実験動物センター承認プロトコル（許可番号：SYXK 2016-007）に従って実施。ノギスで各腫瘍の最大縦径（長さ）と最大横径（幅）を測定。腫瘍体積を長さ×幅²×0.5の式で算出[34]。

In vivo抗がん試験

腫瘍体積が50mm³に達した時点で追試を実施。マウスを無作為に5群に分け、以下の静脈内投与を行った：PBS（100μL）、モリン、モリン・リポソーム、Au-Apt、Apt-Au@MSL。マウス尾静脈から2mg/kgの用量で物質を投与。24日後にマウスの腫瘍サイズを測定。マウスの体重と生存率も測定。マウスを安楽死させ、腫瘍と臓器組織を回収してH&E染色[35, 36]。

ブロッキングと透過化後、腫瘍スライドをPBSで洗浄し、TUNELアッセイで染色、DAPI対抗染色を実施。CLSMで蛍光画像を取得。DAPIイメージング：Ex=358nm、Em=461nm；TUNELアッセイ：Ex=450-500nm、Em=515-565nm[37]。

毒性評価アッセイ

Apt-Au@MSL治療の主要臓器への毒性評価のため、4治療群のマウスを30日後に安楽死。全群のマウスから重要臓器（肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、腫瘍）を回収しH&E染色。血液サンプルも採取し、血糖値を測定。さらにマウス体重を測定[38]。

結果と考察

特性評価

本研究は、ナノ粒子（Apt担持Au NPs）の利点を備え、抗がん剤として効果的に使用できる新規リポソームの開発を目的とした。新規リポソームの基本特性は更なる研究のために重要である。Apt-Au@MSLは先行研究[23]に従い、若干の修正を加えて合成し、様々な手法で特性評価した（図3）。図3bにUV-vis分光法の結果を示す。Au NPsの特徴的ピークが観察され、Au NPs形成をモニタリング可能。Au NPsのUV-visスペクトルで約530nmに特徴的ピークを観察。具体的には、表面Apt修飾の影響を受けた強いUV吸収を示した。同様の結果を得た。モリン封入後、pH感受性リポソームで特徴的ピークのシフトを観察。作製したApt-Au@MSLの特徴的ピークは362nmと550nmに位置した。これらの結果は合成が成功したことを示す。更なる特性評価のためFT-IR分光法を実施し、合成結果を検証。モリン・リポソームとApt-Au@MSLの特徴的ピークの赤方シフトが、モリンの修飾成功をさらに裏付けた（図3c）。Apt-Au@MSLのpH感受性を決定するため、異なるpHのPBSでモリン放出アッセイを実施。これら3つのpH値は、血液循環の正常環境、腫瘍の弱酸性環境、細胞内の酸性環境を模倣。モリン放出率をUV-vis分光法で検出。pH 5.0では約54%のモリンが24時間以内に放出され、その後96時間まで持続放出が観察された。一方、pH 7.4では24時間で約10%のみ放出。これらの結果は、Apt-Au@MSLが正常生理条件下で優れた安定性を示し薬物漏出を防ぐ一方、核内で速やかに薬物を放出することを示す。この薬物放出挙動は治療効果を効果的に改善できる（図3d）。リポソームとApt-Au@MSLの構造を解明するためTEMとSEMを実施（図3f）。TEMでAu NPsの構造を解明。図3gに示すように、Au NPsの粒子サイズは約10nmで、リポソーム上の修飾サイズと一致（図3g）。図3eのSEM結果では、未修飾リポソームは不均一な直径約120nmの単層小胞を形成し、DLSで測定されたサイズと一致。一方、Apt-Au@MSLはAu-Apt修飾に起因するハイブリッド小胞の形態を示し、直径150nmはDLS測定値と一致（図3i）。特筆すべきは、pH感受性リポソームとAu-Aptの相互作用をTEMで調べた結果、Au NPsが小胞脂質二重層ほぼ排他的に結合し、小胞の周辺に局在すること（図3h）。ζ電位測定結果を図3jに示す。Au NPsとAu-Aptのゼータ電位は負。Au NPs（-57.1±0.3mV）とAu-Apt（-31.7±0.2mV）の両方が負電荷。Apt-Au@MSLは正電荷のモリン・リポソームで修飾され、電位が36.4±0.3mVに変化。正負電荷の吸着がAu-Aptとモリン・リポソームの結合機構。さらに、図3kは粒子の封入率の経時変化を示し、粒子の経時的安定性を示唆。図3kに示すように、24時間以内に封入率はほとんど変化せず、粒子は経時的に良好な安定性を示す。モリン濃度とUV-Vis吸光度の標準曲線を作成し、モリン・リポソームとApt-Au@MSLの封入率を検討。結果、モリン・リポソームとApt-Au@MSLの封入効率はそれぞれ90.2%と89.6%に達することが判明（Table S1、Fig. S1）。

