二重ドラッグデリバリーのためのナノリポソームベースのシステムの物理化学的特性に関する調査

背景

トリプルネガティブ乳がんなどの難治性のがんは、さまざまなシグナル伝達ネットワークと高度に相互接続されたDNA損傷応答のため、標準的な治療法による治療には限界があります[1,2,3]。そのような難治性腫瘍の初期の化学療法感受性を高める治療戦略は、限界に挑戦するために研究されてきました[4、5]。 DNA損傷剤を使用しながら発癌性シグナル伝達経路を抑制する最近の研究は、組み合わせ治療戦略の1つです[6、7、8]。この研究は、耐性癌細胞に対する成長因子阻害剤の前処理が、遺伝子毒性薬に対するアポトーシス反応を相乗作用させることを示唆しました[9、10]。腫瘍細胞の死滅の程度を高め、治療中の総薬物曝露を潜在的に減少させるために、複数の癌細胞特異的生存経路を標的とする治療戦略に対する非常に重要な臨床的必要性があります[11、12]。一方、2種類の薬剤のinvitro相乗効果をクリニックに反映させるためには、薬物動態（PK）特性の違いにより、両方の薬剤を時間差で放出できる送達システムが不可欠です。薬物と、同じ癌細胞を適切な時間的順序で標的化することの難しさ[13、14、15、16]。

ナノリポソームデリバリーシステムは、併用療法に適用できるデュアルドラッグデリバリーシステムの1つです。リポソームの主成分は、一般的に細胞膜と同様のリン脂質です。リン脂質は、内部コンパートメントと二分子膜を備えた二層同心球を形成します[17]。ナノリポソームは、異なる物理化学的特性を有する薬物がリポソームの内部区画および二重層膜にロードされ、次いで病変に送達されることを可能にすることができる。したがって、ナノリポソームシステムを使用して送達される2つの薬物のインビボ相乗効果は、各薬物のPK特性の調整だけでなく、いわゆる強化された透過性および保持（ EPR）腫瘍組織の効果。ナノリポソームは、内部コンパートメントに薬物をカプセル化するだけでなく、疎水性薬物を可溶化し、安定性を高め、血液循環特性を調節し、腫瘍組織への蓄積を誘導します[18]。

ナノリポソームベースの併用化学療法デリバリーシステムに関する最近の研究にもかかわらず、システムの準備プロセスは、信頼性と再現性のある製造のために最適化する必要があり、より高度なシステムの開発のためにそれらの物理化学的特性を解明する必要があります[13、19]。私たちの研究では、エロチニブ（ERL; ERL遊離塩基、log _P ）と一緒にカプセル化されたナノリポソームデリバリーシステム =3.3）およびドキソルビシン（DOX; DOX HCl、log _P =1.27）いわゆる非PEG化リポソーム製剤[13]を除いて、以前の報告に従ってモデルナノリポソームシステムとして単一リポソームベシクルを調製し、システムの物理化学的特性を研究しました。薬物の時間差放出を調査するために、インビトロ薬物放出研究を実施した。押し出し、超音波処理、高圧均質化などのいくつかの方法[20,21,22]の中で、プローブソニケーターを使用した超音波処理は、より効率的な処理性のためにリポソームの直径を小さくするために利用されました。薬物のカプセル化を最適化するために、pHまたは硫酸アンモニウム勾配法などの薬物負荷技術が薬物のカプセル化効率（EE）に及ぼす影響に関する比較研究を実施しました。さらに、薬物カプセル化の最も効果的なプロセスは、薬物のEEに対するプロセス条件の影響を調査することによって決定されました。 ERLとDOXの両方でカプセル化され、適切な順序で薬物を放出するナノリポソームデュアルドラッグデリバリーシステムの準備条件が最適化されました。最適化された調製方法とデュアルドラッグデリバリーシステムの特性は、信頼性と再現性のある調製プロセスのプラットフォームと、翻訳研究のためのより高度な送達システムを示唆しています。

