生物医学的応用のための球形の共役金-ザルガイ殻由来炭酸カルシウムナノ粒子の製造、特性評価および細胞毒性

背景

単分散ナノ粒子の生成は、電子、光学、生物医学、および磁気のアプリケーションで重要な役割を果たしています[1,2,3,4]。それらの進化と生体材料の進化は、医薬品[5]、生物医学システム[6]、ドラッグデリバリーシステム[7]、化粧品、および水処理[7,8,9]を有利に強化しました。同じ点で、生体適合性、生体原性、および非毒性の共役材料の開発は、生物科学および生物医学の分野に貴重な貢献をする可能性があります[10]。さらに、生体適合性のある金属結合バイオおよびナノ材料は、組織工学[5]、治療法[11]、および薬物送達[12]などの生物医学的応用のためのより科学的な進歩に貢献する可能性があります。これは、注射可能な自己組織化コラーゲン-金ハイブリッドヒドロゲル[13]、コロイド金-コラーゲンコアシェルナノコンジュゲート[14]、および抗腫瘍治療のための共組織化された無担体ナノ薬物の使用など、最近の研究で精巧に示されています。 [15]。多くの研究はまた、金属ナノ粒子が無機非シリカ多孔質材料を用いた電気化学バイオセンサーで酵素電極を生成できることを実証しています[16]。さらに、合成された酸化グラフェン-アルブミンナノハイブリッドは、光線力学療法の強化に向けた潜在的な利点も示しています[17]。全体として、これは、生物医学画像処理や生物感覚システムなどの他の可能なアプリケーションへの関心を高めただけです[16、18]。

生の天然鉱物としての炭酸カルシウムは、生物医学、工業、ナノテクノロジーを含む幅広い用途で使用されてきました[10、19、20、21]。炭酸カルシウム多形としてのアラゴナイトは、ザルガイの殻（ Anadara granosa ）に豊富に存在します。 ）、マレーシアでも見られる軟体動物として人気があります[22]。アラゴナイトは、方解石やバテライトの他の炭酸カルシウム多形とは異なり、生体起源であり、ザルガイの殻の95〜98％を占めています。アラゴナイト多形の無機材料である炭酸カルシウムは、自然にそして一般的にザルガイの殻の中に存在します[23]。アラゴナイト多形は、その生体適合性と抗がん剤送達システム[24]および生物医学イメージング[25、26]の開発における有望な可能性により、研究分野でますます注目を集めています。現在、先行研究のほとんどは、主に炭酸カルシウムの2つの製造方法を明らかにしています[26]。それらには、CO ₂ の共沈または二重分解および炭酸化が含まれます。 制御された設定の下で水酸化カルシウムを介してガスを発生させますが、残念ながら、生体炭酸カルシウムを生成するものはありません[26、27、28]。したがって、製品には方解石とバテライトの混合物が大量に含まれており、非生体適合性と高い毒性の報告があるため、生物医学的使用には適していません[26]。

しかし、生物医学的応用におけるナノテクノロジーの使用の増加に伴い、本研究は、制御されたザルガイ殻由来の炭酸カルシウムナノ粒子（CSCaCO ₃ ）の合成に焦点を合わせています。 ドデシルジメチルベタイン（BS-12）を使用した独自のサイズと形状のNP）[29]。これは、CSCaCO ₃ の合成におけるバイオミネラリゼーション触媒としてBS-12を利用する以前の研究に触発されています バイオアプリケーション向けに簡単に操作でき、費用効果が高く、比較的純粋なナノ粒子であるNP [30]。合成されたナノ粒子の形態とサイズは、その物理化学的特性を決定する上で非常に重要であり、その広大な潜在的な生物医学的用途を考えると、金属ナノ粒子に焦点が当てられています[31]。金ナノ粒子（AuNP）は、その光学特性、さまざまなサイズ範囲、および吸収極大の変動または採用された合成方法に依存する色のために、継続的に使用されてきました[32]。 AuNPのサイズと形状は、可視光スペクトルでの吸収と発光の特性に影響を与え、可視領域から近赤外領域まで変化します。したがって、それらの合成[33]、物理化学的特性[34]、生体適合性[35]、および表面機能化[36]により、さまざまな特定の用途に合わせて操作することができます[37]。さらに、医療診断では、それらは完全には使用されておらず、その価値はおそらく不明瞭であると述べられています[37]。

