HepG2腫瘍を有するヌードマウスにおける新規64Cu標識セラノスティックガドリニウムベースのナノプローブの評価

背景

肝細胞癌（HCC）は、世界で最も一般的な悪性腫瘍の1つです。 2012年には782,500人の新たに診断された肝臓がんの症例と745,500人の肝臓がんによる死亡があり、そのうち70〜90％がHCCでした[1]。ほとんどのHCC患者は、最初に診断された時点で進行期または末期に分類されるため、治癒的治療に適しているのは患者の20〜25％のみです[2、3]。したがって、肝臓がんの治療には、臨床的に実行可能な主要な技術として放射線療法を含む包括的な集学的治療が必要です[4]。

HCC患者に対する放射線療法の主な制限の1つは、周囲の正常な肝臓組織に対する放射線関連の毒性です。線量の増加に伴い、放射線誘発性肝疾患（RILD）を含む放射線治療合併症の発生率は、患者の生命にとって深刻な脅威となっています[5]。この問題を回避するための戦略の1つは、腫瘍組織に蓄積する可能性のある放射線増感剤を使用して、放射線に対する腫瘍細胞の感受性を高め、低線量の放射線によって腫瘍細胞が死滅する可能性を高めることです[6]。

2013年、Mignot etal。直径が小さく（約5 nm）、腎臓から迅速に排出されることが報告されている[7]、SPECT、PET、MRIの放射性または蛍光標識に結合できる、新しいタイプの多機能ガドリニウムナノ粒子AGuIXを構築しました。または蛍光イメージング。これらのナノ粒子は多数のガドリニウム（原子番号64）を持っているため、腫瘍放射線治療増感剤として使用できます[8]。多くの研究により、AGuIXナノ粒子は、invitroでさまざまな腫瘍細胞（放射線耐性細胞株を含む）の放射線療法に対する腫瘍細胞の感受性を高めることが示されています。増感率（SER）は1.1から2.5の範囲で観察されました[8]。強化された透過性と保持（EPR）効果により、ほとんどの腫瘍モデルでAGuIXの高い腫瘍取り込みと比較して、AGuIXの肝臓のバックグラウンドがはるかに低いことを考えると、このタイプのナノ粒子は、HCCの理想的な放射線治療増感剤に開発される大きな可能性を秘めています。 [9]。

これらのAGuIXナノ粒子は、主にMRIガイド下放射線療法（RT）用に開発されました。ただし、AGuIXの薬物動態は完全には理解されていません。放射線療法の線量効果を定量的に決定するには、これらのナノ粒子の生体内分布と薬物動態を定義することが重要です。 ⁶⁴ 陽電子放出断層撮影（PET）で最も一般的に使用される放射性同位元素の1つであるCuには、崩壊特性（ T ）があります。 _1/2 =12.4 h）これにより、小分子や、クリアランスの遅い大きなタンパク質やナノ粒子を柔軟に画像化できます。この研究では、AGuIXを ⁶⁴ で放射性標識しました。 腫瘍微小環境内での保持の大きさと期間をより正確に測定するための、HepG2担癌ヌードマウスにおけるそのinvivo生体内分布の初期評価のためのCu。 HepG2担癌ヌードマウスの放射線増感剤としてAGuIXを使用して概念実証研究をさらに実施するために、 ¹⁸ を使用しました。 F-FDG PET / CT、治療反応を監視し、AGuIXの有無にかかわらず放射線療法の前後のHepG2腫瘍のグルコース代謝を評価するための腫瘍代謝のための臨床的に証明された画像技術。

メソッド

一般情報

脱水、球状、および5 nm未満のガドリニウムナノ粒子（AGuIX）は、Nano-H（リヨン、フランス）から入手し、精製せずに使用しました。ナノ粒子は、組み込みのDOTAキレート剤を介してポリシロキサンシェルに結合したガドリニウム原子で構成されています。ナノ粒子を滅菌DEPC処理水（Invitrogen、USA）で再水和し、製造元の指示に従って使用するまで4°Cで保存しました。酢酸メゲストロールはSigmaChemicalCo。（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。ヒトHCC細胞株HepG2は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア大学、バージニア州、米国）から入手しました。 ⁶⁴ Cu同位体はウィスコンシン大学から購入しました。その他の化学物質および試薬は、Sigma Chemical Co.（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入し、さらに精製または処理せずに使用しました。体重16〜18gの6週齢の雄BALB / c無胸腺ヌードマウスをチャールズ川から購入しました。動物実験は、バージニア大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

透過型電子顕微鏡（TEM）

上記の溶液中の濃度0.5mMのAGuIXナノ粒子を、HepG2細胞と1時間インキュベートしました[10]。次に、残留ナノ粒子を0.1 Mのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、遠心分離によって精製しました。ナノ粒子を含む細胞ペレットは、イメージングのために0.1 M Pb中の4％ホルムアルデヒドと1％グルタルアルデヒドで染色されました。