メソッド

資料

1,2-ジステアロイル- sn -グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）および1-パルミトイル-2-オレオイル- sn -グリセロ-3-ホスホ-（1 '- rac -グリセロール）（ナトリウム塩）（POPG）は、Avanti Polar Lipids、Inc。（Alabaster、Al、USA）から供給されました。コレステロールはSigma-Aldrich、Corp。（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手しました。ドキソルビシン（DOX）塩酸塩およびエルロチニブ（ERL）遊離塩基は、それぞれBoryung Co.、Ltd。（ソウル、韓国）およびShanghai Send Pharmaceutical Technology Co.、Ltd。（上海、中国）から購入しました。硫酸アンモニウム（AS）および無水クエン酸（CA）は、Daejung Chemicals＆Metals Co.、Ltd。（Siheung-si、Korea）から供給されました。他のすべての試薬は試薬グレードであり、Sigma-Aldrich、Corp。（セントルイス、ミズーリ州、米国）から供給されました。

二重薬物カプセル化ナノリポソームの調製

ERLとDOXの両方でカプセル化されたナノリポソームを調製するための一般的なプロセスを図1に示します。簡単に言うと、ERLカプセル化リポソームは、いわゆる薄い脂質膜水和法を使用して調製されました[23]。薬物をリポソームの脂質二重膜にカプセル化するために、ERLを脂質混合物に添加して脂質薄膜を形成した。リポソームの直径は、プローブソニケーター（Vibra Cell; Sonics＆Materials、Inc.、Newtown、CT、USA）を用いた超音波処理によって縮小されました。 DOXは、ナノリポソームの膜貫通イオン濃度勾配を使用して、ERLカプセル化ナノリポソームの内部水性コンパートメントにカプセル化されました。プロセスの詳細な実験的および分析的方法は、次のセクションで提案されています。

二重薬物カプセル化ナノリポソームの調製と特性評価のプロセス

ERLでカプセル化されたリポソーム

27：20：3（ w ）の比率のDSPC、コレステロール、POPGで構成される脂質混合物 / w / w ）総脂質に対する薬物の重量比3:50でERL遊離塩基と混合した。これらの混合物を、9 mLのクロロホルム：メタノール=2：1（ v ）の混合溶媒に溶解しました。 / v ）。脂質溶液を丸底フラスコに入れ、脂質膜を形成するために、40°Cで真空下でロータリーエバポレーター（Rotavapor R-210;BÜCHILabortechnikAG、Flawil、Switzerland）を使用して溶媒を除去しました。膜を真空中で一晩乾燥させて、すべての残留溶媒を除去した。これらのプロセスでは、ERL分子は疎水性の引力を介して脂質膜に挿入され、次にリポソームの脂質二重層膜に自発的にカプセル化されます。これは、次の水和プロセスによって形成されます。

ERLを含む脂質膜を水和させるために、丸底フラスコの内面に形成された膜に、8 mLの250〜400 mMASまたは300mMクエン酸緩衝液（pH 3.9）を添加しました。フラスコを回転させて65°Cで30分間メンブレンをインキュベートした後、バスソニケーター（Branson 3510E-DTH; Branson、Danbury、CT、USA）を使用してリポソーム懸濁液を超音波処理しました。リポソームの直径を小さくするために、プローブソニケーターを使用して、5秒オンと2秒オフのパルス、振幅20％、氷水浴でのパルスあたり36Jのエネルギーなどの条件でリポソーム懸濁液を超音波処理しました。 、または磁気攪拌下の水浴。ナノリポソームにアンロードされたASを除去するために、透析チューブセルロース膜（14,000分子量カットオフ（MWCO）; Sigma-Aldrich Corp.、St。ルイ、ミズーリ州、米国）。クエン酸緩衝液を使用して調製したナノリポソーム懸濁液の場合、300 mM重炭酸ナトリウム緩衝液を使用して溶液のpHを約6.5に調整し、ナノリポソームの内側と外側の間に勾配を付けました。