したがって、おそらく適切な機能化により、それらは癌の画像化[38]、癌治療[39]、薬物送達[40]、および感覚ガジェット[41]のために再設計される可能性があります。コーティングは、多孔質炭酸カルシウムナノスフェアと結合した金ナノ粒子（AuNP）のような機能化された特性を備えたナノハイブリッド生体材料を製造するために不可欠です[16、42]。得られた共役金-炭酸カルシウムナノ材料またはナノコンポジットハイブリッドは、生体適合性、良好な溶解性、溶液への分散性などの有利な親の特性を保持する可能性があります[16]。強い色の変化と局在表面プラズモン共鳴（LSPR）を示す共役金ナノ粒子は、アプタマー、ペプチド、抗体などの潜在的な複数の受容体システムの優れた候補となる可能性があります[35、43、44、45]。水溶性共役ポリマーの製造と、バイオセンサー、蛍光イメージング、およびドラッグデリバリーにおけるその応用は、成功裏に実現されています[46、47、48]。しかし、コンジュゲートされたナノ粒子またはナノ材料は、より友好的な調製[51]と分離機能[48]を除いて、長年にわたって光安定性[48、49]や低い細胞毒性[50]などの利点を徐々に改善してきました。

これにより、AuNPとCSCaCO ₃ NPは制御可能に合成され、生体結合した金ザルガイ殻由来の炭酸カルシウムナノ粒子（Au-CSCaCO ₃ ）を製造および特性評価するために使用されます。 直径サイズが19〜51nmの範囲のNP）。当初、AuNPsの調製は、古典的なTurkevich法[52]と、ドデシルジメチルベタイン合成アプローチ[26]を使用したザルガイ殻由来のナノ粒子に触発されています。濃度などの合成パラメータの変更により、サイズが適切に減少または増加する可能性があります。その結果、合成されたナノ材料は、細胞毒性について特徴付けられ、調査された。 Au-CSCaCO ₃ NPの準備に追加された利点は次のとおりです。簡単な合成とコスト効率。

メソッド/実験

材料と化学試薬

金塩（49％の金溶液を含むテトラクロロ金酸）とクエン酸三ナトリウムは、prima nexus Sdn Bhd（マレーシア）から購入しました。新鮮なザルガイの殻は地元の市場（Pasarborong、Seri Kembangan、Selangor、Malaysia）から入手しました。ドデシルジメチルベタイン（BS-12）およびインドシアニングリーン色素（ICG）は、Sigma-Aldrich（Steinheim、Germany）から購入しました。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）、抗生物質の組み合わせ（グルタミン100 mmol / L、ペニシリン100 U / mL、ストレプトマイシン100μg/ mL）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、ジメチルスルホキシド（DMSO ）、およびＭＴＴ（３－ジメチルチアゾ－２，５－ジフィニルテトラゾリウムブロミド染料）は、日本の京都のナクレイテスク社から購入した。使用した他のすべての試薬は分析グレードのものでした。

金ナノ粒子の合成

合成は、Vermaらによって以前に記載された方法を使用して達成された。 [53]濃度をわずかに変更して、49％の金溶液を含む1％のテトラクロロ金酸。約0.1％の金溶液を調製し、さまざまな三角フラスコでそれぞれ15、25、20mMの一連の濃度に希釈しました。次に、マグネチックスターラー（6位置、WiseStir®Korea）と組み合わせたホットプレート上で溶液を100°Cで加熱しました。次に、色の変化（黄色がかった金の溶液が無色になり、次に黒色になり、最後に鮮やかな赤色に変わる）が観察されるまで、約１％のクエン酸三ナトリウムを連続的なマグネチックスターラーで攪拌しながら沸騰溶液に加えた。 15分後に火を止め、室温で冷ましました。合成された金ナノ粒子は、さらに使用するために-4°Cで保存されました。反応は次の式で示されました：