⁶⁴ Cu放射性標識

AGuIXナノ粒子は ⁶⁴ で放射性標識されました Cu同位体。まず、200μlのAGuIXナノ粒子溶液（10μmoleのAGuIX）を100μlの0.5MのNH ₄ と混合しました。 OAcバッファー（pH =5.5）。 5分間のインキュベーション後、1〜3mCiの ⁶⁴ CuCl ₂ 0.1 NのHClを加え、反応混合物を37°Cで1時間インキュベートしました。次に、反応混合物を、3k Amicon Ultra Centrifugal Filter（Merck Millipore）で濾過することにより滅菌した。放射化学的純度は、前述のように移動相として20mMのクエン酸を使用するiTLCによって決定されました[11]。

腫瘍モデル

HepG2細胞は、1 mMのピルビン酸ナトリウム、1 mMの非必須アミノ酸、および10％FCS（Life Technologies、Inc.、Grand Island、NY、USA）を含むMEMで培養しました。細胞は、空気/ CO ₂ の加湿雰囲気で維持されました。 （19/1）、2〜3日ごとに継代培養されました。

HepG2細胞（5×10 ⁶ ）を0.1 mlのHBSSに収集し、これらの細胞懸濁液を27ゲージの針を使用して各ヌードマウスの右脇腹に皮下注射しました。細胞注射を受けたヌードマウスの耳は、識別のためにタグ付けされました。一般的に、固形腫瘍はHepG2細胞の注射から2週間後に見え始めました。

^{64の担癌マウスにおける生体内分布} Cu-AGuIX

担癌ヌードマウス（オス5匹とメス4匹）をランダムに3つのグループに分け、 ⁶⁴ を腹腔内注射しました。 Cu-AGuIX、約0.9 MBqの活性、0.2mLの容量。注射の9、21、および40時間後に、イソフルラン吸入による麻酔下で頸椎脱臼によりマウスを犠牲にしました。関心のある臓器（心臓、筋肉、肺、腎臓、脾臓、肝臓、腫瘍など）を解剖して秤量し、心室から100μLの血液を採取しました。各サンプルの活性は、γカウンター（CRC-7、Capintec Inc.、ニュージャージー州、米国）を使用して決定されました。さまざまな組織や臓器における放射能の分布が計算され、グラムあたりの注射線量のパーセンテージ（％ID / g）として表されました。

^{64のマイクロPETイメージング} ヌードマウスのCu-AGuIX

⁶⁴ 生理食塩水の0.2mL溶液中のCu-AGuIX（22.2 MBq）を、各担癌ヌードマウスに腹腔内注射しました。各動物は、PETシステム（SuperArgus、Sedecal、スペイン）のベッドにうつ伏せに置かれました。 PET画像は、 ⁶⁴ の注入後9時間と21時間のさまざまな期間で取得されました。 Cu-AGuIXは、誘導用に4〜5％のイソフルラン、維持用に1〜2％の麻酔下で、どちらも酸素とバランスが取れています。

照射設定と ¹⁸ 異種移植片のF-FDGPET評価

放射線療法中のAGuIXの放射線増感を評価するためのPETイメージング研究では、HepG2腫瘍を有する12匹のヌードマウスを3つのグループに分け、グループごとに4匹のマウスをランダムに割り当てました。ベースラインPETイメージングでは、マウスに ¹⁸ を注射しました。 F-FDG（16.4±4.7 MBq）を尾静脈から通し、全身麻酔下で10分間のPET静止画像を30分間のp.i.で維持しました。 （注射後）小動物PETスキャナー（Madiclab、山東省、CN）を使用。 PET画像は、3D OSEMアルゴリズム、ボクセルサイズ0.91×0.90×0.90 mm、視野中心の空間分解能1.3mmを使用して再構成されました。

照射研究では、各グループに、0.1 mLの生理食塩水、1 mg（0.1 mL）のAGuIX、および10 mg（0.1 mL）のAGuIXを尾静脈から注射しました。注射の1時間後、これらのヌードマウスにX線源（X-RAD 320、Precision X-Ray、ノースブランフォード、コネチカット州、米国）を使用して照射しました。総線量6Gyで1.2Gy /分の線量率のmmAlフィルター。翌日、同じ照射プロトコルをマウスで繰り返した。 2回の照射治療の1日後、これらのマウスは ¹⁸ で画像化されました。 F-FDG（11.1±1.0 MBq）最初のPETスキャンと同じプロトコルを使用したPET。標準化取込値max（SUVmax）は、腫瘍領域（Madiclab、山東省、CN）の関心領域（ROI）を描画することによって決定されました。

