DNA四面体送達は、HT-29結腸癌細胞のドキソルビシン誘導アポトーシスを増強します

背景

ドキソルビシン（Dox）は、最も広く使用されている抗腫瘍剤の1つであり、多くの臨床研究により、DoxはRNAおよびDNAの合成を阻害することにより、さまざまな細胞増殖サイクルで腫瘍細胞の増殖を著しく阻害できることが示されています[1、2]。以前の研究では、腫瘍細胞の増殖はG1期に効果的にブロックされ、転移も特定の濃度のDoxによって阻害されることが示唆されていました[3]。さらに、他の抗がん剤と比較した場合、比較的少量で効果的な阻害を達成することができます[4]。しかし、Doxは通常、腫瘍細胞に対する特異的なターゲティングの欠如とDNAおよびRNAの非選択的阻害に起因する副作用を誘発し、これが臨床応用を深刻に制限していました[5、6]。一方、細胞の摂取能力が低いと、腫瘍細胞へのDoxの蓄積が減少します[7]。したがって、Doxの効率的な配信システムを開発して、Doxをより具体的かつ効果的なターゲティングにし、カプセル化を容易にし、優れた摂取能力と生体適合性を実現する必要があります。

リポソームや無機ナノ粒子などのナノサイズの薬物担体は、Doxが腫瘍細胞膜に浸透するのを促進し、ターゲティング効率を向上させる可能性があります[8]。それにもかかわらず、リポソームベースの送達は、標的化が比較的不十分であるため、正常細胞への副作用を軽減することはできません。一方、メソポーラスシリカナノ粒子などの無機担体は、in vivoで完全に生分解することはできず、さらなる薬物摂取のプロセスを妨げ、潜在的な生物毒性をもたらします。これらの機能的デリバリーシステムの場合、準備の複雑さ、ナノ粒子構造の不均一化、およびカプセル化効率の低さが臨床的拡大の妨げになります[9、10、11]。薬物送達に優れた性能を備えたナノサイズの薬物担体として、DNA四面体（DNAテトラ）などのDNAベースの構造は、電気陰性DNAと原形質膜の間の非互換性を回避することによって膜に浸透する可能性があります[12、13、 14,15,16,17]。薬物と標的分子の両方をDNA四面体に共有結合させることができます。さらに、DNA四面体配列の容易な吸収と生分解により、長期間の保持が回避されます。 AS1411などのグアニンに富むアプタマー薬は、A549腫瘍細胞への送達に成功し、標的薬剤および阻害剤として機能しています[18]。 CpGやsiRNAなどの免疫調節因子は、免疫応答を調節するためにDNAテトラキャリアを介して腫瘍細胞に送達することもできます[19]。低毒性、適切な生体適合性、および調整可能なターゲティングの利点を備えたDNAテトラは、生物学的安全性とDoxデリバリーの可能性を示しました。

この研究では、抗がん剤としてDoxを、特定の認識分子として葉酸を組み合わせたDNA四面体の機能性粒子[20]を設計、合成、特性評価しました。抗癌効率は、細胞膜の表面にある有意にアップレギュレーションされた葉酸受容体を考慮して、結腸癌細胞で評価されました。具体的には、細胞取り込みのレベル、Dox誘導アポトーシスの程度、および細胞増殖の阻害をHT-29細胞株で測定しました。

メソッド

リージェントと機器

DNAオリゴヌクレオチド鎖は中国大連のTAKARAから購入しました。ダルベッコの改良イーグル培地（DMEM）とウシ胎児血清は、米国ニューヨーク州のギブコから購入しました。ペニシリンとストレプトマイシンは、中国の上海にあるBeyotimebiotechnologyから購入しました。葉酸、ドキソルビシン、3-（4,5-ジメチル-2-チアゾリル）-2,5-ジフェニル-2- H -臭化テトラゾリウム（MTT）、およびアガロースは、米国ミズーリ州のSigma-Aldrichから購入しました。すべての抗体は、中国の上海にあるAbcamCompanyから購入しました。その他の試薬は、中国の上海にあるSinopharm Chemical Regent Co.、Ltd。から購入しました。

