クルクミンの処理効果を持つPEGコーティングされたCoFe2O4ナノ粒子の毒性

要約

この作品では、CoFe ₂ O ₄ ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされたナノ粒子は、熱水技術によって正常に合成されました。サンプルの形態学的研究により、多結晶純相PEG-CoFe ₂の形成が確認されました。 O ₄ サイズが約24nmのナノ粒子。 CoFe ₂によって誘発される毒性 O ₄ ナノ粒子を調査し、生物学的アッセイを実施してCoFe ₂の毒性効果を確認しました。 O ₄ ナノ粒子。さらに、生物に誘発される毒性の治癒効果をクルクミンを使用して研究し、生化学的指標が解毒され、クルクミン投与後に正常レベルに達するように改善されることが見出された。したがって、PEGコーティングされたCoFe ₂ O ₄ 水熱合成法で合成されたものは生物医学的用途に利用でき、副作用のない天然化学物質であるクルクミンは、生体内のナノ粒子によって誘発される毒性の治療に使用できます。

背景

ナノ粒子（NP）の使用は、バルクの対応物とは実質的に異なる独自の化学的および物理的特性により、多くの利点を提供します[1]。コバルトフェライト（CoFe ₂ O ₄ ）最も重要な磁性材料の1つとして、最近の技術でのさまざまな用途のために、ナノスケールで大きな関心を呼んでいます[2、3、4、5]。ナノスケールで望ましい物理的および化学的特性を備えているため、主に医療業界での幅広い用途の競争力のある候補の1つと見なされています。さらに、CoFe ₂ O ₄ 特定のアプリケーションに必要な制御された組成、形状、およびサイズで製造するのは簡単で費用効果が高いです。この点で、CoFe ₂の直径 O ₄ 100 nm未満の生物学的用途向けのナノ粒子は、生物の物理化学的特性と薬物動態に大きな影響を与える可能性があります。直径が100nmを超える大きな粒子は、消化管の磁気共鳴画像法の造影剤として使用され、20 nm未満の小さな粒子は、腫瘍治療の担体として使用されます。コバルトフェライトナノ粒子の臨床応用では、invivoとinvitroの両方でバイオセーフティを調査することが非常に重要です[6、7]。経口または静脈内に体内に取り込まれた多くのナノ粒子は、主に肝臓、腎臓、肺に分布し、これらの臓器にさまざまな炎症を引き起こします。他の材料と比較して、コバルトフェライトは、生体内での毒性とクルクミンを使用した治癒効果を調査するために広く研究されていませんが、ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされたコバルトフェライトの毒性とバイオセーフティを調査する研究はほとんど報告されていません。ナノ粒子。

毒性の観点から、主な懸念は、生体器官から蓄積されたナノ粒子の除去を必要とする過度の曝露であり、炎症性疾患の緊急治療を必要とします。一部の研究者は、in vivoでのナノ粒子の毒性の治療についていくつかの抗炎症薬を研究しようとしましたが、これらの抗炎症薬は、体内に蓄積されたナノ粒子の排出を促進して減少させることができることを発見しましたまたは組織の炎症作用を排除します[8、9]。 クルクマロンガ （ターメリック）は、東南アジアの炎症性疾患の治療薬としての使用の非常に長い歴史を持つ伝統的な薬草です。クルクミンの抗酸化特性、抗変異および抗腫瘍効果、および発がん性に関する多くの研究が報告されています[10、11]。クルクミンは、傷を癒すだけでなく、肝臓病、尿路疾患、肝炎を治療する能力があります[11]。 Nrf2-keap1経路を介して慢性疾患の酸化ストレスと炎症を軽減します。クルクミンは、ほとんどの慢性疾患に関連する炎症誘発性経路を抑制し、さまざまな種類の細胞でTNFの産生とTNFによって媒介される細胞シグナル伝達の両方をブロックします。さらに、クルクミンは、TNFに直接結合することにより、invitroおよびinvivoからTNFブロッカーとしても機能する可能性があります[12]。

この研究では、PEGコーティングされたCoFe ₂の調製に成功しました。 O ₄ 熱水技術を使用して、形状とサイズが約25nmに制御されたナノ粒子。 CoFe ₂のさまざまな曝露（用量）を与えた後 O ₄ ナノ粒子については、血液分析、HE染色、生体内分布、およびPEG-CoFe ₂によって引き起こされる毒性に対するクルクミンの治療効果を調べました。 O ₄ ナノ粒子。この研究は、CoFe ₂の毒性効果を調査するための新しいアプローチを示しています。 O ₄ ナノ粒子とその後のPEG-CoFe ₂によって引き起こされる毒性の治療 O ₄ クルクミンを使用したinvivoでのナノ粒子。

