磁性金ナノ粒子標識ヘパラナーゼモノクローナル抗体とその後の腫瘍磁気共鳴画像法への応用

背景

腫瘍転移は、腫瘍患者の主な死因である悪性の行動です。現在、早期腫瘍転移を検出するための効果的な戦略はありません。タイプB超音波、コンピューター断層撮影（CT）スキャン、および磁気共鳴画像法（MRI）は現在、腫瘍転移の診断のための標準ツールですが、ほとんどの患者がすでに遠隔転移に苦しんでいる場合にのみ、特定のサイズの転移性腫瘍を区別できます[1 、2]。したがって、早期の腫瘍転移を検出するための新しい戦略を開発することが急務です。

近年、MR分子イメージングなどの分子イメージングは​​、その優れた空間分解能と平均的な造影剤感度により、腫瘍の早期診断と治療のための新しいオプションになりました[3、4]。イメージングの強化以上のものを提供する新しい造影剤の開発は、MRI開発の主な動機の1つです。最近、強力な信号増幅システムとして超常磁性分子プローブを使用すると、MRターゲティング造影剤の感度が大幅に向上します。常磁性イオン複合体または磁性粒子結合mAbは、腫瘍緩和時間を変更するために使用されてきました[5]。磁性ナノ材料と腫瘍関連抗原（TAA）に対するmAbの組み合わせを使用した分子イメージングは​​、最近の研究の焦点です。 AFP、PSA、CEAなど、これまでに発見されたTAAのほとんどは、腫瘍組織特異的です[6]。したがって、これらのTAAに対するmAbを磁性ナノ材料と組み合わせると、これらの特定の抗原を発現する腫瘍に有用です。したがって、さまざまな腫瘍に適した一般的な腫瘍抗原を特定し、そのような抗原に対するmAbを磁性ナノ材料で標識することは、腫瘍分子イメージングに役立ちます。

ヘパラナーゼ（HPA）は、1999年に4つの研究所によって同時にクローン化された腫瘍転移関連遺伝子です[7、8、9、10]。内因性エンドグリコシダーゼのみが、細胞外マトリックス（ECM）の主要なプロテオグリカン成分であるヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）を分解できます。 HPAは転移性悪性腫瘍で遍在的に発現しており、その発現レベルは腫瘍転移と密接に関連しています。 HPAは、ECMおよびBMでHSPGを切断することにより、ECMおよび基底膜（BM）の完全性を破壊し、ECMに固定された分子の放出と活性化を引き起こし、腫瘍の血管新生と転移を促進します[11、12]。私たちの以前の研究は、HPAが腫瘍免疫療法のTAAとして使用できることを示しています[13、14、15、16]。ここでは、HPAが腫瘍転移の分子イメージングの一般的なTAAとして利用できるかどうか、および腫瘍分子イメージングにおけるその潜在的な用途を評価しようとしました。

この研究では、造影剤として磁性金ナノ粒子（30 nm）を使用し、HPA＆GoldMag分子プローブを構築するためのターゲティングベクターとしてHPA mAbを使用し、腫瘍の早期診断のためのMR分子イメージングにおけるこれらのプローブの実現可能性と重要性を調べました。転移。 HPA抗体のinvitro抗腫瘍生物学的効果も評価され、腫瘍治療におけるHPAmAbの適用の実験的基礎を提供しました。

メソッド

細胞株とマウス

この研究では7つの細胞株を使用しました。肝癌細胞株HepG2、ヒト胃癌細胞株MKN45およびSGC-7901、結腸癌細胞株SW480、およびヒト骨肉腫細胞株U2OSを含むヘパラナーゼ陽性細胞株は、American Type CultureCollectionから購入しました。ヘパラナーゼ陰性細胞株、ヒト乳癌細胞株MCF-7、およびヒト初代胚性線維芽細胞株HFは、Liang博士（Burn Research Institute、Third Military Medical University、Chongqing、China）から提供されました。 HepG2細胞は、10％ウシ胎児血清を含むDMEMで培養しました。 SGC-7901、SW480、U2OS、およびHF細胞は、10％ウシ胎児血清を含むRPMI1640で培養されました。 MKN45およびMCF-7細胞は、15％ウシ胎児血清を含むRPMI1640で培養されました。すべての細胞は5％CO ₂ で培養されました 37°Cのインキュベーターで、24〜48時間ごとに継代されました。 15匹のBALB / cヌードマウス（4〜5週齢）を第3軍事医科大学の動物学部から購入しました。動物実験は、第三軍事医科大学の地元の倫理委員会と合意して実施されました。すべてのヌードマウスは特定病原体除去環境で飼育されました。