DOX-ERLカプセル化ナノリポソームへのロード

DOXをERLカプセル化ナノリポソームにカプセル化するために、DOX塩酸塩を最初に65°Cで0.9％NaCl水溶液に溶解しました。一般に、2mLの1.5mg / mL DOX溶液を、8mLのASおよびERLカプセル化またはクエン酸およびERLカプセル化ナノリポソーム懸濁液に添加しました。 DOXを添加したナノリポソーム懸濁液の薬物負荷プロセスは、インキュベーション、バスソニケーターを使用した超音波処理、室温（RT）での平衡化、および透析チューブセルロース膜を使用したPBS（pH 7.4）に対する透析で構成され、カプセル化されていないDOXをナノリポソーム懸濁液。 DOXのEEに対するDOX負荷条件の影響は、4つの実験グループを使用して調査されました。グループ1は、DOX溶液とリポソームの混合物であり、65°Cで30分間のインキュベーション、65°Cで5分間の超音波処理、および一晩の透析のシーケンスで処理されました。グループ2を65°Cで30分間インキュベートし、65°Cで5分間超音波処理し、RTで30分間平衡化した後、一晩透析しました。グループ3を65°Cで30分間インキュベートし、65°Cで15分間超音波処理した後、一晩透析しました。グループ4を65°Cで30分間インキュベートし、65°Cで15分間超音波処理し、RTで30分間平衡化した後、一晩透析しました。

二重薬物カプセル化ナノリポソームの直径、形態、および物理的安定性

薬物にカプセル化されたナノリポソームの直径は、粒子サイズアナライザー（ELS-Z;大塚電子株式会社、大阪、日本）を使用して25°Cで測定されました。シングルまたはデュアルの薬物カプセル化ナノリポソームの形態と平均直径は、電界放出型透過型電子顕微鏡（FE-TEM）（JEM 2100F; JEOL Ltd.、東京、日本、韓国基礎科学研究所に設置）を使用して200kVで観察されました。サンプルを調製するために、ナノリポソーム懸濁液をカーボンコーティングされた銅グリッド上にドロップキャストし、顕微鏡で観察する前にグリッドを室温で風乾した。時間の関数としてリポソームの直径の変化を監視することにより、4、25、および37°Cのさまざまな温度でPBS（pH 7.4）でインキュベートされた二重薬物カプセル化ナノリポソームの物理的安定性を調査しました。リポソームの直径は、粒子サイズアナライザー（Zetasizer Nano ZS、Malvern Instruments Limited、英国ウスターシャー）を使用して測定しました。

EE of Drugs

二重薬物カプセル化ナノリポソームにおけるDOXまたはERLのカプセル化効率（EE）は、次の式によって決定されました。 （1）。

ここで C _f は、ナノリポソームを10％Triton-X 100で破壊した後、それらからERLまたはDOXを完全に放出するために測定された、ナノリポソーム内のERLまたはDOXのカプセル化された量です。 ERLの吸光度は、UV-Vis分光計（DU-800分光光度計; Backman Coulter Inc.、Fullerton、CA、USA）を使用して345 nmで測定し、DOXの蛍光強度は分光蛍光計（SFM-25; Tegimenta AG、Rotkreuz）を使用しました。 、スイス）励起波長と発光波長がそれぞれ495nmと590nmです。 ERLまたはDOXの量は、事前に作成したERLまたはDOXの検量線を使用して計算しました。 C _i 脂質混合物またはERLカプセル化ナノリポソームに添加されるERLまたはDOXの量です。量は、対応する波長での各薬物の吸光度または蛍光強度を測定して決定されました。

薬物放出

透析カセット（10,000 MWCO、Slide-A-Lyser透析カセットG2; Thermo Scientific Corp.、ロックフォード、イリノイ州、米国）に、DOXとERLの両方でカプセル化されたナノリポソームの懸濁液を充填しました。カセットをPBS（pH 7.4）に入れ、放出試験媒体を37°Cで継続的に攪拌しました。所定の時点で、サンプルのアリコートをカセットから取り出して各薬物の濃度を決定し、次に薬物放出を以下の式によって計算した。 （2）。

ここで D _t は、放出試験期間中の特定の時間にナノリポソームに残っているDOXまたはERLの濃度であり、 D _i は、薬物放出実験の前にナノリポソームにカプセル化されたDOXまたはERLの濃度です。 DOX濃度は、励起波長と発光波長のそれぞれ495nmと590nmで蛍光分光計を使用してサンプルの蛍光強度を測定して決定されました。 ERL濃度は、UV-Visible分光計を使用して345nmでのサンプルの吸光度を測定して決定されました。