Apt-Au@MSLの抗がん活性試験

In vitro

モリンは優れた抗腫瘍活性を示すが、低水溶性のためバイオアベイラビリティが低い。モリンをpH感受性リポソームで封入し水溶性化した後、リポソーム表面をAu-Aptで修飾して標的抗腫瘍効果を付与。図4aにMTT法によるApt-Au@MSLのin vitro抗がん活性を示す。薬物濃度はモリン濃度で定義。モリン処理群はブランク群と比較して明らかな抗がん活性を示さなかった。しかし、pH感受性リポソームで封入したモリン処理群は抗がん活性が増強された。結果はモリン・リポソームの抗腫瘍活性が生モリンより優れていることを示唆。同時に、Aptで修飾したリポソーム（Apt-Au@MSL）では抗腫瘍活性がさらに向上した。表1にモリン、モリン・リポソーム、Apt-Au@MSL、シスプラチンのIC₅₀値を示す。モリン、モリン・リポソーム、Apt-Au@MSLは腫瘍細胞に広範な抗がん活性を示し、高い効力と正常ヒト細胞への低毒性でSGC-7901細胞に明確な選好性を示した。Apt-Au@MSLのSGC-7901細胞に対するIC₅₀値は15.6±1.5μg/mL。これらの結果はRTCA試験でさらに確認された。SGC-7901細胞をApt-Au@MSLの異なる濃度で培養；ブランク群はPBS、対照群はモリンとモリン・リポソーム。接着と伸展をiCELLigenceでモニタリング（図4b）。結果はMTT試験とほぼ類似。Apt-Au@MSLの抗腫瘍活性はモリンとモリン・リポソームより有意に高かった。Apt-Au@MSLは濃度増加に伴いSGC-7901細胞の増殖を抑制。Apt-Au@MSL処理後の細胞形態変化も蛍光顕微鏡で観察。図4cに示すように、Apt-Au@MSL無処理のSGC-7901細胞は細胞構造の完全性を維持。対照的に、Apt-Au@MSLの異なる濃度で処理した細胞は細胞完全性が損なわれた。

アポトーシス細胞死解析

Annexin-FITC染色を用いたフローサイトメトリーでアポトーシスを定量解析。PIとAnnexin V-FITCで染色し、CytoFLEXフローサイトメーター（Beckman Coulter）で解析。Annexin Vは露出したホスファチジルセリンに結合する初期アポトーシス細胞を検出、PI標識は後期アポトーシス細胞を染色。ブランク群のアポトーシス率は1.57%。モリン処理群は3.51%。Apt-Au@MSLの異なる濃度では、7.44%、10.75%、15.53%、40.77%とより高いアポトーシス誘導能を示した（図5）。アポトーシスの増強は、Apt-Au@MSLによる優れた抗がん活性を裏付ける。SGC-7901細胞のアポトーシス率はApt-Au@MSL濃度増加に伴い上昇。