コックルシェル由来の炭酸カルシウムナノ粒子（CSCaCO ₃ ）の調製と合成 NP）

新たに入手した3キログラムのザルガイの殻を徹底的に洗浄し、こすり洗いし、洗浄しました。ザルガイの殻の粉末は、Islametal。によって記載された方法に従って製造された。 [54]。洗浄したザルガイの殻をオーブン（Memmert UM500、GmbH Co、ドイツ）で50°Cで7日間乾燥させました。コックルシェルをブレンダー（Blender HCB、550、USA）を使用して粉末に粉砕し、90μmの開口部を備えたステンレス実験用試験ふるい（Endecott Ltd.、英国ロンドン製）でふるいにかけ、ミクロンサイズの粉末を得ました。粉末をオーブン内で74°Cで7日間乾燥させました。粉末は、後で使用するために気密性のあるポリエチレンのビニール袋にさらに詰められた。ザルガイの殻に由来する炭酸カルシウムナノ粒子は、Islam etal。によって記述されたアプローチに従って合成されました。 [55]、メソッドと合成パラメータにわずかな変更を加えました。 2グラムのザルガイ殻粉末を250mlの三角フラスコに入れ、続いて50 mlの二重脱イオン水を入れ、0.5mlの濃度のBS-12を三角フラスコに加えました。三角フラスコ内の混合物を、体系的なマルチホットプレートと小さなマグネチックバーを備えたマグネチックスターラーを使用して、温度50°Cで135分間、1000rpmで激しく攪拌しました。準備したサンプルは、サイズ125 mmのダブルリング濾紙（Filtres Fioroni、中国）を使用して母液から分離しました。次に、残留物を完全に洗浄して、過剰のＢＳ－１２を除去した。最終製品、CSCaCO ₃ NP粉末をドライクリーニング容器に詰め、74°Cで3日間乾燥させました（Oven Memmert UM500、GmbH Co、ドイツ）。内部に複数の小さなビー玉ボールを追加した後、容器を適切に包み、パラフィルムで密封した。コンテナをプログラム可能なローラーボールミル（BML-6、Wisemix®Korea）に200rpmの速度で5日間置きました。サンプルは、さらに使用するためにオーブン内の気密ポリエチレンに保管されました。

共役金-コックルシェル由来の炭酸カルシウムナノ粒子（Au-CSCaCO ₃ ）の合成 NP）および近赤外線（NIR）染料の不協和音

この手順では、0.2gのCSCaCO ₃ Cai et al。が同様に説明したように、NPと5 mgの近赤外線（NIR）インドシアニングリーン色素（ICG）を20 mlの金コロイド溶液（pH 7）（AuNPs溶液）に分散させました。 [16]、きれいな空の三角フラスコ。さらに合成を変更し、サンプルを20分間超音波処理し、小さなマグネチックバーを備えたマグネチックスターラーで200rpmで3日間インキュベートしました。サンプルを10,000rpmの速度で10分間超遠心分離して、薄緑紫がかったAu-CSCaCO ₃ を得ました。 NPコンポジット。上澄みをデカントし、一連の脱イオン水でペレット洗浄した。準備した複合材料をオーブンで4日間乾燥させ、さらに分析するためにオーブン内の気密ポリエチレンに保管しました。