統計分析

特に記載がない限り、結果は平均±SEMとして表されます。

結果と考察

ナノリポソームの特性に対する調製プロセスの影響

二重薬物カプセル化ナノリポソームは、ERLを脂質二重層膜にカプセル化し、DOXをナノリポソームの内部コンパートメントにカプセル化して調製された。 ＥＲＬのみでカプセル化されたリポソームは、ＡＳ水溶液でＥＲＬが組み込まれた脂質膜を水和するように調製された。これらのプロセス中に、ERL分子は疎水性の引力を介して脂質膜に組み込まれ、リポソームの脂質二重層膜に自発的にカプセル化されます。水和後、ホーン型プローブソニケーターを用いてリポソーム懸濁液を超音波処理し、リポソームの直径を小さくした。超音波処理と冷却方法がリポソームの直径に及ぼす影響を調べるために、さまざまな冷却条件下で超音波処理時間を増やしてリポソームを処理しました。結果を図2に示します。図2aは、超音波処理時間の影響を示しています。氷水浴の冷却条件下で処理されたリポソームの直径および多分散性指数（PDI）。超音波処理によって処理されていないERLカプセル化リポソームの直径は759±44nmでした。ただし、超音波処理の10分まで、リポソームの直径は222±40 nmに著しく減少し、10分後、超音波処理時間が長くなっても直径に大きな変化はありませんでした。これらの結果は、水和によって形成されたERLカプセル化リポソームが主に多層ベシクル（MLV）であることを示しています。超音波処理によってMLVタイプのリポソームに供給される高エネルギーは、MLVの多層を剥離し、大きなリポソームを分解します。水溶液中で、MLVから分離された脂質は、疎水性の引力によって自己組織化され、大きな単層ベシクル（LUV）または小さなUV（SUV）タイプのナノリポソームに変換されます。これらの現象が繰り返されると、ナノリポソームの平均直径は徐々に減少します[24、25、26]。図2aに示すように、リポソームの直径は短時間の超音波処理で著しく減少しました。この間、MLV型リポソームのほとんどがLUV型またはSUV型リポソームに変換されたと考えられています[27]。 10分より長い超音波処理により、リポソームの直径がわずかに減少しました。これは、超音波処理時間による小胞タイプの変換が少ないことを示しています。超音波処理時間の増加とともにリポソーム直径のPDIが減少し、20分後にPDIがわずかに増加したにもかかわらず、時間とともにリポソーム直径が均一になったことを示唆しています。図2bは、ウォーターバスの冷却条件下で処理されたリポソームの直径とPDIに対する超音波処理時間の影響を表しています。超音波処理で処理されていないリポソームの直径は1433±143nmでした。リポソームの直径は、超音波処理の5分まで337±67 nmに大幅に減少し、5分後、15分まで直径が徐々に減少し、その後直径はほとんど変化しませんでした。リポソームの直径のPDIは、15分まで超音波処理時間とともに変化し、その後プラトーに達しました。水浴条件下では、リポソームの直径を未処理のリポソームの直径の30％未満に減少させるために費やされた時間は、氷水浴条件下で費やされた時間よりも短かった。リポソーム径の縮小は、超音波処理により発生した熱エネルギーをMLV型リポソームに伝達したものと考えられます。氷水浴条件と比較して、水浴条件で超音波処理されたリポソーム懸濁液の温度が高くなりすぎて、超音波キャビテーションによるバルク加熱によって生じたリポソーム懸濁液の熱があまり効率的に放出されなかったことを意味する。リポソーム懸濁液を、媒体の蒸発や過熱によって引き起こされる脂質分子の劣化の可能性などの副作用から守るために、超音波処理の冷却条件として氷水浴を選択しました。他方、超音波処理されたリポソームは、カプセル化されていないＡＳを除去するために透析された。超音波処理と透析を使用して調製されたERLおよびASでカプセル化されたナノリポソームは、平均ナノリポソーム直径が約140 nmであり、透析によるナノリポソーム直径のわずかな減少を示唆しています。 ERLおよびASでカプセル化されたナノリポソームは、AS勾配法を使用したナノリポソームの内部コンパートメントへのDOXカプセル化に利用されました。

ERLカプセル化ナノリポソームの直径と多分散度指数に対するプローブ超音波処理時間の影響：氷水浴（ a ）またはウォーターバス（ b ）超音波処理中の容器内のリポソーム懸濁液の冷却（ n =3、データは平均±SEMとして表されます）

