マイクロRNA-499-5pがSox6を標的として敗血症誘導性肺障害における肺機能を回復

概要

背景

マイクロRNA（miR）は敗血症に関与することが知られている。本研究では、性決定領域Y関連高移動性グループボックス6（Sox6）を標的とするmiR-499-5pが、マウス敗血症誘導性肺障害に及ぼす保護効果を検討した。

方法

盲腸結紮穿孔（CLP）により敗血症誘導性肺障害モデルを確立した。マウス肺組織の湿乾重量比（W/D比）、miR-499-5p、Sox6、カスパーゼ-3、カスパーゼ-9発現を測定した。肺障害スコア、コラーゲン線維、肺線維化度を評価し、肺組織の細胞アポトーシスを測定した。さらに、喀痰洗浄液（BALF）と肺組織の炎症因子含量と酸化ストレス指標を、機能喪失および機能獲得アッセイで検出した。miR-499-5pとSox6の標的関係を検証した。

結果

敗血症誘導性肺障害マウスの肺組織ではW/D比とSox6が増加し、miR-499-5pは減少していた。miR-499-5pの回復またはSox6の枯渇により、肺組織病理が改善し、肺障害スコア、コラーゲン線維、肺線維化度、TUNEL陽性細胞、カスパーゼ-3/9タンパク発現、BALFおよび肺組織の炎症因子含量、肺組織の酸化ストレス応答が減少した。miR-499-5pはSox6を標的とした。

結論

miR-499-5pの高発現は、Sox6を枯渇させることで肺組織の細胞アポトーシスを減弱させ、敗血症誘導性肺障害マウスの炎症を抑制する。miR-499-5pは敗血症誘導性肺障害の潜在的マーカーおよび治療標的となり得る。

はじめに

敗血症は感染の結果として生じる全身性炎症であり、急性呼吸窮迫症候群を含む多臓器不全を引き起こす[1]。重度の低血圧、進行性低酸素血症、組織損傷、炎症変化が特徴である[2]。肺は敗血症において最も重要かつ脆弱な臓器であり、急性肺障害（ALI）は敗血症誘導性炎症疾患として頻発する[3]。敗血症誘導性ALIの重症度は、肺胞毛細血管ネットワークの透過性障害による酸素供給低下に起因する[4]。肺細胞アポトーシスは敗血症誘導性肺障害の重要な因子である[5]。敗血症誘導性ALIの病態生理は不明であり、支持療法と抗生物質のみが利用可能で、敗血症による高死亡率への影響は限定的である[6]。

マイクロRNA（miRNA）は約18–24ヌクレオチドからなる低分子非コード内因性RNAであり、幅広い細胞機能を制御し、特定遺伝子の標的領域に結合してmRNA翻訳/転写を阻害または活性化することで発現を制御する[7]。miR-499-5pはミオシンコードmiRNAの新規メンバーとして最近発見された[8]。血清miR-499-5pレベルが敗血症患者の臓器不全指標となり得るとの報告[9]、miR-499-5p発現が敗血症誘導性心筋アポトーシスに関与するとの報告[10]がある。性決定領域Y（SRY）関連高移動性グループ（HMG）（SOX）ファミリーは、SRYとの配列同一性が50%以上のHMGクラスDNA結合ドメインを含む遺伝子セットで定義される[11]。Sox6転写因子はSRY関連HMGボックスファミリーの一員で、発生過程で多組織に発現し、増殖前駆細胞から機能的成熟細胞への移行で重要な役割を果たす[12]。Sox6上昇が敗血症誘導性心筋アポトーシスに関与するとの報告[10]がある。Sox2とSox4発現がヒト小細胞肺癌で上昇することが知られている[13,14]が、Sox6と敗血症誘導性肺障害の関係はさらなる研究が必要である。本研究では、Sox6を標的とするmiR-499-5pの敗血症誘導性肺障害マウスに対する保護効果を探索した。