メソッド

コバルトフェライトナノ粒子の調製

コバルトフェライトナノ粒子は、熱水技術を使用して合成されました。この目的のために、適切な量の硝酸第二鉄と塩化コバルトを脱イオン水に溶解し、次にPEGと水酸化ナトリウム（NaOH）の水溶液と混合しました。最終的なナノ粒子に不純物が存在しないように、溶媒として再蒸留脱イオン水を使用しました。マグネチックスターラーを使用して混合物を約30分間撹拌し、次にオートクレーブに注ぎ、180°Cで6時間加熱して、水熱反応を実行しました。反応が完了した後、生成物を室温に冷却し、次に脱イオン水で２回洗浄し、次にエタノールで洗浄して、溶液中に過剰のＰＥＧおよび他の溶解していない塩が存在する場合はそれを除去した。最後に、製品を80°Cで一晩乾燥させた後、粉末に粉砕して、目的のコバルトフェライトナノ粒子を得ました。この段階で、ナノ粒子はアモルファスであることがわかりました。これは、図2aに示すXRDによって確認されました。次に、ナノ粒子を結晶形にするために、サンプルを500°Cで6時間アニーリングし、最終生成物を結晶性PEG-CoFe ₂の形で取得しました。 O ₄ 図2bに示すXRDによって確認されたナノ粒子。

99mTcPEG-CoFeのラベリング₂ O ₄ ナノ粒子

PEGコーティングされたCoFe ₂の放射性標識 O ₄ ナノ粒子は、塩化第一スズ（SnCl ₂）を使用して99mTcで実行されました。）還元剤として、超音波処理条件下で約0.5時間、ナノ粒子を脱イオン水に溶解しました。 SnCl ₂ 、アスコルビン酸、および99mTcO ₄ 次に、ナノ粒子懸濁液に添加しました（コバルトフェライトは約0.4重量％）。正確なデータを得るために、99mTc（〜6 h）の寿命が短いため、放射能カウントは24時間以内に測定されました。混合物のpHは、1.0 M NaHCO ₃を使用して5〜10の範囲で調整しました。解決;次に、PEG-CoFe ₂の懸濁液 O ₄ それに加え、得られた混合物を10,000℃で25分間80℃で撹拌した。遠心分離後、上澄みをデカントし、残りの物質は99mTc PEG-CoFe ₂であると確認されました。 O ₄ 。ペーパークロマトグラム（通常の生理食塩水とアセトンのクロマトグラフィー溶液下）を使用して、標識化合物の収率を測定しました。ナノ粒子の放射性標識収率は、生体内での実際の分布と代謝を反映して約70％であることがわかりました。

PEG-CoFeの生体内分布₂ O ₄ ナノ粒子

15〜18 gの範囲の昆明マウスは、中華人民共和国甘粛省蘭州大学医学研究所から提供されました。すべての動物は、温度制御システム（21〜22°C）を備えた個別のケージに収容され、08：00〜20：00の時間に照明がオンになりました。 1986年11月24日の欧州共同体評議会指令（86/609 / EEC）による動物プロトコルに従って推奨され、甘粛省医用動物センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されたように、適切な餌と水がマウスに与えられました。および蘭州大学動物委員会ガイドライン（中国）。マウスをランダムに7つのグループ（5匹のマウス/グループ）に分け、99mTc-PEG-CoFe ₂を静脈内注射しました。 O ₄ 解決し、注射後1、6、16、24時間で殺しました。心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓の組織を直ちに解剖し、その後、かなりの量の血液を採取しました。各組織をホイルで包み、適切に秤量し、99mTcでカウントしました。データポイントは、放射能の物理的減衰について修正されました。組織の分布は、ウェットティッシュ1グラムあたりの注入量の割合（％ID / g）で表され、ウェットティッシュ1グラムあたりの注入量の割合（組織活動/総活動量）で計算できます。