図3は、DOXローディングプロセス中のバスソニケーターを使用した超音波処理の時間に応じた、DOXおよびERLでカプセル化されたナノリポソームの直径を示しています。図2aに示すように、直径のわずかな変動は、ERLでカプセル化されたナノリポソームの10分間の超音波処理後の変動と同様でした。超音波処理時間の増加にもかかわらず、ナノリポソームの直径は、45分の超音波処理まで大幅に変化しませんでした。これらの結果は、DOXおよびERLでカプセル化されたナノリポソームがLUVまたはSUVであるという事実に起因する可能性があります[27]。一方、超音波処理時間が45分を超えると、平均ナノリポソーム直径のSEMが増加し、リポソームサンプル間の差が増加したことを示しています。超音波処理時間が長くなるにつれて、直径のPDIは減少しました。これらの結果は、60分の超音波処理後にPDIがわずかに増加したにもかかわらず、リポソームの直径の均一性が超音波処理時間とともに増加したことを示唆しています。要するに、超音波処理によるナノリポソームの直径の変化は、リポソームがMLVからLUVまたはSUVに変換される変換段階で最も高かった。したがって、脂質膜の水和とERLカプセル化ナノリポソームの内部コンパートメントへのDOXカプセル化の間に比較的短時間で処理を行った場合、リポソームの直径を小さくするための超音波処理が最も効果的でした。

DOXおよびERLでカプセル化されたナノリポソーム（ n ）の直径および多分散度指数に対するバス超音波処理時間の影響 =3、データは平均±SEMとして表されます）

EEに対する薬物充填方法の影響

二重薬物カプセル化ナノリポソームは、ERLの約30％EEとナノリポソーム直径の140nmを備えたERLカプセル化ナノリポソームへのDOXローディングを使用して調製されました。リポソームから薬物を完全に放出するために界面活性剤でリポソームを破壊した後、リポソームにカプセル化されたＤＯＸまたはＥＲＬの量を測定した。 DOXの蛍光強度とERLの吸光度は、それぞれ分光蛍光分析とUV-Vis分光法によって測定されました。 ERLおよびDOXでカプセル化されたナノリポソーム中のDOXのEEに対するDOXローディング法の影響を調査するために、pH勾配法またはAS勾配法などのアクティブローディング法をDOXカプセル化に利用しました。 2つの薬物負荷法のEEの違いを調査し、その結果を図4に示します。AS勾配法を使用したDOXのEEは90％以上であり、pH勾配法を使用したEEは約17％、ASグラジエント法がpHグラジエント法よりもDOXカプセル化にはるかに効果的であることを示しています[28]。

DOXローディング法および硫酸アンモニウム（AS）濃度による二重薬物カプセル化ナノリポソームにおけるDOXのカプセル化効率：CAクエン酸（ n =3、データは平均±SEMとして表されます）

AS濃度によるDOXのEEの変化を比較すると、350 mM ASでEEが最も高く、EEのSEMが最も低かった。 ASグラジエントまたはpHグラジエント法は、薬物転座メカニズムを利用します。これにより、ナノリポソームの膜貫通イオン濃度勾配から生成される駆動力により、ナノリポソームの外側の薬物がナノリポソームの内側コンパートメントに移動します[29、30]。しかしながら、AS勾配法によるDOXのEEは、pH勾配法のそれよりもかなり高かった。これらの結果は、イオン化されたDOXとナノリポソーム内の対イオンとの間の結晶性が高いため、AS勾配法がpH勾配法よりも結晶複合体の開発に効果的であるという事実に起因する可能性があります[31、32]。