ウエスタンブロット

以前の研究[17]に記載されている手順に従って、Hpaタンパク質の発現を検出するためにウエスタンブロットを実施しました。各細胞株をM-PER抽出試薬（PierceCo。）で溶解しました。タンパク質濃度は、BCAアッセイ（Bio-Rad、CA、USA）によって決定されました。 30マイクログラムのタンパク質を10％SDS-PAGEで分画し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレン（Roche、Rotkreuz、Switzerland）に転写しました。メンブレンを5％（ w ）でブロックしました / v ）TBST中のスキムミルク（20 mM Tris-HCl [pH 8.0]、150 mM NaCl、および0.1％[ v / v ] Tween-20）室温で2時間。次に、ブロッキングバッファー中の抗HPA抗体（Insight、Israel）の1：200希釈液で、4°Cで一晩メンブレンをプローブしました。メンブレンをTBSTで4回洗浄し、マウスIgGに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体と室温で1時間インキュベートしました。次に、メンブレンをTBSTでリンスし、タンパク質バンドをECLウエスタンブロッティング検出試薬（GE Healthcare、ニュージャージー州、米国）で視覚化しました。画像はQuantityOne 4.1ソフトウェア（Bio-Rad）で分析しました。実験は少なくとも3回繰り返されました。

免疫組織化学的染色

上記の細胞株におけるHpa発現は免疫細胞化学によって検出された。簡単に説明すると、上記の細胞を滅菌カバースリップ上で37°C、5％CO ₂ で培養しました。 48時間のインキュベーター。内因性ペルオキシダーゼ活性が0.3％H ₂ での処理によってブロックされた後 O ₂ -メタノール溶液で20分間、細胞をHpa一次抗体（抗体の希釈率は1：100）とともに4°Cで一晩インキュベートしました。 0.1％Triton X-100を含むPBSで完全に洗浄した後、スライドを二次抗体とともに20°Cで20分間インキュベートしました。最後に、スライドをアビジン-ビオチン酵素試薬とともに15分間インキュベートしました。次に、スライドを3,3'-ジアミノベンジジン/ H2O2溶液に浸しました。 PBSをネガティブコントロールとして使用しました。

HPA＆GoldMag分子プローブと原子間力顕微鏡写真の構成

分子プローブの構築は、GoldMagTM-CSキット（Xi’an Gold磁気ナノバイオテクノロジー会社、GNK0202、Xi’an、中国）を使用して操作手順に従って実行されました。 HPA抗体の濃度は1mg / mlです。原子間力顕微鏡写真（AFM）を使用して、ナノ粒子の形状、サイズ、および表面の外観を評価しました。ラベルのない磁性金ナノ粒子またはラベルの付いた磁性金ナノ粒子をカバーガラスに置き、室温で24時間風乾しました。乾燥したサンプルは、原子間力顕微鏡（AFM、Nanoscope、Digital Instruments、サンタバーバラ、カリフォルニア州）を使用して分析しました。

蛍光抗体法

簡単に説明すると、細胞を滅菌カバースリップ上で37°C、5％CO ₂ で培養しました。 48時間のインキュベーター。次に、細胞を4％（ w ）で固定しました。 / v ）PBS中のホルムアルデヒドを30分間、0.2％（ v / v ）TritonX-100を室温で5分間。カバースリップを10％（ v ）でインキュベートすることにより、細胞をブロックしました。 / v ）PBS中のヤギ血清を30分間。次に、細胞をHPA＆GoldMag分子プローブまたは通常のマウスIgG＆GoldMagプローブで1:50に希釈し、続いてCy3標識ヤギ抗マウスIgGを1：100に希釈して染色しました。次に、細胞を0.4 mg / mL DAPI（Sigma-Aldrich）で室温で10分間染色しました。顕微鏡画像は、レーザー共焦点顕微鏡を使用して取得されました。通常のマウスIgG＆GoldMagプローブをネガティブコントロールとして使用しました。

フローサイトメトリー

HPA＆GoldMagプローブの活性は、フローサイトメトリーによって決定されました。細胞をヤギ血清で1時間ブロックしました。次に、細胞を10μgのHPA＆GoldMagプローブまたは通常のマウスIgG＆GoldMagで4°Cで一晩染色し、PBSで4回洗浄した後、マウスIgGに対するFITC標識抗体と37°Cで1時間インキュベートしました。細胞をPBSで洗浄し、蛍光強度をフローサイトメーター（Becton Dickinson）で測定しました。