PEG-CoFeの毒性に対する投与量の影響₂ O ₄ マウスで

この実験では、21匹のマウスを7つのグループに分けました（3匹のマウス/グループ）。 PEG-CoFe ₂ O ₄ ナノ粒子は、マウスに125、250、350μg /マウス（0.2 ml）の異なる用量で静脈内注射され、対照群は0.9％の生理食塩水で処理されました。治療群では、125、250、350μg /マウスのクルクミンの異なる用量もマウスに静脈内注射されました。損傷グループは24時間後に殺され、治療グループは3日後に殺されました。マウスから血液を採取し、約10分間遠心分離して、血清を得ました。総ビリルビン（TB）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）、血中尿素窒素（BUN）、クレアチニン（CREA）、およびシスタチンC（Cys-C）の血清含有量を測定しました。同時に、肝臓、肺、脾臓、腎臓、心臓をすぐに採取しました。これらの組織は10％緩衝ホルマリンで固定され、ヘマトキシリンとエオシンで通常の組織学のために処理されました。組織の顕微鏡観察は、デジタルカメラと組み合わせたOlympusMicrophot-CX41顕微鏡を使用して実行されました。

結果と考察

TEMおよびXRD分析

形態学的特性評価は、JEOL JEM-1400透過型電子顕微鏡と銅K _αを備えたX線回折計（島津XRD-7000）を使用して実施されました。放射線源として。図1は、さまざまな解像度のPEGコーティングされたコバルトフェライトナノ粒子のTEM画像を示しています（図1a、b）。これは、粒子サイズが約24nmの純粋相のPEGコーティングされたコバルトフェライトナノ粒子の形成に成功したことを示しています。図2は、調製したナノ粒子のX線回折分析を示しています。図2aは、準備されたままのサンプルのXRD結果を示しています。これは、ナノ粒子がほとんどアモルファスの形であることを示しています。ただし、サンプルを高温（500°C）で6時間アニーリングすると、ナノ粒子が結晶形に変化することがわかりました。これは、図2bに示すXRD画像で確認できます。平均結晶子サイズは、Debye-Scherrerの式（ D ）を使用して、XRD分析（図2b）で最も強いピークの線の広がりから計算されました。 =Kλ / β cos θ ）[13]、これは〜22nmであることがわかります。 XRDパターンで観察されたすべてのピークの位置と相対強度は、図2bの挿入図に示されているJCPDFカード（カード番号20-1086）によると、結晶構造がナノ粒子の立方晶スピネル構造の形成に有利であることを示しています。すべてのピークは適切にインデックス付けされており、XRDパターンに余分なピークは見られません。これは、サンプルに不純物が存在しないことを示しています。 TEMとXRDの両方の結果により、約22〜25nmの結晶性ナノ粒子の形成が成功したことが確認されています。

フーリエ変換赤外分光法、ラマン、およびTG分析

フーリエ変換赤外分光法（FTIR）を使用して、コバルトフェライトナノ粒子の構造特性とカチオン分布を調査しました。図3は、室温で採取したサンプルの赤外線スペクトルを示しています。一般に、コバルトフェライトには2つの強い吸収帯があります。ʋ ₁ およびʋ ₂ 、400〜600 cm ^-1 の範囲で表示されます [14,15,16]、これは私たちの場合は非常に明白です。より高いバンド（ʋ ₁ ）は、四面体格子サイトでの金属（M–O）の固有の伸縮振動に対応しますが、下部バンド（ʋ ₂ ）は、八面体サイトでの金属イオンの伸縮振動を表します[14、15、16]。これらの結果は、立方構造のコバルトフェライトナノ粒子の形成が成功したことを示しています。 FTIRデータから、〜3400 cm ^-1 にピークが示されています PEGのピークを明確に示しており、コバルトフェライトナノ粒子とのPEGの付着が成功していることを確認しています。

サンプルの室温ラマンスペクトルを図4に示します。これは、190〜684 cm ^-1 の範囲のさまざまなピークを表しています。。高周波でのメインピーク（684 cm ^-1 ）は、A _1gに起因するスピネルフェライトの特徴的なピークです。四面体サイトでのFe–O結合に沿った酸素イオンの対称伸縮に対応するモード[17]。低周波数のピークもスピネル構造のコバルトフェライトに属しています。適切なエネルギーでのラマンスペクトルのこれらすべてのピークの出現は、PEGコーティングされた立方体CoFe ₂の形成が成功したことを確認します。 O ₄ ナノ粒子。

サンプルの熱重量分析（TGA）（CoFe ₂ O ₄ 、PEG、およびPEG-CoFe ₂ O ₄ ）は50〜600°Cで実行され、結果は図5に示されています。これらのサーモグラムはCoFe ₂ O ₄ ナノ粒子は200〜300°Cの範囲で重量が減少し、PEGは400°C未満の温度で重量が減少しますが、PEG-CoFe ₂ O ₄ 200〜400°Cの温度範囲で体重が減ります。 PEGの熱安定性は比較的低いことがわかります（図の右側に示されています）。ただし、PEG-CoFe ₂の熱安定性 O ₄ 80％以上のようです。純粋なコバルトフェライトナノ粒子は水に不溶性です。ただし、図6に示すように、親水性があるため、PEGでコーティングした後は、水に簡単に溶解できます。この図では、時間の経過とともに、粒子がボトルの底に沈殿し、おそらくナノ粒子の重力によるものです。図6は、PEGでコーティングされたコバルトフェライトナノ粒子の溶解の時間発展を示しています。私たちの場合、マウスの体内に注入する前に、ナノ粒子を生理食塩水に完全に分散させて、マウスのさまざまな臓器に適切に送達されるようにしました。