材料と方法

倫理基準の遵守

すべての動物実験は米国国立衛生研究所の実験動物飼育・使用ガイドラインに準拠した。プロトコルは威海市立病院、済南大学医学部動物実験倫理委員会の承認を得た。

実験動物

健康な雄性特定病原体フリー（SPF）グレードBALB/cマウス（6–8週齢、18–22 g）を山東大学実験動物センター（山東、中国）から購入した。環境は24 ± 2℃、12時間明暗サイクルで維持し、無菌餌と無菌水を自由摂取させた。7日間の順化飼育後、実験を開始した。

盲腸結紮穿孔（CLP）による敗血症誘導性肺障害モデルの確立

マウスをシャム群（n=8）とモデル群に無作為割付した。手術前12時間絶食し、1%ペントバルビタールナトリウム（70 mg/kg）を腹腔内投与で麻酔した。麻酔効果、呼吸、心拍を確認し、頭部と四肢を固定して仰臥位とし、ヨード綿球で腹部皮膚を準備・消毒した。モデル群では腹部正中線中央に1.0 cmの縦切開を行い、腹腔を開いて盲腸を露出させ（腸間膜血管を損傷しないよう注意）、盲腸末端から1/2の位置を1-0シルク糸で結紮し、腸間膜対側縁を16号穿刺針で穿孔した。適量の腸内容物を押し出し、盲腸を腹腔内に戻し、切開を縫合した。シャム群では腹腔開腹後、盲腸を露出させるのみで元に戻した。術後、全例に0.9%生理食塩水1 mLを皮下投与し、別ケージで飼育した。

生体内トランスフェクション

モデル作成前、マウスを7群（n=8）に割り付けた：モデル群、miR-499-5pアゴミル群、アゴミル陰性対照（NC）群、si-Sox6群、si-NC群、miR-499-5pアゴミル+oe-Sox6群、miR-499-5pアゴミル+oe-NC群。モデル作成1時間前、群分けに従って処理した。1%ペントバルビタールナトリウムで麻酔し、45°傾斜仰臥位で固定、舌を横にずらして気道を確保した。頸部前面皮膚を消毒・切開して気管を露出させ、トランスフェクションコンプレックス（50 μL）をマイクロサンプラーで吸引し（群分けに従い滴下、モデル群には同量のPBSを滴下）、気管内にゆっくり滴注した。トランスフェクション後、マウスを垂直に回転させコンプレックスを肺全体に分布させた[15]。過程中、呼吸と心拍を監視し、停止時は即座に中断して気道確保、安定後に再開した。miR-499-5pアゴミル、そのNC、Sox6対応プラスミドは上海GenePharma社製（上海、中国）。トランスフェクション後、1日間別ケージ飼育後、安楽死させた。1%ペントバルビタールナトリウムで麻酔、仰臥位固定後、腹大動脈穿刺で安楽死させた。胸腔を開き、気管と右主気管支を結紮、右主気管支を切断して右肺を摘出した。右肺下葉を10%中性ホルマリンで病理検査用に保存、中葉を迅速に秤量して湿重量（W）を測定、56℃で72時間乾燥後乾燥重量（D）を測定しW/D比を算出した。右上葉は液体窒素保存しmRNA・タンパク検出用とした。左肺を0.4 mL生理食塩水で3回洗浄し、約1 mLのBALFを回収、1.5 mLエッペンドルフチューブに移し氷上保存。1500 rpm、5分遠心後、新しいチューブに移し-80℃保存して炎症因子検出用とした。

さらに、マウスを3群（n=10/群）に分けた：シャム群、モデル群、miR-499-5pアゴミル群（手術1時間前に気管内投与）。生存率を12時間ごと、計7日間監視し、miR-499-5pの毒性を評価した[16]。

ヘマトキシリン-エオシン（H&E）染色と障害スコア

肺組織をパラフィン切片とし、H&E染色後光学顕微鏡で観察した。肺障害スコア（肺胞充血、出血、肺胞腔または血管壁での好中球浸潤/凝集、肺胞壁肥厚および/または透明膜形成）を米国胸部学会の病理スコアリングシステムで評価した。0点：病変なし/ごく軽度、1点：軽度、2点：中等度、3点：重度、4点：極めて重度。4項目の合計を肺障害総スコアとした[17]。