共役ゴールドコックルシェル由来の炭酸カルシウムナノ粒子（Au-CSCaCO ₃ ）の特性評価 NP）

ナノ材料の粒子サイズと形態は、透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して分析されました。ナノマテリアルを無水アルコールに分散させ、40分間超音波処理しました。約5μlの懸濁サンプル溶液を銅製グリップ試料マウントにピペットで移しました。サンプルをTEM（Hitachi H-7100）で観察しました。電界放出型走査電子顕微鏡（FESEM）（モデルJOEL 7600F）は、5 KVの電圧で動作し、エネルギー分散型X線分光装置（EDX）を備えています。これは、Au-CSCaCO ₃ の表面の特徴を特徴づけるために使用されました。 NP。材料を無水アルコールに分散させ、1時間超音波処理しました。懸濁したサンプル溶液の約50μlをピペットで銅製グリップの試料マウントに移し、一晩乾燥させ、電子ビームを使用してスキャンしました。さらに、フーリエ変換赤外分光計（FTIR）は、合成された共役ナノ材料の機能分析にも使用されました。ナノ材料は、400〜4000 cm ^-1 の範囲でKer（FTIRモデル100、Perkin Elmer）で1 wt％で校正されました。 。さらに、合成されたナノコンジュゲートのサイズとゼータ電位の分析は、ゼータサイザー（Nano ZS、Malvern Instruments）を使用して行われました。材料を脱イオン水に懸濁し、50分間超音波処理しました。均質な懸濁液をゼータサイザーキュベットに入れ、粒子サイズとゼータ電位を調べました。共役ナノコンポジットのさまざまな分析物の存在は、300〜800nmの範囲のさまざまな波長でUv-Vis分光光度計（UV-2600）を使用して監視されました。

細胞培養および細胞毒性研究

ヒト乳房腺癌細胞株（JCRB：MCF-7）およびマウス線維芽細胞株（JCRB：NIH3T3）は、10％FBSと抗生物質の組み合わせ（グルタミン100 mmol / L、ペニシリン100 U /）を添加したDMEM（高グルコース）で培養しました。 mL、およびストレプトマイシン100μg/ mL）。培養フラスコ（エッペンドルフ培養T-25およびT-75）を5％二酸化炭素中で37°Cでインキュベートし、80〜90％コンフルエンスの細胞を播種および処理プロセスに使用しました。

細胞の播種と処理

細胞を96ウェル滅菌プレートに5×10 ³ の密度で播種しました。 ウェルあたりの細胞数を24時間インキュベートします。各ウェルの培地を除去し、細胞を処理し、コンジュゲートしたナノコンポジット懸濁液（Au-CSCaCO ₃ NP）24時間、48時間、72時間。処理曝露が完了した後、ウェル内の培地を吸引し、PBSで洗浄してから、実験的処理の前に別の新しい培地と交換しました。

Au-CSCaCO ₃ の準備 治療のためのNP

Au-CSCaCO ₃ のストック溶液 10％無血清DMEM培地で1 mg / mlの濃度のNPを調製しました。 96ウェルプレートにMCF-7細胞とNIH3T3細胞を細胞播種した後、プレートを処理し、マイクログラム（100〜1.56）のAu-CSCaCO ₃ のさまざまな濃度でインキュベートしました。 NPソリューション。

（MTT）3-ジメチルチアゾ-2,5-ジフィニルテトラゾリウムブロミド試薬の調製とプロトコル

通常、5mgのMTT試薬粉末を1mlのPBSに溶解し、超音波処理器のボルテックスで均一に混合しました。細胞の播種と処理後、ウェルプレートをクリアし、20μlのMTT試薬を各ウェルに添加しました。直後に、プレートを3〜4時間インキュベートして、MTTが細胞のミトコンドリアに結合できるようにしました。インキュベーション後、1 mlのDMSOを各ウェルに添加し、色の生成物を溶液に放出しました。プレートを暗い部屋に30分間保持し、溶液の光学密度（OD）をマイクロプレートリーダーを使用して波長570nmで測定しました[56]。実験は各細胞株について3回行い、平均値を記録しました。細胞生存率は、以下の式を使用して決定されました。

ここで A _サンプル 両方の細胞株と A の異なる培養処理細胞の平均OD読み取り値でした _{コントロール} 完全培地のみでの異なる培養細胞の平均OD読み取り値でした。次に、細胞の細胞毒性を平均3回の値から評価し、平均±標準偏差（SD）として示しました。

統計分析

統計データ分析は、SPSSソフトウェア（バージョン10、シカゴ、米国）を使用して行われました。実験は3回行われ、平均±標準偏差（M±SD）として表されました。有意水準は p でした <0.01。

結果と考察

共役Au-CSCaCOの物理化学的性質 ₃ NP

透過型電子顕微鏡

TEM顕微鏡写真の目的は、合成された共役Au-CSCaCO ₃ のサイズを評価することでした。 （19〜51 nm）の範囲内で平均直径サイズが35±16nmの十分に分散したナノ粒子を示すNP。合成条件によるサイズの違いは図1のとおりです。