生体内分布研究

生体内投与後の各臓器のナノキャリア量を正確に定量化するために、99mTc PEG-CoFe ₂の生体内分布 O ₄ 正常なマウスで行われた。 PEG-CoFe ₂の取り込みが見られます O ₄ 図7に示すように、肝臓と脾臓でより高く、これらの結果は参考文献[18]と同じであり、注射後1時間での放射性標識コバルトフェライトの取り込みは、他の磁性体よりも肝臓と脾臓で3倍高くなっています。ナノ粒子。その理由は、肝臓や脾臓などの細網内皮系に結合した組織がこれらの異物を主に取り込むためです。これらの臓器にはクッパー細胞があり、クッパー細胞は洗浄機能として機能し、ナノおよびマイクロ材料を除去するのに主要な役割を果たします。食作用による体循環[19]。この作業では、PEG-CoFe ₂の分布が観察されます。 O ₄ 組織内は時間の経過とともに減少します。つまり、PEG-CoFe ₂ O ₄ ナノ粒子は、排尿過程を通じて時間とともに排泄されます。腎臓は、尿を介したナノ粒子の排泄システムです。図7では、腎臓での最大の生体内分布が1時間で観察されます[20]。血液の蓄積は注射直後にのみ高く、図7に示すように、体の血液プールからの放射能のクリアランスが比較的速いことを示しています。これは、血液中に長期間存在するPEG鎖を持つ酸化鉄ナノ粒子の場合と同様です。プール[21、22]。さらに、心臓の生体内分布は非常に低いことがわかりました。これは、参考文献[23]で報告されているものと同じです。脾臓が古い赤血球の破壊とそれに続くヘモグロビン結合FEの再利用の主要な部位であることは注目に値します[18、24]。時間の経過とともに、脾臓のより遅いがより効率的なプロセスがアクティブになり、ナノ粒子を循環から排除する能力が高まり、注射後1時間後に組織の放射能濃度が増加することが観察されています。 PEG-CoFe ₂の肺への取り込み O ₄ 図7に示すように、調査全体を通じて重要ではありませんでした。同様の作業が参考文献[23]で報告されています。これは、微小凝集体が肺の毛細血管に不可逆的に閉じ込められないことを示しています[23、25、26]。

PEG-CoFe ₂の投与量効果 O ₄ 毒性について

PEG-CoFe ₂の潜在的な毒性作用を明らかにする O ₄ 、invivoでマウスの生化学試験を実施しました。この目的のために、生理食塩水とPEG-CoFe ₂の混合溶液を注入しました。 O ₄ さまざまな量（150、250、350μg）で、24時間後にマウスを犠牲にしました。血液分析のために、血液を収集し、約10分間遠心分離して、血清を得ました。 Cys-C、CREA、ALT、AST、TB、BUNなどの肝臓と腎臓の機能マーカーに焦点を当てて、さまざまなパラメーターをテストしました。次に、これらのパラメーターをSPSSソフトウェア（ p ）を使用してコントロールグループと比較しました。 <0.05は有意差を示します）、結果を図8に示します。暴露群と対照群の間でALT、BUN、およびCREA-Aに有意差が見られます。腎機能内容のバイオマーカーの主な原因であるTBとCys-Cは、マウス1匹あたり150μgのPEG-CoFe ₂の曝露で大幅に減少することがわかりました。 O ₄ そして、マウスあたり350μgの通常のレベルに達する一方で、マウスの投与量あたり250μgで増加することがわかりました。これは、ある程度まで、腎機能がPEG-CoFe ₂の曝露によって影響を受けることを示唆しています。 O ₄ しかし、組織に大きなダメージを与えることはありませんでした。肝臓の健康のバイオマーカーであるASTは、すべての投与量への曝露によって大幅に減少しました。これは、対照群のマウスと比較して、肝機能に大きな影響を与える可能性があることを示しています。これらすべての結果から、PEG-CoFe ₂ O ₄ 250μg/マウスの投与量は、比較的多くの損傷を示します。したがって、実験でのさらなる分析とテストには、250μg/マウスのPEG-CoFe ₂を使用しました。 O ₄ 投与量。