マッソン染色とスコア

肺組織をパラフィン切片（4 μm）とし、マッソン染色[18]を行った。コラーゲン線維、粘液、軟骨は青色、細胞質、筋肉、セルロース、グリアは赤色、核は青黒色に染まる。半定量的Ashcroftスコアリングシステム[19]を用いた：0点：正常肺、1点：肺胞/気管支壁の軽度線維性肥厚、3点：肺構造損傷なしの中等度肥厚、5点：肺構造損傷を伴う線維化悪化（線維帯/塊形成）、7点：重度肺構造損傷と広範囲線維化（線維帯/塊）、8点：全領域線維化充填。

TUNEL染色

肺組織アポトーシスをTUNELキット（ロシュ診断、ドイツ）で検出し、光学顕微鏡で観察した。アポトーシス細胞核は茶色に染まる。アポトーシス指数はTUNEL陽性細胞の割合で示した[20]。

免疫組織化学

肺組織切片をキシレンで脱パラフィン、3%過酸化水素で処理、ヤギ血清でブロッキングした。一次抗体としてカスパーゼ-3（ab13847、1:500）、カスパーゼ-9（ab32539、1:250）、SOX6（ab30455、1:500、すべてAbcam、米国）を用い、光学顕微鏡（ライカ、米国）で撮像、Image Pro Plus 6.0（メディアサイバネティクス、米国）で解析した[21]。

逆転写定量PCR（RT-qPCR）

総RNA抽出と濃度測定にOMEGAキット（ソーラビオ、北京、中国）を用いた。相補的DNA（cDNA）はRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（サーモフィッシャー、米国）に従い逆転写で作製した。プライマーはInvitrogen（カールスバッド、米国）で設計（表1参照）。PCR反応はFastStart Universal SYBR Green Master (Rox) Kit（ロシュ）に従って実施し、2⁻ΔΔCt法で定量解析した。U6をmiR-499-5pのローディングコントロール、GAPDHを他遺伝子の内部パラメータとした[22]。

ウェスタンブロット解析

RIPAリシスバッファーで肺組織から総タンパクを抽出し、BCA法で濃度測定した。タンパク試料（30 μg）を10% SDS-PAGEで電気泳動、PVDF膜に転写、5%脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体：Sox6（ab30455、1:1000、Abcam）、カスパーゼ-3（9661、1:1000、CST）、カスパーゼ-9（9502、1:1000、CST）、TNF-α（ab6671、1:1000、Abcam）、IL-1β（16806-1-AP、1:500、プロテインテック）、IL-6（ab6672、1:1000、Abcam）、GAPDH（sc-32233、1:1000、サンタクルーズ）で反応させた。二次抗体（1:2000）でインキュベート後、ECL法で検出した[23]。

ELISA

BALF中のIL-1β、IL-6、TNF-α濃度をELISAキット（ボスター、湖北、中国）で測定し、450 nmで比色定量した。

酸化ストレス指標測定

液体窒素保存肺組織を秤量し、低温下で生理食塩水で希釈・ホモジナイズ、4℃、3000 rpm、20分遠心し上清を採取した。ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性をMPO検出キット（南京建成生物工学研究所、中国）で、マロンジアルデヒド（MDA）、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）、カタラーゼ（CAT）を同研究所提供キットで測定した。

二重ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ

生物学予測サイト（https://www.targetscan.org/vert_72/）でSox6がmiR-499-5pの標的遺伝子と予測された。miR-499-5pとSox6 mRNA 3'非翻訳領域（UTR）間に4つの結合サイトが存在した。pmiR-RB-REPORT-Sox6野生型（WT）と変異型（MUT）ベクターを広州RiboBio社（広東、中国）で構築し、対応するルシフェラーゼレポータープラスミドを作製した。TC-1細胞（マウス肺上皮細胞、1×10⁵ cells/well、上海一研生物科技、上海、中国）を24ウェルプレートに播種し、miR-499-5pアゴミルまたはアゴミル-NC、pmiR-RB-REPORT-Sox6 WTまたはMUTをリポフェクタミン2000で共トランスフェクションした。二重ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイシステム（プロメガ、米国）でルシフェラーゼ活性を測定した。