蛍光アッセイによる抗がん活性試験

Apt-Au@MSLによるSGC-7901細胞への抗腫瘍効果をLIVE/DEAD蛍光アッセイで直感的に評価。モリン、モリン・リポソーム、Apt-Au@MSLの異なる濃度でインキュベート後、LIVE/DEADキットで30分間暗所で共染色。図6に示すように、ブランク群の細胞は全て緑色蛍光（生細胞）。対照群（モリン、モリン・リポソーム）では赤色蛍光細胞（死細胞）を観察。しかし、Apt-Au@MSLの異なる濃度で処理した細胞では、明らかに多数のアポトーシス細胞を観察。濃度増加に伴い生細胞が徐々に減少し、死細胞の割合が優占し、細胞密度が低下。結果はApt-Au@MSLが腫瘍アポトーシスを効果的に促進することを確認。

細胞完全性の研究

Apt-Au@MSLのSGC-7901細胞への取り込みと輸送の影響を確認するため、TEMアッセイを実施。TEMで細胞形態の変化を観察。TEM画像で細胞内部構造を観察し、抗がんメカニズムの参考とした。図7に示すように、無処理SGC-7901細胞のブランク画像は明確な細胞壁を示し、形態・外観に有意な変化なし。対照群（モリン、モリン・リポソーム）では細胞形態に部分的損傷、核領域の収縮を観察。しかし、Apt-Au@MSL暴露後には細胞壁と内部構造に顕著な変化。細胞質漏出、核構造が不明瞭化。空洞化した細胞周辺に多数の細胞断片が形成。さらに、細胞壁が崩壊・破壊。プロファイル全体が不明瞭になり、細胞が損傷、細胞質が漏出。赤矢印はAu NP領域を示す。Apt-Au@MSL濃度増加に伴い、核内により多くのAu NP領域が出現。これはApt-Au@MSLが細胞内部に入った後のモリン放出を示唆し、大量のAu NPs出現の理由となる。これらの結果は、抗腫瘍活性が細胞完全性と核構造の損傷に関連することを示唆。

Apt-Au@MSLによる分子メカニズム

Apt-Au@MSL誘導アポトーシスの分子メカニズムを探るため、カスパーゼとPARPの発現レベルを検出。まず特定基質を用いてカスパーゼ-3、-8、-9の活性化を検出。図8aに示すように、Apt-Au@MSL処理はカスパーゼ-3、-8、-9の用量依存的活性化を誘導。カスパーゼ-9はカスパーゼ-8よりもミトコンドリア経由のアポトーシスを促進し、ミトコンドリア媒介アポトーシスシグナル経路が優位であることを示唆。ウェスタンブロット解析により、タンパク質レベルでのApt-Au@MSL誘導アポトーシスの存在をさらに確認。図8b、cに示すように、Apt-Au@MSL処理後、カスパーゼの活性化とPARPの切断が時間・用量依存性を示す（図8b、c）。図8d、eのウェスタンブロット解析が結果を確認。結論として、Apt-Au@MSLは主にアポトーシス誘導によりSGC-7901細胞の増殖を抑制する。

Apt-Au@MSLによる腫瘍増殖抑制

In vivo

SGC-7901腫瘍移植モデルを用いてApt-Au@MSLのin vivo抗腫瘍活性を評価。対照群（モリン、モリン・リポソーム）の腫瘍画像と比較すると、Apt-Au@MSL処理群では腫瘍の重量とサイズが顕著に減少（図9a）。相対腫瘍体積曲線とマウス体重曲線は、Apt-Au@MSLがin vivoで他の治療群より高い抗がん効率を示すことを示唆（図9b）。対照群（モリン、モリン・リポソーム）とブランク群の間に平均腫瘍体積の有意差なし。Apt-Au@MSL群の腫瘍体積はブランク群の約1/10、対照群の約1/6のみ。結果は生モリンとモリン・リポソーム（40mg/kg）が腫瘍増殖率に影響を与えない一方、Apt-Au@MSLが腫瘍増殖を抑制できることを示す。各群（PBS、モリン、モリン・リポソーム、Au-Apt群）のマウス体重に治療期間中顕著な変動なし（図9c）。この結果は治療が耐容され、急性副作用を引き起こさないことを示唆。特筆すべきは、Apt-Au@MSL処理群でマウスの生存期間が著しく延長したこと（図9d）。この群の生存マウスは正常に振る舞い、明らかな不健康兆候なし。これらの結果は、Apt-Au@MSL投与が移植マウスモデルで腫瘍増殖を抑制することを実証。