MRイメージング用の磁性金ナノ粒子のinvitro研究

磁性金ナノ粒子溶液（5 mg / ml）は、1％アガロース溶液を使用して2倍（1：20–1：1280）に段階希釈しました。溶液はEPチューブで固化した。 MRスキャンは、ブランクコントロールとして1％アガロースゲルを使用して実行されました。スキャンパラメータは次のとおりです。 TR600ミリ秒/ TE12ミリ秒;厚さ、2.0 mm; FOV、150 mm;およびT2WI; TR6000ミリ秒/ TE92ミリ秒;厚さ、2.0 mm; FOV、150mm。 HPA＆GoldMag MR分子プローブは、30nmの磁性金粒子で標識されたHPAmAbを使用して構築されました。細胞を100mm培養皿で日常的に培養し、HPA＆GoldMagプローブまたは陰性IgG＆GoldMagプローブを細胞培養に添加し、37°C​​で90分間インキュベートしました。未結合のプローブは、適切な量のヤギ血清を加えることによってブロックされました。 PBSで3回洗浄した後、細胞をトリプシンで消化しました。次に細胞を回収し、1％アガロース溶液と混合し、1.5mlEPチューブに移しました。 MRスキャンは、動物用の特定の磁気共鳴コイルを使用して、3.0 T MRIスキャナー（スキャンパラメーターは上記と同じ）を使用して実行されました。スキャンする前に、マウスを1％ペントバルビタールで麻酔し、スキャンベッドに入れました。

MRイメージング用の磁性金ナノ粒子のinvivo研究

4〜6週齢のオスのヌードマウス（26〜30 g）に、200μlのMKN45細胞を股関節の皮下に注射しました。各ヌードマウスに約2.0×10 ⁶ を注射しました。 細胞。 2週間後、腫瘍が見えるようになり、MR画像に使用されます。注射前と注射の2時間後に、3.0 TMRIスキャナーを使用してMRスキャンを実行しました。パラメータはT2WI、TR6000 ms / TE92msでした。厚さ、1.5 mm;およびFOV、120mm。その後、腫瘍、脾臓、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、および肺の組織を収集して、プルシアンブルーFe染色を実施しました。

統計分析

すべてのデータは、平均±標準偏差として表されます。 ANOVA分析は、SPSS13.0ソフトウェアを使用して実行されました。 P 値<0.05は、差が有意であることを示しました。

結果

HPAはさまざまな癌細胞で異なって発現されていました

ウエスタンブロットおよび免疫組織化学的染色分析の両方を使用して、HepG2、SGC-7901、MKN45、MCF-7、SW480、およびU2OS細胞におけるHpaの発現をテストしました。その結果、Hpaの発現はHepG2、SGC-7901、MKN45、SW480、およびU2OS細胞ではるかに高かったのに対し、MCF-7細胞でははるかに低い発現が検出されました（図1）。

さまざまな細胞株におけるHpaタンパク質の発現。 a ウエスタンブロットを使用して、さまざまな腫瘍細胞株でHPAタンパク質の発現（65 kDa）を検出しました。レーン1、HepG2;レーン2、SGC-7901;レーン3、MKN45;レーン4、MCF-7;レーン5、SW480;レーン5、U2OS。 b HepG2、SGC-7901、MKN45、MCF-7、SW480、およびU2OS細胞株におけるHPA発現の免疫組織化学的分析

HPA＆GoldMag分子プローブの構築と検出

HPA＆GoldMag分子プローブは、磁性金ナノ粒子の表面間のカップリング反応を使用して、HPAmAbを磁性金ナノ粒子とカップリングすることによって調製されました。原子間力顕微鏡（AFM）を使用して、プローブの表面構造を直接観察しました。 HPA mAbで標識しない場合、磁性金ナノ粒子の平均直径は13.78 nmであることを示しました（図2a）。粒子サイズは均一でした。 HPA mAbでラベル付けされた後、平均直径は約24.80 nmでした（図2b）。これらの結果は、磁性金ナノ粒子がHPAmAbとの結合に適していることを示唆しています。

a 磁性金ナノ粒子とHPAmAbの結合モデル。 b 磁性金ナノ粒子の原子間力スキャン

HPA＆GoldMag分子プローブはHPAに特異的に結合できます

まず、分子プローブとHPA間の結合の特異性を蛍光抗体法で評価しました。その結果、HepG2、MKN45、SW480、U2OS細胞の細胞質では大量の赤色蛍光が検出されたが、MCF-7細胞では少量の赤色蛍光しか検出されず、HF細胞では蛍光が検出されなかった。 。ただし、ネガティブマウスIgG＆GoldMagは、どの細胞株でもHPAとの相互作用を示しませんでした（図3）。さらに、フローサイトメトリーを使用して、HPA＆GoldMag分子プローブの特異性をテストしました。 HF細胞で陰性反応を示し、MCF-7細胞で40％の陽性率、HepG2、SW480、U2OS、およびMKN45細胞で95％の陽性率を観察しました。これらの結果は、プローブが腫瘍細胞で発現したHPAに特異的に結合できることを示しています。