統計解析

すべてのデータをSPSS 21.0（IBM、米国）で解析した。測定データは平均±標準偏差で示した。2群間比較はt検定、多群比較は一元配置分散分析（ANOVA）、ANOVA後の多重比較にはTukey法を用いた。生存曲線はKaplan-Meier法で作成。P < 0.05を統計的有意差とした。

結果

敗血症誘導性肺障害マウス肺組織ではW/D比とSox6が増加しmiR-499-5pが減少

miR-499-5pの毒性をマウスで検証し、敗血症マウスの生存時間を調べた。結果（図1a）シャム群の7日間生存率は100%、敗血症マウスでは低下した。miR-499-5p治療後、敗血症マウスの生存率は改善した。肺組織W/D比（図1b）：シャム群対比でモデル群で有意上昇（P < 0.05）。アゴミルNC群およびsi-NC群対比で、miR-499-5pアゴミル群とsi-Sox6群で有意低下（ともにP < 0.05）。miR-499-5pアゴミル+oe-NC群対比で、miR-499-5pアゴミル+oe-Sox6群で有意上昇（P < 0.05）。

miR-499-5pとSox6発現（図1c-f）：シャム群対比でモデル群ではmiR-499-5p減少、Sox6上昇（ともにP < 0.05）。アゴミルNC群対比でmiR-499-5pアゴミル群ではmiR-499-5p上昇、Sox6低下（ともにP < 0.05）。si-NC群対比でsi-Sox6群ではSox6低下（P < 0.05）。miR-499-5pアゴミル+oe-NC群対比でmiR-499-5pアゴミル+oe-Sox6群ではSox6劇的上昇（P < 0.05）。

免疫組織化学で肺組織Sox6タンパク質を評価（図1g）。シャム群対比でモデル群で上昇（P < 0.05）；アゴミルNC群およびsi-NC群対比でmiR-499-5pアゴミル群とsi-Sox6群で低下（ともにP < 0.05）；miR-499-5pアゴミル+oe-NC群対比でmiR-499-5pアゴミル+oe-Sox6群で上昇（P < 0.05）。

miR-499-5p回復またはSox6枯渇により肺病理改善、肺障害スコア・コラーゲン線維・肺線維化度減少

H&E染色結果（図2a）：シャム群では肺組織構造は完 intact、肺胞中隔は基本的に明確で浮腫や炎症なし、肺胞腔は明瞭。モデル、アゴミルNC、si-NC、miR-499-5pアゴミル+oe-Sox6群では、大部分の肺胞腔に滲出、浮腫、出血が見られ、肺間質に大量の炎症細胞浸潤を認めた。miR-499-5pアゴミル、si-Sox6、miR-499-5pアゴミル+oe-NC群ではモデル群対比で病変が軽減した。

肺障害スコアとAshcroftスコア（図2b、d）：シャム群対比でモデル群では肺障害スコアと肺線維化度が明確に上昇（P < 0.05）。アゴミルNC群およびsi-NC群対比でmiR-499-5pアゴミル群とsi-Sox6群では両スコア低下（ともにP < 0.05）。miR-499-5pアゴミル+oe-NC群対比でmiR-499-5pアゴミル+oe-Sox6群では両スコア有意上昇（P < 0.05）。