UV-Vis分光光度計（Thermo Evolution 201）と恒温インキュベーターは、米国のThermoFisherから購入しました。遠心分離機（GT10-1）はBeijing Era Beili Centrifuge Co.、Ltd。から購入しました。蛍光分光光度計（UV-1800）は島津製作所から購入した。共焦点レーザー走査顕微鏡（Visitech）はライカの会社から購入しました。ポリメラーゼ連鎖反応装置（PCR、T100）、タンパク質電気泳動、および核酸電気泳動装置は、Bio-RadCompanyから購入しました。動的光粒子サイズアナライザーはBeckmanCompanyから購入しました。 96ウェルまたは24ウェルの細胞培養プレートはDowCorningCorporationから購入しました。 C18カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー（HPLC、Agilent 1200）は、AgilentTechnologiesから購入しました。

ヒト結腸癌細胞株HT-29は、10％ウシ胎児血清、100 U / mLペニシリン、100μg/ mLストレプトマイシンを添加したDMEMで、37°C​​で95％空気と5％二酸化炭素を含む加湿雰囲気で維持されました。 。

DNA四面体の合成と精製

この調査では、合成は図1の概略手順に従い、DNA四面体の一本鎖DNA（ssDNA）配列も図1に示されています。詳細には、各ssDNAを0.5×TEバッファーに溶解し、対応するDNAの光学密度（OD）値を260nmのUV分光光度計で測定しました。同じ濃度で4本の鎖を作るために追加のTE緩衝液を補充した。 4つのssDNAの混合比は、100μL中1μMで1：1：1：1でした。反応は、95°C、10分、4°Cに自然冷却されたサイクリング条件でポリメラーゼ連鎖反応（PCR）マシンで実行されました。すべての一本鎖DNAは、特徴的な吸収ピークとして260nmを使用してHPLCで精製しました。 HPLCスペクトルでは、DNAテトラのピーク時間は一本鎖のピーク時間よりも速く、対応する時点で生成物が収集されました。

葉酸-DNAテトラ-Dox、DNAテトラ-Dox、および葉酸-DNAテトラの概略図。 DNA四面体の一本鎖DNA配列が提供された。腫瘍細胞を標的とし、細胞膜を貫通し、DNAを挿入するプロセスが描かれました

葉酸-DNAテトラドックスの合成と特性評価

Doxと葉酸の遊離水素基はアジド基で修飾され、クリック化学反応を介してssDNAの3'-OHと結合しました[21]。異なる量の官能基タグ付きssDNAを追加する場合、官能基の比率は、側鎖の特定のハイブリダイゼーションを介して化学量論的に制御できます。葉酸-DNA四面体の合成では、葉酸とDNA四面体のモル比を1：1に設定しました。 DNAテトラドックスの合成では、ドックスとDNA四面体のモル比を4：1に設定しました。葉酸-DNAテトラ-Doxの合成では、葉酸、DNA四面体、およびDoxのモル比をそれぞれ1：1：3に設定しました。すべての合成は37°Cでマイクロモルレベルで実行され、4°Cで保存されました[22]。

この研究では、一連のDNAテトラ複合体を、8％分離ゲル（39％Acr-Bis）を使用したポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で特性評価し、純度と相対的な分子サイズを確認しました。サンプルは、異なるDNAテトラ構造と2：1の混合比の6×ローディングバッファーで構成されていました。サンプルは、110 Vで90分間のゲル電気泳動後に染色および分析されました。粒子サイズの違いを把握するために、DNAテトラサンプルも動的光を使用した動的光散乱（DLS）装置でスキャンされました。

DNAテトラ促進細胞取り込み

この研究で設計されたさまざまな結合構造について、HT-29細胞による取り込み率を比較して、ドラッグデリバリー効率を計算しました。細胞の取り込み効率は、Doxの特徴的な蛍光スペクトル、つまり470nmの励起光と590nmの発光光を利用して評価および定量化されました。 2×10 ⁵ のHT-29セル / mLを24ウェルプレートに播種し、24時間培養しました。細胞をさまざまなDNAテトラ構造とともに10μMでさらに24時間インキュベートしました。次に培地を廃棄し、細胞をPBSで3回すすいだ。細胞を固定するために、4％パラホルムアルデヒドを直ちに室温で30分間共培養し、細胞を再度PBSで3回リンスしました。最後に、24ウェルプレートをレーザー共焦点顕微鏡で観察し、発光の光強度に基づいて細胞の取り込み効率を比較しました。