蛍光抗体法およびフローサイトメトリーによって検出されたプローブの特異性および結合活性。 a 示されているようにプローブを使用して免疫蛍光を実施した。 b フローサイトメトリーを使用して、HPA＆GoldMag分子プローブの特異性をテストしました

invitroでのHPA＆GoldMagプローブのMRイメージング

1％アガロースを使用した段階希釈後、T2WIシーケンスを使用した磁性金ナノ粒子のMRイメージングでは、異なる信号の減少が示されました。 1：640希釈のT2WIシグナルは、1％アガロースゲルコントロール（ P ）のシグナルよりもはるかに低かった。 <0.05）（図4a、b）。結果は、磁性金ナノ粒子が低濃度でも効果的にMR信号を低減できることを示しており、磁性金ナノ粒子が分子イメージングに適している可能性があることを示唆しています。次に、HPA＆GoldMag分子プローブを使用してHepG2、SGC7901、MKN45、SW480、U2OS、HF、およびMCF-7細胞を標識し、1％アガロースと混合して、3.0 T磁気共鳴（MR）下に置きました（図4c）。アキシャルスキャンとコロナルスキャンのT1WI（図4c、d）またはT2WI（図4c、e）シーケンスを使用したMRスキャン。結果は、T1WIシーケンスと比較して、MRスキャンのT2WIシーケンスを使用した信号が大幅に減少したことを示しました（ P <0.05）一方、標識後のHF細胞のシグナルは有意に変化しませんでした（ P > 0.05）、標識後のMCF-7細胞のシグナルは最小限に減少しました（ P <0.05）。

a 2段階希釈後の磁性金ナノ粒子のMRイメージング。 b 2つの連続希釈された磁性金ナノ粒子のMRイメージング信号強度の統計結果の図。 c プローブで標識した後のすべての細胞のMRイメージング。レーン1、HF;レーン2、MCF-7;レーン3、HepG2;レーン4、SGC-7901;レーン5、MKN45;レーン5、SW480;レーン6、U2OS。 d HPA＆GoldMagプローブで標識された細胞のT1WIシーケンスを使用したMRイメージングからの信号強度を比較した統計結果。 e HPA＆GoldMagプローブで標識された細胞のT2WIシーケンスを使用したMRイメージングで検出された信号強度の統計結果

ヌードマウスのHPA＆GoldMagプローブのMRイメージング

すべてのヌードマウスは、50 mg / kgのペントバルビタールナトリウムで麻酔されました。分子プローブをヌードマウスの尾静脈に注射し、投与前と投与2時間後にMRスキャンを実施しました。プローブは肺と肝臓のマクロファージに吸収され、腎臓から排泄される可能性があるため、スキャン結果は、注射後、ヌードマウスの腫瘍、肝臓、腎臓、および肺組織の信号が、信号と比較して大幅に減少したことを示しました。注射前に検出されたもの（ P < 0.05）（図5）。

a コントロールまたはHPA＆GoldMagプローブの注射前と注射後2時間のヌードマウスのMR画像。矢印はマウスの腫瘍を示しています。 b ヌードマウスにコントロールまたはHPA＆GoldMagプローブを注射する前後のT2WIを使用したMR画像からの信号強度の比較。 ^* P <0.01