TEM（ a 、 b ）Au-CSCaCO ₃ の画像 ナノ粒子のサイズの違いを特徴付けるNP

ナノコンジュゲートのTEM顕微鏡写真は、19〜51nmの範囲の直径と分散したナノ粒子を示しました。独自に得られたナノサイズは、採用された制御された合成条件に起因する可能性があります。ナノ粒子の分散性に関する別の考えられる説明は、互いにナノ粒子の反発を助けたクエン酸イオンの負に帯電した層、および同様に報告されたように、静電反発および共役水和表面層が凝集を防ぎ、共役安定性を高めることによる可能性がありますJazayeriらによる。 [56]。さらに、クエン酸塩キャッピング試薬は合成において役割を果たし、Rawat et al。によって報告されているように、ナノ粒子コンジュゲートのより多くの分散性と安定性を可能にしました。 [57]。ユニークな粒子サイズは、Cai et al。によって行われた研究と同様に、炭酸カルシウムナノスフェアマトリックス内に異なる吸収された金ナノ粒子を示しました。 [16]、示されている観察された結果の粒子サイズに貢献します。ただし、この結果は、方解石が金ナノ粒子を収容する能力が低いという報告も裏付けています[16]。

電界放出型走査電子顕微鏡（FESEM）およびエネルギー分散型X線分光法（EDX）

FESEM顕微鏡写真は、合成されたナノ粒子の形態と形状を評価しました。これは、球形で鎖状のAu-CSCaCO ₃ を示しています。 図2に示すように、凝集度が小さいNPナノ粒子。元素スペクトル（図2b）は、64.98％の炭素、13.53％の酸素、0.02％のカルシウム、17.63％の銅、および17.63％の銅を示す共役ナノ粒子の元素組成を分析しました。表1に示されている3.85％の金。

FESEM a Au-CSCaCO ₃ のFESEM顕微鏡写真 形態を説明するNP。 b Au-CSCaCO ₃ のEDXスペクトル NP

FESEM顕微鏡写真は、独特の形態を球形、滑らかな表面、および鎖状の構造化された共役ナノ粒子として説明しました。その物理的または化学的特性は、調製条件と合成方法の結果として説明できます[58]。同様に、共役ナノ粒子によって示される球状の構造的性質は、Vermaらによって報告されたものと類似していた。 [53]が、提示されたわずかな集約度とは反対です。この結果の考えられる説明は、金ナノ粒子とザルガイ殻由来の炭酸カルシウムナノ粒子の間の疎水性および静電相互作用が強い結合につながるためである可能性があります[48]。さらに、合成に使用されたBS-12の役割は、Islam etal。によって文書化された研究と類似した球形へのナノ粒子の分解に反映されていました。 [55]。基本プロファイル（表1）は、期待される結果に反する有意な変化を明らかにしませんでした。同様に、コンジュゲートされたナノ粒子の化学組成で観察された発見は、以前の研究[26、54]で以前に示されたように文書化されています。

強度による表面電荷とサイズ分布

図3および表2。

a Au-CSCaCO ₃ の強度による粒度分布 NP。 b Au-CSCaCO ₃ のゼータ電位 表面電荷を示すNP

ゼータ電位は、ゼータサイザーを使用して決定されたナノ粒子表面静電荷を評価する際の重要なアッセイです。これにより、溶液中のナノ材料の分散性がさらに説明され、全体的な安定性、ナノ粒子の貯蔵寿命、荷電粒子間の粒子相互作用、およびそれらの影響を理解できるようになりました[59]。共役ナノ材料のゼータ電位評価は、-16.4 mVでのナノ粒子の安定性と0.5未満の多分散度指数（PdI）を示しました。考えられる説明は、測定中の懸濁液中の粒子間のより多くの電気反発の存在に起因する可能性があります。さらに、凝集傾向もサイズ分布に影響を及ぼし、合成法によりサイズが大きくなる可能性があります。 Hoqueらによる事前研究。同様に、非常に正または負のゼータ電位が凝集を減少させ、安定性を増加させることを文書化しています[60]。さらに、合成されたナノ粒子の物理化学的差異は、使用された合成方法に説明することができます。 Kanaujiaと共同研究者の[61]の研究は、ゼータ電位の負または正の値が高いほど、粒子の安定性と凝集の回避を示していることも強調しています。 [62]。