EEに対する薬物負荷条件の影響

DOX溶液とERLカプセル化ナノリポソームの混合物の処理条件がDOXローディングプロセス中のDOXのEEに及ぼす影響を調査するために、図5aに示す4つの実験グループを設計し、さまざまな処理条件に従って実験しました。グループ1は、インキュベーション、超音波処理、および一晩の透析のシーケンスで処理された混合物でした。グループ2では、超音波処理した混合物の平衡化がEEに及ぼす影響を調べるために、混合物をインキュベートし、超音波処理し、RTで30分間平衡化した後、一晩透析しました。 EEに対する長期超音波処理の影響を調査するためのグループとして、グループ3は混合物をインキュベートし、65°Cで15分間超音波処理した後、一晩透析しました。さらに、EEに対する長期超音波処理と平衡化の影響を調査するためのグループとして、グループ4は混合物をインキュベートし、65°Cで15分間超音波処理し、RTで30分間平衡化した後、一晩透析しました。すべてのグループで、DOXローディングはASグラジエント法を使用して実行されました。図5bに示すように、グループ1、2、3、および4のDOXのEEは、それぞれ93±7.8、98±2.5、83±4.9、および59±4.2％でした。グループ3のEEと比較して、グループ1のEEはより高く、バス超音波処理の期間が短いほど、ナノリポソームのEEを増加させるためのより効果的な処理であることを示しています。グループ1のEEと比較した場合、グループ2のDOXのEEは高かった。グループ4のEEは、実験したすべてのグループの中で最低でした。グループ2に適用された短期超音波処理後の平衡化によるEE増強とは対照的に、グループ4に適用された長期超音波処理後の平衡化はEE増強に効果的ではありませんでした。これらの結果は、懸濁液に供給される過剰な量のエネルギーが原因である可能性があり、これは、上記の浴超音波処理中にナノリポソームを破壊する可能性があります。また、グループ3および4の長期浴超音波処理により、ナノリポソーム中のAS含有量が減少したため、EEが低下したと考えられます。ナノリポソーム懸濁液の温度が相転移温度（ T ）をはるかに超えて上昇したため _c ）長期の浴超音波処理により、脂質二重層の流動性が増加し、したがってリポソームからのAS放出が誘導された。グループ3のナノリポソームサンプルは、バス超音波処理の直後に透析され、サンプルの急速な冷却が示唆されました。対照的に、グループ4のナノリポソームサンプルは、AS放出を維持し、リポソーム外でのDOX-硫酸塩複合体の形成を増加させ、したがってEEを低下させる可能性のある平衡化に続く、長期浴超音波処理によって処理されました。長期超音波処理後の平衡化は効果的ではありませんでしたが、これらの結果は、DOX溶液とERLカプセル化ナノリポソームの混合物の連続処理などのDOXローディングプロセス- T > _c リン脂質、バス超音波処理、 T 以下の平衡 _c たとえば、RTで、一晩透析を行うことは、平衡治療を行わない他のプロセスよりもEEを増加させるためのより効果的な方法です[33,34,35]。

さまざまな薬物負荷条件に応じた、二重の薬物カプセル化ナノリポソームにおけるDOXのカプセル化効率：各実験グループの薬物負荷条件（ a ）および実験グループの薬物カプセル化効率（ b ）（ n =3、データは平均±SEMとして表されます）