細胞毒性と抗がん効率

細胞毒性と抗癌効率は、DMSO中のMTTと細胞内コハク酸デヒドロゲナーゼの間で酸化還元反応が起こるMTTアッセイを使用して評価されました。 HT-29細胞を96ウェル培養プレートに播種し、24時間培養しました。

薬物担体としてのDNAテトラの細胞毒性のために、0〜100μMの濃度のDNAテトラ構造を含む培地を追加して、さらに24時間または48時間インキュベートしました。次に、100μLのMTT溶液（5 mg / mL）を各ウェルに添加し、混合物を37°Cで4時間インキュベートしました。次に液体を除去し、細胞を溶解して200μLのDMSOで溶解しました。上清の吸光度は、Microreaderによって570nmで測定されました。未処理のHT-29サンプルを対照群とみなしました。

葉酸またはDoxと結合したDNA四面体については、一方で、研究は安定性、生物学的安全性、および阻害効率に焦点を合わせました。一方、DNAテトラドックスのDoxが以前と同等の抗腫瘍特性を持っているかどうかも調査されました。したがって、DNAテトラ複合体の細胞毒性と抗腫瘍効率を評価した。それぞれ100μMの複合体をHT-29細胞とインキュベートしました。細胞サンプルを6時間ごとに収集し、MTTアッセイで検出して、インキュベーション期間の影響を評価しました。構造の変化による抗がん効果の違いに特に注意が払われました。さらに、葉酸-DNAテトラドックスで処理した後のHT-29の阻害に対する濃度の影響を、MTTアッセイを介して0〜200μMで評価しました。

ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー

DNAテトラデリバリーによって促進されるDoxによって誘導される細胞アポトーシスを特徴づけるために、処理された細胞からのタンパク質サンプルを加熱し、熱分解液を使用して分解し、定電流で100 Vの条件下で12％SDS-PAGEで分析し、サンプルを分離してからブロットしました。直径0.22μmのPVDFメンブレンに1時間。サンプルはスキムミルクで1時間ブロックされました。 PBSTで3回洗浄した後、サンプルをウサギ抗カスパーゼ-3とともに一晩インキュベートしました。次に、サンプルをヤギ抗ウサギIgG二次抗体で1時間プローブし、PBSTで洗浄し、Bio-Radタンパク質イメージングシステムでイメージングしました。さらに、GAPDHは細胞内で安定して発現するため、内部参照タンパク質として選択されました。

フローサイトメトリーをさらに利用して、MTTアッセイを介して選択した濃度および時点でのアポトーシスのレベルを定量化しました。 HT-29細胞を阻害剤とともに一定期間インキュベートした後、アネキシンV-PI二重染色法を使用した定量的フローサイトメトリーで測定しました。

細胞増殖の定量化

細胞計数法を使用して、細胞増殖を時間とともに定量化した。詳細には、葉酸-DNAテトラドックスで100μMで一定時間処理した後、細胞を0.25％トリプシンで30秒間消化し、次に等量の完全培地を加えて反応を停止させました。 1000 rpmで3分間遠心分離した後、上清を廃棄し、細胞を完全培地で再懸濁しました。各検出点の細胞数は、細胞増殖曲線を描くために、細胞カウントプレートを使用して光学顕微鏡下で記録されました。

統計分析

この調査では、違いの重要性は、学生の t を使用して決定されました。 テスト（両側; 2標本の等分散）。 P <0.05は、異なるグループ間の有意差を意味します。

結果

葉酸-DNAテトラドックスの調製

特定の合成プロセスでは、Doxをさまざまな比率でDNA四面体と混合して、Doxのロードと組み立てを完了しました（ w _m =543.52）および葉酸（ w _m =441.4）。図2aに示すように、Doxと葉酸は比較的低分子量で類似した分子量のモノマーであるため、四面体のDNAと1つの機能分子とのコンジュゲートの分子量はほぼ同等でした。しかし、四面体の4つのDNA頂点すべてと一緒に組み立てられたDoxまたは葉酸は、DNAテトラの分子サイズを明らかに増加させました。図2bに示すように、ほとんどのDNA四面体モノマーサイズは15nm未満でした。カップリング基の増加に伴い、DNAテトラの対称構造が破壊され、化合物の粒子サイズの媒体が大幅に増加しました。特に、葉酸-DNAテトラドックスのサイズ拡張により、直径の媒体が20nmに拡張されました。