フーリエ変換赤外分光計（FTIR）

Au-CSCaCO ₃ のFTIRスペクトル NPは、最も顕著なピークが1455.09 cm ^-1 に現れたことを示しています。 続いて1059.12cm ^-1 でピークが観察されます 、854.80 cm ^-1 、および464.16 cm ^-1 、 それぞれ。また、706.40 cm ^-1 に弱いピークが観察されました。 および1785.68cm ^-1 図4に示すように。

Au-CSCaCO ₃ の主な特徴的なピークのフーリエ変換赤外分光計スペクトル NP。すべてのマークは、テキストで説明されている頻度に対応しています

Au-CSCaCO ₃ のFTIRスペクトル 提示されたNPは、最も顕著なピークが1455.09 cm ^-1 に現れたことを示しました。 、金ナノ粒子[14]およびザルガイ殻ナノ粒子のカルボキシル基に存在する酸素-水素（O–H）結合を証明し、1059.12 cm ^{-1 、854.80 cm -1 、および706.40 cm -1 、スペクトルのピークと一致するザルガイの殻由来のナノ粒子で発生するアルキル基を報告することが知られています[55]。同様に、弱いピークは1785.68 cm -1 で観察されました。 カルボキシル基が存在するため[54]、464.16 cm -1 に追加のピークが観察されました。 。すべてのピークは、共有結合、炭素-炭素（C-C）、炭素-酸素（C-O）、および炭素-窒素（C-N）結合の存在に大きな特徴を示し、その適切な官能基が共役に存在していました。ナノ粒子。 FTIRは、共役ナノ材料の赤外スペクトルピークを取得し、同時に広いスペクトル範囲（400〜4000 cm -1 ）にわたって高スペクトル分解能データを収集することにより、存在する官能基を本質的に特定しました。 ）[63]。ただし、炭酸カルシウムの方解石多形には、2000〜2900 cm -1 の範囲のピークがあると報告されています。 炭酸化法[64]によって製造されたナノ粒子を使用。}

Uv-Vis分光光度計

合成された共役ナノ粒子は、図5に示すように、530nmに重い吸収ピークを示します。

Au-CSCaCO ₃ のUV-Vis分光光度計の吸光度スペクトル 本文で説明されているNP

金のナノ構造は、AuNPの局在表面プラズモン共鳴効果により広い吸光度を示します[65、66]。多くの報告によると、金粒子は500〜520nmの間に鋭い吸光度ピークが観察されることがよくあります[66,67,68,69]。この手法により、共役Au-CSCaCO ₃ のさらなる評価が可能になりました。 NPのサイズ、濃度、および凝集レベル[65]。吸収帯は、粒子サイズの減少を示すより短い波長にシフトすることも知られており、吸収スペクトルの対称的な形状は、狭い粒子サイズ分布を示し[70]、したがって、共役Au-CSCaCO _{3 500〜550nmの間に広い吸収ピークと530nmの波長の最高点を示したNP。光が組織によって容易に減衰され、吸収ピークがより長い波長に大幅にシフトする近赤外可視スペクトル領域で許容されます[71]。これについて考えられる説明は、ナノ材料の合成と共役に起因する可能性があります。また、吸収帯の位置は主に色の変化、凝集、表面吸着種に依存することを明らかにしたSrinath etal。と一致しています[72]。さらに、ナノ粒子の吸収スペクトルは、金のプラズモン共鳴特性により、色、形態、およびサイズに応じてシフトする可能性があります[73]。 NIR光熱特性を備えたナノ構造は、光を強く散乱させる能力があり、生物医学イメージングで重要な用途があります[74、75]。}