マッソン染色結果（図2c）：シャム群では少量の青色コラーゲン線維。モデル、アゴミルNC、si-NC、miR-499-5pアゴミル+oe-Sox6群ではコラーゲン線維増加。miR-499-5pアゴミル群、si-Sox6群、miR-499-5pアゴミル+oe-NC群ではモデル群対比で減少。

miR-499-5p回復またはSox6枯渇によりTUNEL陽性細胞、カスパーゼ-3/9タンパク発現減少

ウェスタンブロット、TUNEL染色、免疫組織化学結果（図3a-f）：正常核は青色、アポトーシス核は濃淡の茶色。シャム群対比でモデル群ではTUNEL陽性細胞、カスパーゼ-3、カスパーゼ-9タンパク発現が上昇（すべてP < 0.05）。アゴミルNCおよびsi-NC群対比でmiR-499-5pアゴミル群とsi-Sox6群ではすべて低下（すべてP < 0.05）。miR-499-5pアゴミル+oe-NC群対比でmiR-499-5pアゴミル+oe-Sox6群ではすべて上昇（すべてP < 0.05）。

miR-499-5p回復またはSox6枯渇によりBALFおよび肺組織のTNF-α、IL-1β、IL-6含量減少

ELISAとウェスタンブロット結果（図4a-g）：モデル群ではシャム群対比でTNF-α、IL-1β、IL-6が上昇（すべてP < 0.05）。アゴミルNCおよびsi-NC群対比でmiR-499-5pアゴミル群とsi-Sox6群ではすべて低下（すべてP < 0.05）。miR-499-5pアゴミル+oe-NC群対比でmiR-499-5pアゴミル+oe-Sox6群ではすべて上昇（すべてP < 0.05）。

miR-499-5p回復またはSox6枯渇によりSOD、CAT、GSH-Px活性上昇、MDAとMPO含量減少

酸化ストレス指標測定結果（図5a-e）：シャム群対比でモデル群ではSOD、CAT、GSH-Px活性低下、MDAとMPO含量上昇（すべてP < 0.05）。アゴミルNCおよびsi-NC群対比でmiR-499-5pアゴミル群とsi-Sox6群ではSOD、CAT、GSH-Px活性上昇、MDAとMPO低下（すべてP < 0.05）。miR-499-5pアゴミル+oe-NC群対比でmiR-499-5pアゴミル+oe-Sox6群ではSOD、CAT、GSH-Px活性抑制、MDAとMPO上昇（すべてP < 0.05）。

miR-499-5pがSox6を直接標的とする

バイオインフォマティクスサイトTargetScanで予測したところ、miR-499-5pとSOX4/6の間に標的結合サイトが存在した。RT-qPCRで検証したところ、シャム群対比でモデル群ではSOX2/4/6発現上昇、SOX6が最も顕著（すべてP < 0.05）；アゴミルNC群対比でmiR-499-5pアゴミル群ではSOX2変化なし、SOX4低下、SOX6が最も低下（追加ファイル1：図S1a、b）。したがって、最終的にSOX6をmiR-499-5pの標的遺伝子として選定した。生物学予測サイトでmiR-499-5pがSox6を標的とすることを確認（図6a）。二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ（図6b）では、対照群対比でpmiR-RB-REPORT-Sox6 WTベクターとmiR-499-5pアゴミルをTC-1細胞に共トランスフェクションした場合、ルシフェラーゼ活性が明確に抑制された（P < 0.05）。一方、miR-499-5pアゴミルとpmiR-RB-REPORT-Sox6 MUTベクター、またはアゴミル-NCとpmiR-RB-REPORT-Sox6 WTベクターの共トランスフェクションではルシフェラーゼ活性に明確な差はなかった（P > 0.05）。これはmiR-499-5pがSox6 3'UTR WTに直接結合し、ルシフェラーゼ活性を阻害することを示唆する。