異なる成分を持つDNAテトラの特性評価。 a 左から右へ：8％SDS-PAGEで画像化されたDNAラダー、DNAテトラ、葉酸-DNAテトラ、葉酸-DNAテトラ-Dox、およびDNAテトラ-Dox。 b 動的光散乱によって検出されたDNAテトラ、葉酸-DNAテトラ、葉酸-DNAテトラ-Dox、およびDNAテトラ-Doxのサイズ分布

ドラッグデリバリー効率

さまざまなDNAテトラ構造と24時間インキュベートした後、Doxの細胞内効率を蛍光イメージングで評価しました。ここで、細胞内赤色蛍光はDoxの特徴的な蛍光です。したがって、図3aに示すように、DNAテトラとインキュベートした細胞は蛍光シグナルを示さず、葉酸-DNAテトラ-DoxおよびDNAテトラ-Dox複合体とインキュベートした細胞の赤色シグナルはDoxよりも明らかに高かった。 DNAテトラから生じるDoxの大幅に強化された細胞取り込み効率は、膜の貫通を促進し、DoxとDNAテトラ間のコンジュゲートの細胞内安定性も促進しました。

さまざまな複合体と24時間インキュベートした後の、HT-29細胞の取り込み効率。 a 共焦点顕微鏡検出（赤はDoxの蛍光励起光、スケールバー=10μm）。 b 細胞の蛍光強度。 ** P

蛍光強度のさらなる定量分析（図3b）は視覚的所見を証明し、葉酸-DNAテトラ-DoxとDNAテトラ-Dox複合体（ P ）の間に有意差はありませんでした。 <0.05）。薬物と細胞の共培養の方法論は、葉酸の標的能力の完全な展示を妨げます。比較的高濃度であるため、葉酸受容体の特異的な認識が確認されました。これは、複雑な循環系を使用したinvivoアプリケーションで理論的にはより明白です。簡単に言えば、DNAテトラデリバリーはDoxの抗癌効果を保証しました。

細胞毒性と抗がん効果

まず、異なる濃度のDNAテトラと共培養したHT-29細胞の生存率を、MTTアッセイを使用して調べました。 HT-29細胞では、0〜100μMで24時間および48時間、DNAテトラ処理による明らかな細胞毒性はありませんでした（図4a）。したがって、ナノサイズのDNA四面体は、バイオセーフな薬物担体プラットフォームを提供しました。

HT-29細胞に対するDox複合体とDNAテトラの細胞毒性と抗腫瘍効率。 a さまざまな濃度のDNAテトラと24時間または48時間インキュベートしたHT-29細胞の生存率。 b 100μMでのDox複合体の抗腫瘍効率。 c さまざまな濃度の葉酸-DNAテトラドックスと24時間または48時間インキュベートしたHT-29細胞の生存率

次に、Doxの送達効率の違いから、葉酸-DNAテトラ-DoxとDNAテトラ-Doxは、48時間以内により有意な阻害効率を示しました（図4b）。効果的な抗癌成分が不足しているため、DNA四葉酸は48時間の共培養中に生存率のごくわずかな減少（<10％）をもたらします。 Doxは客観的に膜を貫通できないため、Doxによる細胞生存率の低下は他のグループよりも少なかった。特に、葉酸-DNAテトラドックスはインキュベーション後6時間でより早く有意な減少を示し、葉酸ターゲティングが薬物を膜に配置するのを助け、Doxをよりタイムリーに有効にすることを証明しました。対照的に、DNAテトラドックスはインキュベーションの12時間後に明らかに効果を発揮し始め、グループを標的にすることの重要性を示しています。

さらに、HT-29細胞を0〜200μMの葉酸-DNAテトラドックスで処理して、有効濃度を検出しました（図4c）。 HT-29細胞の細胞生存率は、複合体の濃度（0〜100μM）の増加とともに急速に低下しましたが、100μMと200μMの濃度に有意差はなく、葉酸-DNAテトラ-の用量依存的な方法を示しています。 Dox。100μMは抗腫瘍効果の効果的な濃度と見なすことができます。さらに、細胞の生存率は10、20、50μMのグループで24時間から48時間に大幅に変化しました。これは、インキュベーション期間が葉酸-DNAテトラドックスベースの抗がん効率に影響を与える要因でもあったことを示しています。