抗がん活性の組織学的解析

固定・処理後、腫瘍組織と臓器サンプルのH&E染色を実施。異なる群の腫瘍組織H&E染色で治療効果（腫瘍細胞死）を評価。図10aに示すように、Au-Apt、モリン、モリン・リポソーム処理群のマウスはブランク群と同程度の熱損傷を示し、明らかなアポトーシスは観察されず。腫瘍組織切片は密に充填した腫瘍細胞で構成。しかし、Apt-Au@MSL処理群では腫瘍組織に最も顕著な損傷、中程度の細胞アポトーシスを観察。結果はApt-Au@MSL処理マウスモデルでの抗がん活性を示唆。腫瘍組織内アポトーシス細胞比率をさらに調べるため、TUNELアッセイでアポトーシス細胞を検出。図10bに示すように、腫瘍内アポトーシス細胞は緑色蛍光で染色されアポトーシスを示唆。マージ画像ではブランク群と対照群（モリン、Au-Apt）で緑色蛍光領域が少なく、アポトーシス細胞が少ないことを示唆。モリン・リポソーム処理群の細胞は部分的にアポトーシス。一方、Apt-Au@MSL処理群では大量の緑色蛍光領域を観察し、多数のアポトーシス細胞を示唆。結果はH&E染色と一致し、Apt-Au@MSLがin vivoで腫瘍アポトーシスを促進することを確認。

In vivo毒性評価

抗がん薬の臨床応用では潜在的in vivo毒性が重大な懸念事項。Apt-Au@MSLのin vivo適用性を検証するため、マウスを異なる治療（モリン、モリン・リポソーム、Au-Apt、Apt-Au@MSL）で評価。血液生化学アッセイで治療後のマウス生化学変化を検討。図11aに示すように、Apt-Au@MSL群の血糖値はブランク群と対照群と類似。各群で体重差なし。安定した増加を観察し、薬物が毒性を示さないことを示唆（図11b）。臓器切片のH&E染色（図11c）では、Apt-Au@MSL処理群でブランク群と対照群と比較して損傷や炎症の兆候なし。この所見はPBS、モリン、モリン・リポソーム、Au-Apt、Apt-Au@MSLがin vivoで無視できる副作用しか示さないことを示唆。これらの結果とH&E染色は、Apt-Au@MSLの腫瘍治療への安全性をさらに裏付ける。

結論

結論として、本研究は抗腫瘍ナノ材料Apt-Au@MSLの合成を提示する。Apt-Au@MSLは優れた単分散性と腫瘍標的特性を示した。モリンの極性を修飾し、抗腫瘍活性を増強。特性評価実験では溶液pH 5.0でApt-Au@MSLからのモリン放出率が最大。Apt-Au@MSLはAu-Apt修飾に起因するハイブリッド小胞形態を示し、直径150nmはDLS測定値と一致。MTT法でモデルがん細胞をスクリーニングし、SGC-7901細胞の増殖を効果的に抑制できることが判明。Apt-Au@MSLのSGC-7901細胞に対するIC₅₀は15.6±1.5μg/mL。蛍光フローサイトメトリーアッセイでApt-Au@MSLが効果的抗がん材料として使用でき、in vitroでアポトーシスを誘導することを確認。TEM画像で細胞内にApt-Au@MSLが存在することが示され、がん細胞を標的できることを示唆。腫瘍重量試験から、Apt-Au@MSL投与が移植マウスモデルで腫瘍増殖を抑制することを確認。H&E染色とTUNELアッセイでApt-Au@MSLがin vivoで腫瘍アポトーシスを促進することをさらに確認。血液生化学検査とH&E染色の両方から、これらの材料は生体内で無視できる急性毒性と優れた生体適合性を示す。