考察

敗血症はショックと多臓器不全症候群の重大な原因であり、ALIは最も頻繁かつ重要な臓器合併症である[24]。敗血症誘導性ALIは最も早期に、最も高い頻度で発症し、急速に進行し、致死率が高く、現時点で有効な治療法はない[25]。先行研究では、miR-218上昇が炎症因子分泌を抑制し敗血症誘導性肺障害を予防すること[26]、miR-146a上昇がALIの炎症を軽減すること[27]、miR-125b回復がALIマウスの生存率向上と炎症抑制をもたらすこと[28]が報告されている。miRNAの肺障害における役割は強調されているが、敗血症誘導性肺障害におけるmiR-499-5pの詳細なメカニズムはほとんど研究されておらず、本研究ではその治療可能性に焦点を当てた。また、Sox6上昇が敗血症誘導性心筋アポトーシスに関与するとの証拠[10]もあり、敗血症誘導性肺障害の深い理解が求められる。本研究では、Sox6を標的とするmiR-499-5pの敗血症誘導性肺障害マウスに対する保護効果を議論した。

本研究では肺組織W/D比を算出し、マウス肺組織のSox6とmiR-499-5p発現を評価した。結果、敗血症誘導性肺障害マウス肺組織ではW/D比とSox6が増加し、miR-499-5pが減少した。最近の研究では、軽症敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック患者のmiR-499-5p発現が正常対照と比較して著しく低下すること[9]、非小細胞肺癌（NSCLC）組織でmiR-499-5p発現が著しく低下し不良臨床転帰と関連すること[29]が報告されている。Sox6発現が肺癌組織で正常組織対比上昇すること[30]、糖尿病性腎症マウス腎組織でSox6発現が著しく上昇すること[31]も報告されている。本研究でもmiR-499-5pがSox6を直接標的とすることを示した。重要な知見として、Sox6はmiR-499の標的遺伝子である[10]。別の研究ではSox6がmiR-499-5pの標的遺伝子であり、miR-499-5p回復がSox6発現を抑制することが示されている[32]。しかし、敗血症マウス肺組織におけるmiR-499-5pとSox6の標的関係は未解明であった。

さらに、miR-499-5p回復またはSox6枯渇により、肺病理改善、肺障害スコア・コラーゲン線維・肺線維化度減少、TUNEL陽性細胞・カスパーゼ-3/9タンパク発現減少が認められた。先行研究では、miR-499-5p上昇がNSCLCの細胞増殖抑制とアポトーシス促進をin vivoおよびin vitroで示す[29]。別研究では、miR-499-5p回復とSox6枯渇が低酸素/再酸素化誘導性細胞アポトーシスを減弱させカスパーゼ-3発現を低下させること[32]、Sox6ダウンレギュレーションがアルツハイマー病海馬組織の病理障害改善と神経細胞アポトーシス抑制[33]、Sox6枯渇が高糖誘導性細胞アポトーシスとマウス腎メサンギウム細胞の腎間質線維化を抑制[31]、Sox6低発現がマウスP19CL6細胞のカスパーゼ-3活性とアポトーシス細胞割合を低下[34]することが報告されている。また、miR-499-5p回復またはSox6枯渇により、敗血症誘導性肺障害マウスのBALFおよび肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量が低下することを確認した。Xiaらは敗血症誘導性肺障害マウスでTNF-αとIL-6が劇的に上昇することを示した[35]。Sox6低発現がアルツハイマー病海馬組織の炎症反応を低下させること[33]も報告されている。本研究の別の結果として、miR-499-5p回復またはSox6枯渇によりSOD、CAT、GSH-Px活性上昇、MDAとMPO含量低下が認められた。CLP誘導性ALIは形態学的炎症、W/D比上昇、BALFタンパク濃度上昇、MPOとMDA含量上昇、SOD、GSH-Px、CAT活性低下を特徴とする[36]。敗血症誘導性ALIマウスでSODとCAT活性が低下すること[37]、miR-499-5p過剰発現とSox6低発現がMDAレベルを低下させること[32]も報告されている。

結論

結論として、miR-499-5pの高発現は、Sox6を枯渇させることで敗血症誘導性肺障害マウスの肺組織細胞アポトーシスを減弱させ、炎症を抑制することが分かった。これは敗血症誘導性肺障害治療において重要な治療的意義を持つ可能性がある。しかしながら、敗血症誘導性肺障害治療への有効性を検証するための臨床研究が必要である。