葉酸によって誘発されるアポトーシス-DNAテトラドックス

したがって、ウエスタンブロットアッセイ（図5a）に基づくと、葉酸-DNAテトラ-DoxおよびDNAテトラ-Doxによって誘導されるカスパーゼ-3の発現が有意に増加し、アポトーシスがDox-の主な方法であることが証明されました。細胞死を誘発しました。

異なる複合体で処理された後のアポトーシス関連カスパーゼ-3の細胞発現（ a ）およびDNAテトラ、Dox、DNAテトラDox、および葉酸-DNAテトラDox（ b ）とインキュベートした後のHT-29細胞のフローサイトメトリー – e ）

フローサイトメトリー（図5b–e）はさらに、100μMで葉酸-DNAテトラドックスと6時間インキュベートすると、68.7％のアポトーシスが誘導されることを証明しました。一方、DoxとDNA tetra-Doxによって誘導されたアポトーシスレベルは、同じインキュベーション条件でわずか32.8％と60.5％でした。

細胞増殖の阻害

MTTアッセイに基づいて、100μMがアポトーシス誘導の有効濃度であり、細胞増殖実験で選択されました。細胞増殖曲線（図6）に示されているように、細胞取り込みのプロセスに時間がかかるため、共培養の初期段階では細胞増殖の阻害が完全には示されませんでした。葉酸-DNAテトラ-Doxと6時間以上インキュベートした後、有意な阻害効果が示され、DNAテトラ強化エンドサイトーシスの存在が証明されました。一方、6時間は、図4bで検出された有効期間との比較期間です。

葉酸-DNAテトラ-Doxを100μMでさまざまな時間インキュベートすることによって誘導される細胞増殖の阻害

ディスカッション

DNA修飾の一般的な手段として、クリック化学反応は、高い反応効率、適切な制御、および容易な操作という利点がありました[21]。単一のブランドで表示された電気泳動図（図2a）は、クリック化学反応による共有結合によって高純度の生成物が得られたことを示しています。 Doxの蛍光特性により、invitroおよびinvivoで追跡可能になります。一方、腫瘍細胞内の蛍光は、細胞膜を貫通する過程で葉酸-DNAテトラドックスの安定性を間接的に証明しました。したがって、葉酸-DNAテトラ-Doxは、生物医学的用途に対応でき、安定していました。

DNAテトラには、薬物を細胞に送達する能力があります。この研究で使用されたすべてのDNA配列は、遺伝情報のためにコード化されていませんでした。したがって、すべての検査で遺伝子発現と細胞代謝の両方に対する副作用は報告されていません。一方、腫瘍細胞の表面で葉酸受容体が高発現しているため、DNAテトラ複合体の取り込み効率を高めるために、ドラッグデリバリーシステムの特定の標的分子として葉酸が選択されています。しかし、比較的高濃度のDNAテトラの状況では、葉酸受容体ターゲティングの利点はinvitroで完全には反映されていませんでした。したがって、in vivoアプリケーションでは、葉酸は複雑な循環系でのターゲティング効率を高める可能性がありました。

現在、抗がん剤は一般的に予期せぬ副作用をもたらすため、腫瘍細胞の標的化能力と送達効率を高める研究が注目されています[23、24、25]。以前の研究では、薬物を運ぶためのDNA四面体の能力は、その良好な適合性に基づいていることが示されていました。 DNA四面体は、好ましい修飾と適切な生体適合性を備えた人工容器です。この研究では、Doxと葉酸のDNA四面体とのカップリングの成功により、満足のいく阻害効果が達成され、HT-29細胞の明らかなアポトーシスがもたらされました。 DNAテトラを修飾し、薬物や標的分子と結合できるため、腫瘍細胞内の局所的な薬物濃度の濃縮が実現されました。上記の結果は、腫瘍細胞の良好な認識と、それに対応するDNAテトラデリバリーによる抑制効果の強化を証明しており、このナノサイズのドラッグデリバリーシステムは、より広範囲に使用できます。

結論

新たに開発されたドラッグデリバリー戦略として、ナノサイズのDNA構造は、低コスト、高安定性、および合成の実現可能性を備えています。その間、それは外因性の免疫活動の欠如のために生物学的に安全です。 DNA四面体カップリング戦略は、Doxの標的化された送達を促進し、結腸癌細胞に対するDoxの抗癌効率を高め、ドラッグデザインの有望なインスピレーションとアイデアを提供します。