統計分析

すべての実験は3回行われ、結果は平均±標準誤差（SE）として表されました。統計的に有意な差は、両側の対になっていない t を使用して計算されました。 テストまたは一元配置分散分析。 p <0.05（*）および<0.01（**）の値は有意であると見なされました。

結果と考察

造影剤増強MRIは、AGuIXベースの画像誘導放射線治療で広く使用されていますが、ナノ粒子の薬物動態の測定時間が長いため、ナノ粒子の濃度の検出限界が懸念されます。はるかに感度が高く、定量能力が高いPETは、濃度のダイナミックレンジを、造影剤増強MRIでは検出できないはるかに低いナノモル濃度にまで拡張します。このレポートでは、 ⁶⁴ を使用したAGuIXの生体内分布と薬物動態のラベリングと評価について説明しました。 潜在的なPET画像誘導放射線療法のためのCu。

TEM研究

細胞インキュベーション研究では、公開されたデータに基づいて0.5 mMのAGuIXナノ粒子の濃度を選択し、AGuIXナノ粒子をHepG2細胞と1時間インキュベートしました[10]。 HepG2細胞の細胞質への取り込みが観察されました（図1）。この結果は、AGuIXナノ粒子を他のタイプの細胞株とインキュベートした以前に発表された研究と一致しています[12、13]。また、AGuIXがHepG2細胞で優れた分散形状を示したことも観察されました。これは、AGuIXが細胞内で安定していることを示唆しています。

HepG2細胞内でのAGuIXの局在。 a 。 TEM画像（×6500）は、HepG2細胞へのAGuIXの取り込みを示しています。 b 。拡大TEM画像（×52000）は、細胞質内のAGuIXナノ粒子の分布を示しています

放射性標識

標識は、キレート剤DOTAを内蔵した現在の形式のAGuIXを使用して、1ステップで98％を超える放射化学的収率で便利に実行されました。 iTLCテストを使用して、元のスポットに保持された放射性標識ナノ粒子を特定したところ、標識により、比放射能と放射化学的純度がそれぞれ約3〜10 MBq /μmolと98％になりました。各合成で平均50〜100MBqの最終生成物が得られました。

生体内分布研究

⁶⁴ Cu-AGuIXナノ粒子を腹腔内注射し、HepG2担癌ヌードマウスの生体内分布を測定し、以前に報告されたものと比較しました。図2に示すように、各臓器/組織の生体内分布は、組織1グラムあたりの投与量（注入量）のパーセンテージ（％ID / g）として表されます。結果は、 ⁶⁴ Cu-AGuIXは腫瘍に蓄積し、9、21、40 hp.iから優れた保持力を示します。それぞれ7.82±1.50、8.43±6.23、6.84±1.40％ID / gの取り込みがあります。この長期的な保持は、細胞内でのAGuIXナノ粒子の取り込みに起因する可能性があり、したがって ⁶⁴ に関連しています。 セル内のCuの滞留。他の報告[11、14]と一致して、異なる同位体放射性標識および注入経路が使用されましたが、 ⁶⁴ Cu放射性標識ナノプローブは、他の正常な臓器や組織での取り込みがはるかに低く（1％ID / g未満）、クリアランスが速いことを示しました。まとめると、これらのデータは ⁶⁴ の潜在的な使用を示唆しています これらのナノ粒子が放射線増感剤として使用される放射線療法の計画を導くのに役立つAGuIXの生体内分布と薬物動態を測定するためのツールとしてのCu標識AGuIX。この研究では、腹腔内注射を使用したため、腎臓への取り込みは他の人が報告したよりもはるかに低くなっています[11、14]。

⁶⁴ の生体内分布 HepG2腫瘍を有するヌードマウスにおけるCu-AGuIX。各組織/臓器での放射能取り込みは、 ⁶⁴ の腹腔内注射後9、21、および40時間で％ID / gで表されました。 Cu-AGuIX（平均±SD、 n =3）

ヌードマウスのマイクロPETイメージング

マイクロPETイメージングは​​、 ⁶⁴ の高い取り込みを示しました Cu-AGuIXは、担癌ヌードマウスの腫瘍、腎臓、肝臓で観察されました（図3）。 ⁶⁴ の投与後、腫瘍ははっきりと見えました。 Cu-AGuIXは9時間で、バックグラウンドが減少するため、注入後21時間までさらに明確になります。

腫瘍マウスのマイクロPET画像。腫瘍のあるヌードマウスのPET画像（上、冠状面、下、横断面）（赤い矢印 ） ⁶⁴ の腹腔内注射後、9時間（左）と21時間（右）に取得されました。 Cu-AGuIX