PEG-CoFeの毒性に対するクルクミンの影響₂ O ₄

この研究では、クルクミンを使用して、炎症をPEG-CoFe ₂の損傷効果まで軽減しました。 O ₄ 。 PEG-CoFe ₂の毒性に対するクルクミンの効果を調査するため O ₄ 、マウスの生化学的指標および組織組織学を測定した。これらの生化学的指標には、治療群マウスの血清中のBUN、CREA、Cys-C、ALT、AST、およびTBが含まれます。 BUN、CREA、Cys-C、およびASTは、曝露グループと比較して、クルクミンのさまざまな投与量で有意な減少を示しますが、150μg/マウスのクルクミンの投与量では、ALT、AST、およびCREAは図9に示すように、対照群と比較した場合の正常レベル。TBおよびALT含有量では、PEG-CoFe ₂の曝露群と比較して、クルクミンのすべての投与量が有意に減少しています。 O ₄ 。図9の結果は、クルクミンがPEG-CoFe ₂の損傷に対して正の治療効果を示すことを示しています。 O ₄ マウスとクルクミンの異なる投与量では、より良い治療効果を示しています。この作業では、肝臓酵素（ALTおよびAST）および腎臓酵素（BUN、CREA、Cys-C、およびTB）の血清レベルに対するクルクミンの保護効果を調査します。この研究では、PEG-CoFe ₂ O ₄ ALT、AST、BUN、CREA、Cys-C、TB酵素の血清レベルは、クルクミン投与後にほとんど正常レベルに近づいた対照群と比較して有意に増加しました。壊死または細胞膜の損傷は、これらの酵素の血中への放出を引き起こす可能性があります。ただし、これらの酵素の血清レベルは、肝臓と腎臓のパフォーマンスに関連付けられています。クルクミンを投与されたグループでは、これらの酵素の量が減少しました。これは、PEG-CoFe ₂の毒性に対するクルクミンの保護効果を示しています。 O ₄ ナノ粒子。これは、酸化ストレスを軽減するクルクミンの抗酸化作用によるものです。さらに、TNF-αとIL-1は肝壊死の誘発に関与しています。したがって、クルクミンは、マクロファージによるTNF-αおよびIL-1の分泌を阻害することにより、毒性の影響を減らすことができます[11]。これらの調査結果は、参考文献[27]で報告されている他の結果と一致しています。

ナノ粒子投与によって誘発される可能性のある毒性作用を検証するために、肝臓、腎臓、および脾臓の組織病理学的分析も実施されました。各マウスの臓器を取り出し、10％ホルマリンで処理し、パラフィンに包埋しました。 5マイクロメートルの切片をヘマトキシリン-エオジン（H＆E）で染色し、顕微鏡で検査しました。結果は、図10に示す分析された臓器に、関連する組織病理学的変化が登録されていないことを示しています。肝臓と脾臓の検査では、臓器構造がコバルトフェライトナノ粒子の投与によって影響を受けなかったことが示されました。これは、考えられる2つの理由によるものです。1つはナノ粒子のサイズが比較的大きい（つまり24 nm）こと、もう1つは少量のコバルトフェライトナノ粒子（つまり150、250、350μm）を与えて殺したことです。 24時間後のマウス。したがって、これは臓器の機能にのみ影響を及ぼし、その構造には影響を与えなかった可能性があります。これは、著者が参考文献[28]で報告したケースに似ており、7日間で20 mg / kg（私たちのケースよりも高い）を与えました。同様に、参考文献[29]で報告された別の症例では、臓器で監視された組織病理学的変化はありませんでした。

結論

この作業では、熱水技術を使用して、24 nmPEGコーティングされたコバルトフェライトナノ粒子の製造に成功しました。異なる投与量のPEGコバルトフェライトナノ粒子を使用してマウスのさまざまな臓器に誘発される毒性を詳細に調査し、次にその治癒効果をクルクミンを使用して研究しました。 CoFe ₂の毒性を確認するために、生物学的アッセイを実施しました。 O ₄ ナノ粒子。クルクミンによる治療後の生化学的指標の正の変化は、正常レベルに達するか、大幅に減少するかのいずれかで監視されました。この研究は、PEGコーティングされたCoFe ₂ O ₄ 熱水技術によって合成されたものは、薬物担体の優れたモデルであり、天然化学物質であり、副作用のないクルクミンは、毒性の治療だけでなく、生物の他の病気にも利用できます。