細胞毒性研究

MTT（3-ジメチルチアゾ-2,5-ジフィニルテトラゾリウムブロミド）

ヒト乳がん細胞（MCF-7）およびマウス胚性線維芽細胞（NIH3T3）の細胞毒性研究により、Au-CSCaCO ₃ NPは、100μgの投与量で70％以上の細胞増殖を抑制し、癌細胞死を引き起こし、線維芽細胞をほぼ40％抑制しました。 IC ₅₀ また、25μgなどの低濃度の用量でも癌細胞に毒性があることが証明され、細胞の生存率が低く、ナノ粒子の癌細胞の細胞増殖が50％以上阻害されることが明らかになりました。他方、線維芽細胞への同一の濃度投与量は、線維芽細胞の増加した一貫した細胞生存率を示した。 IC ₅₀ 図6に示すように、線維芽細胞の最大80％の細胞生存率を示しました。

MCF-7およびNIH3T3で処理されたAu-CSCaCO ₃ の細胞毒性評価 細胞生存率を示すMTTアッセイを使用したNP細胞

3-ジメチルチアゾ-2,5-ジフィニルテトラゾリウムブロミド（MTT）は、細胞生存率を測定するために許容できる比色分析です[76]。電子伝達系のミトコンドリア酵素を利用して[77]、代謝が活発な生細胞は、細胞質ゾルでMTTを紫色のホルマザン結晶に変換しました[78]。 The crystals were dissolved after cell lysis on adding an organic solvent dimethyl sulfoxide (DMSO) which is proportional to live cell number, unlike dead cells, due to cytotoxicity that are unable to carry out the reaction [79]. The conjugated nanoparticles displayed consistent cell death against the cancer cells and reliable cell viability of the fibroblast cells with concentration doses ranging from 25–100 μg. Furthermore, attesting low cytotoxicity and highlighting the biocompatibility of Au-CSCaCO₃ NPs and potential usefulness for biomedical applications, the cytotoxicity could be due to the internalization of the nanoparticles which possibly triggered intracellular responses and thus induced cellular damage because of interaction with cell organelles. Despite contrary cytotoxicity findings with works done on HeLa cells (human cervical cancer cell line) due to nanoparticles inducing oxidative damage [35, 80], Zhang et al. demonstrated the biocompatibility of the nanoparticles and its likely use for drug delivery systems [80]. Similarly, reports of gold nanoparticles confirmed nontoxic dependent on their size [81] and concentration [39]. Studies strongly confirmed that biogenic gold conjugates are stable and nontoxic nanocarrier used in biomedical application [35, 39] suggesting use for biomedical applications such as drug delivery and cancer therapy [82].

結論

Spherical-shaped conjugated gold-cockle shell-derived calcium carbonate nanoparticles (Au-CSCaCO₃ NPs) were obtained. The conjugated nanoparticles were synthesized using a simpler, environmental friendly, and cost-efficient synthetic approach. Furthermore, based on the results, the obtained conjugated nanoparticles were relatively pure and stable. The source of material used for the cockle shell-derived nanoparticles is biogenic, readily available, and naturally occurring as seawater mollusca cockle shell. Based on the presented evidences, the conjugated Au-CSCaCO₃ NPs could be a good biomaterial for biomedical applications.

略語

Au-CSCaCO₃ NPs :

Synthesized Conjugated Gold-Cockle Shell Derived Calcium Carbonate Nanoparticles

AuNPs:

金ナノ粒子

BS-12:

Dodecyl dimethyl betaine

C–C:

Carbon-carbon bond

C–N:

Carbon-nitrogen bond

C–O :

Carbon-oxygen bond

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

EDX：

Energy dispersive X-ray

FBS：

ウシ胎児血清

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FRGS:

Fundamental Research Grant Scheme

FTIR：

フーリエ変換赤外分光法

HeLa cells:

Human cervical cancer cell line

IC₅₀ ：

50% inhibition concentration

ICG：

Indocyanine green dye

JCRB:

Japanese Collection Research Bioresource

LSPR：

局在表面プラズモン共鳴

MCF-7:

Human breast adenocarcinoma cell line

MTT:

3-Dimethylthiazo-2, 5-diphynyltetrazolium Bromide Dye

NIH-3T3：

Mouse embryonic fibroblast cell line

NIR：

近赤外線

O–H:

Oxygen-hydrogen bond

OD:

Optical density

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

TEM：

透過型電子顕微鏡