¹⁸ AGuIXの有無にかかわらず照射された異種移植片のF-FDGPET / CT評価

AGuIX投与の有無にかかわらず、さまざまな放射線療法の反応を評価するには、 ¹⁸ F-FDG PET / CTイメージングを実行して、2つの異なる投与量でAGuIX注射を行った場合と行わなかった場合の照射後の代謝変化を監視しました。 ¹⁸ の減少 異種移植片でのF-FDGの取り込みは、照射されたすべてのマウスで観察されました（図3）。放射線増感の有効性の主要な指標であるSUVmax（B / A）は、通常の生理食塩水、1 mgのAGuIX、および10 mgのAGuIXを投与されたマウスでそれぞれ1.03±0.03、1.04±0.04、および1.24±0.02でした（図。 4）。 10 mgのAGuIXグループでは、1 mgのAGuIXグループと比較してT / L（B / A）が大幅に増加しました（ p <0.001、独立したサンプルテスト）および通常の生理食塩水グループ（ p <0.001、独立したサンプルテスト）。 1 mgのAGuIXと通常の生理食塩水（ p ）を投与されたグループ間でT / L（B / A）に有意差はありませんでした。 =0.83、独立したサンプルテスト）（図5）。これらの結果は、異種移植片のグルコース代謝が、AGuIXの10mg注射を受けた照射マウスで主に抑制されたことを示唆している。放射線療法は炎症を誘発する可能性がありますが、これもFDGの取り込みにつながる可能性があります。この研究では、全身エラーを相殺するために、すべてのグループに同じ放射線量と同じ時点のRT治療後を選択します。したがって、RTによって引き起こされる炎症の程度は、3つのグループすべてでほぼ同じである必要があり、炎症によって誘発されるFDG取り込みへの寄与もほぼ同じレベルである必要があります。この懸念を回避するために、他のPETイメージングプローブを使用することができます。それにもかかわらず、これらの発見は、AGuIXがHepG2担癌マウスの腫瘍放射線増感剤として使用できるという概念実証を提供します。

¹⁸ 放射線照射前後のマウスのF-FDGPET画像。 ¹⁸ F-FDG PET画像は、照射前（左）と照射後1日（右）の各パネルで比較され、3つのパネルは、通常の生理食塩水（左パネル）、1 mgのAGuIX（1 mg）の尾静脈注射によって注射されたマウスの画像を示しました。中央のパネル）、および10 mgのAGuIX（右のパネル）。各画像に同じカラースケールが適用されました

¹⁸ 照射前後のF-FDGPET定量評価。 T / L（B）、照射前のSUVmax（腫瘍）とSUVave（肝臓）の比率。 T / L（A）、照射後のSUVmax（腫瘍）とSUVave（肝臓）の比率。 T / L（B / A）、T / L（B）とT / L（A）の比率。 AGuIX（1 mg）、1mgのAGuIXを注射。 AGuIX（10 mg）、10mgのAGuIXを注射

最後に、核イメージングプローブ自体から吸収される放射線量も、臨床使用への移行を検討する際の重大な懸念事項です。 AGuIXナノ粒子の現在の形態は、in vivoでの代謝と毒性について徹底的に調査され、FDAによってヒトの研究に承認されています[15]。 ⁶⁸ のいずれかにラベルを付ける Ga（〜1 h減衰半減期）または ⁸⁹ Zr（78時間の減衰半減期）、静脈内注射によるマウスの生体内分布研究の結果は、 ^{68 > 89 までに最大72時間までGa Zr [11、14]。腎臓による迅速な排泄は一般的に有益ですが、腎臓は放射線に敏感であるため、腎臓がこの高い取り込みに耐えられるかどうか、およびこのような長期間の保持のメカニズムは不明です。この研究では、腎臓への取り込みは約5％ID / gであり、調査期間全体で肝臓と腫瘍よりも低かった。この違いは、注入経路が異なるためと考えられます。腹腔内注射により、AGuIXナノ粒子は腹膜に継続的に吸収されたが、静脈内注射により、ナノ粒子は腎臓に迅速に排泄された。各臓器や組織の放射線感受性は異なるため、臨床使用に変換するための放射性セラノスティックプローブの最終決定には、さらに詳細な線量測定研究が必要です。}

結論

AGuIXナノ粒子は ⁶⁴ で正常に標識されています 高収率のCu。生体内分布の研究では、放射性トレーサー ⁶⁴ Cu-AGuIXは腫瘍に高い蓄積を示し、ヌードマウスのHepG2異種移植片に長期間保持され、HCCにおける画像誘導放射線治療の潜在的なセラノスティックナノプローブであることを示唆しています。 ¹⁸ の大幅な削減 AGuIXを注射した腫瘍性ヌードマウスのグループにおける放射線療法後のF-FDG取り込みは、AGuIXをHepG2担癌マウスの放射線療法を強化するための腫瘍放射線増感剤として使用できるという証拠を提供しました。臨床応用への潜在的な変換のための放射線毒性を決定するために、線量測定に関するさらなる調査が必要です。