ディスカッション

腫瘍の浸潤と転移は、腫瘍の予後不良を引き起こす複雑な生物学的プロセスです。したがって、腫瘍転移の早期診断は、臨床治療戦略を選択するための重要な戦略です。 MRIは、腫瘍を検出するための有用な非侵襲的方法です。多次元の高コントラスト組織イメージングを可能にします。ただし、MRIは小さなサイズの腫瘍を検出できなかったため、腫瘍の可視化を強化するには、金属ナノ粒子（鉄、金など）などの高コントラストの薬剤を使用する必要があります[18、19、20]。新しいナノ材料に基づく新しい造影剤の開発は、癌の早期発見のためのMRI技術を改善するのに有益です。造影剤の中で、超常磁性酸化鉄粒子（SPIO）は、MR分子イメージングの一般的な造影剤として使用されます。この場合、磁性金ナノ粒子は、Fe ₃ を含む超常磁性ナノコンポジット材料です。 O ₄ （コア）/ Au（シェル）構造[21,22,23,24]。無機ナノ粒子の超常磁性特性は、磁気共鳴画像法（MRI）に役立ちます[25]。これらのナノ粒子と組織特異的薬剤（抗体または低分子量物質）の組み合わせにより、腫瘍の正確な検出と診断が可能になります。多くの研究により、HPAは多くの腫瘍で発現しており、その発現レベルは腫瘍の転移能と密接に関連していることが示されています[26]。 HPAは、HSPGの分解を通じてECMとBMの完全性を破壊し、ECMに固定されたbFGF、HGF、VEGFなどの活性分子を放出して腫瘍の進行を促進します[27、28、29、30]。 HPAは主に中期から後期の腫瘍で発現するため、以前の研究では、HPAを腫瘍治療の一般的なTAAとして使用できることが示されています[13、14、15]。したがって、HPAは腫瘍分子のイメージングと治療のための潜在的に有用なターゲットである可能性があります。

磁性金ナノ粒子は、Fe ₃ を含む超常磁性複合ナノ材料です。 O ₄ Au ³⁺ の還元によって生成される（コア）/ Au（シェル）構造 超常磁性Fe ₃ からのヒドロキシルアミン塩酸塩による O ₄ 粒子[31、32]。標識方法は非常に簡単なので、細胞選択、タンパク質精製、核酸分離、イムノアッセイなどの生物学的用途に使用できます。したがって、確立された手順に従うことにより、抗HPA抗体に結合した金でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を首尾よく調製および特性評価することができました。この研究では、50 nmの磁性金粒子よりもはるかに安定しているため、30nmの磁性金粒子を使用しました。 1ミリグラムの30nm磁性金粒子は、約200μgのHPAmAbに結合する可能性があります。私たちのデータは、1：640希釈（約10μg）で磁性金ナノ粒子を使用すると、3.0 T MRIスキャン（ P <）でブランクコントロールグループと比較してシグナル伝達が低下することを示しました。 0.05）。したがって、磁性金粒子を使用した生体内イメージングの臨界値を計算できます。

続いて、磁性金ナノ粒子結合HPA mAbプローブの活性と特異性が、レーザー共焦点顕微鏡、フローサイトメトリー、および原子間力顕微鏡を使用して検出されました。簡単に説明すると、プローブは、標的プローブとネガティブコントロールプローブをHPA（+）細胞と（-）細胞の両方とインキュベートすることによってinvitroでテストされました。ここで、ヒトMCF-7乳癌細胞は弱いHPA発現を示したが、MKN45、SW480、U2OS、HepG2、およびSGC-7901細胞はより高いHPA発現を示した。さらに、ナノ粒子の特異性をさらに証明するために、通常のマウスIgGをHPAmAbのコントロールとして使用しました。

プローブの特異性がinvitroでテストされた後、 標的プローブと対照プローブは、ヒトMKN45胃癌細胞を皮下注射したヌードマウスに注射しました。腫瘍組織の直径が1cmに達したら、3.0 T MRIチャンバーを使用してMRスキャンを実行し、プローブの注入前後の腫瘍の信号変化を検出しました。スキャン結果は、プローブ注射前の信号と比較して、プローブ注射後2時間で腫瘍信号が大幅に減少したことを示しました。これらの結果は、HPA＆GoldMagプローブが、MKN45細胞を保有するヌードマウスで優れた免疫活性と優れた効果を発揮することを示しています。

結論

要約すると、HPA mAbと組み合わせたHPA＆GoldMag分子プローブが優れた物理的および化学的特性を持っていることを示しました。プローブは、invitroおよびinvivoの両方で高HPAを発現する多くの腫瘍細胞を特異的に標的にすることができます。 3.0 T MRIスキャンを使用すると、プローブは腫瘍組織のT2WI信号を大幅に低減することが示されました。これは、腫瘍転移の分子イメージングの実験的基盤を提供する可能性があります。

略語

AFM：

原子間力顕微鏡写真

BM：

基底膜

CT：

コンピュータ断層撮影

ECM：

細胞外マトリックス

HPA：

ヘパラナーゼ

HSPG：

ヘパラン硫酸プロテオグリカン

MRI：

磁気共鳴画像法

PVDF：

ポリフッ化ビニリデン

TAA：

腫瘍関連抗原