二重薬物カプセル化ナノリポソームの形態と物理的安定性

図6は、TEMで観察されたナノリポソームの形態を示しています。 TEM観察用のサンプルは、ERLおよびDOXで共カプセル化されたナノリポソームをカーボンコーティングされた銅グリッドにドロップキャスティングし、RTで空気中で乾燥させることにより調製しました。二重薬物カプセル化リポソームの特性を単一薬物カプセル化リポソームと比較するために、ERLカプセル化またはDOXカプセル化ナノリポソームの形態をTEMによって観察した。図6aに示すように、薬物でカプセル化された二重ナノリポソームの直径は200 nm未満であり、形状はほぼ球形でした。 ＴＥＭ分析によって観察されたリポソームの直径は、動的光散乱を利用する粒子サイズ分析器を使用して測定された値と一致した。図6bは、リポソーム内にDOX-硫酸塩複合体を含む単一のナノリポソームの画像を示しています。錯体は、プロトン化されたDOXカチオンと二価の硫酸アニオンの間の引力によって形成された結晶であると想定されました[36]。図6cは、高解像度（HR-）TEM画像を示しています。これは、図6bに存在するナノリポソームの最も外側の領域に薬物結晶を示しています。この画像は、ナノリポソームの内部コンパートメント内の結晶性の高い格子と結晶性の低いドメインが、グリッド上の炭素に近いアモルファスドメインを持っていることを明らかにしました[37]。ナノリポソームの最も外側の領域のアモルファスドメインは、高エネルギーの電子ビームにさらされたときの脂質二重層の不安定性に起因する可能性があります。図6dに存在する選択領域電子回折（SAED）パターンは、明るい回折スポットの規則性を示し、図6cに示されている結晶が高度に秩序化された結晶格子を持っていることを示しています[38]。デュアルドラッグカプセル化ナノリポソームのTEM分析結果をシングルドラッグカプセル化ナノリポソームの結果と比較するために、ERLカプセル化ナノリポソームをTEMで観察し、画像を図6eに示します。図6eに存在するナノリポソームの最も外側の領域をHR-TEMで観察し、その結果を図6fに示します。その結果、最も外側の領域は、グリッド上の炭素に隣接する多数の小さな結晶とアモルファスドメインで構成されていることがわかりました。図6gは、図6fに示した結晶のSAEDパターンを示しています。 SAEDパターンは、個々の結晶から生じる小さなスポットで構成されたリングを示しました。したがって、脂質二重層の間に挿入されたERLは、配向性の低い小さな結晶として存在すると考えられます[39]。一方、他の比較として、DOXカプセル化ナノリポソームのTEM分析を実施し、その結果を図6hに示します。 ＴＥＭによって観察されたナノリポソームの形態および直径は、二重の薬物カプセル化ナノリポソームのものと類似していた。図6iに示すHR-TEM画像は、DOXカプセル化リポソームの内部に形成されたDOX硫酸塩の結晶格子を確認しました。図6jに示すSAEDパターンは、リポソーム内の結晶が高度に秩序化された結晶格子を持っていることを示唆しています。これらの結果は、電子ビームによるERLおよびDOXでカプセル化されたナノリポソームの回折が、主に脂質二重層のERL結晶ではなく、ナノリポソーム内のDOX-硫酸塩結晶によって引き起こされたことを確認します。要約すると、二重の薬物カプセル化ナノリポソームの形態と、リポソーム内に形成された各薬物の結晶は、TEM、HR-TEM、およびSAED分析によって特定されました[40]。

二重薬物または単一薬物カプセル化ナノリポソームの透過型電子顕微鏡（TEM）および選択領域電子回折（SAED）分析：ERLおよびDOXカプセル化ナノリポソーム（スケールバー、200 nm）（ a ）、ERLおよびDOX-硫酸塩複合体を含む単一のナノリポソーム（スケールバー、50 nm）（ b ）、ナノリポソーム内に存在するDOX硫酸塩結晶とナノリポソームの最も外側の領域にあるERL結晶を表す高分解能（HR-）TEM画像（販売バー、10 nm）（ c ）、ナノリポソーム（ d ）に存在するDOX-硫酸塩結晶とERL結晶のSAEDパターン ）、ERLでカプセル化された単一のナノリポソーム（スケールバー、50 nm）（ e ）、ナノリポソームの最も外側の領域にあるERLの小さな結晶とアモルファスドメインを表すHR-TEM画像（販売バー、10 nm）（ f ）、ナノリポソームの最も外側の領域に存在するERL結晶のSAEDパターン（ g ）、DOXでカプセル化された単一のナノリポソーム（スケールバー、100 nm）（ h ）、ナノリポソーム内のDOX-硫酸塩の結晶格子を表すHR-TEM画像（販売バー、5 nm）（ i ）、およびナノリポソーム内に存在するDOX-硫酸塩結晶のSAEDパターン（ j ）

デュアルドラッグカプセル化ナノリポソームの物理的安定性研究の結果、図7は、PBS（pH 7.4）でそれぞれ4、25、37°C​​でインキュベートしたナノリポソームの直径の変化率を関数として示しています。当時の。 4°Cでインキュベートした場合、0日目の初期直径と比較して、ナノリポソームの直径は5日目に14.8％増加し、その後、直径の変化の程度はわずかに変化しました。ただし、安定性試験期間中の直径の全体的な変化は±15.0％の範囲でした。 25°Cでは、ナノリポソームの直径は5日目に10.9％増加し、19日目に-8.0％減少しました。これは、テスト期間中の全体的な変化が±10.0％の範囲にあったことを示しています。さらに、37°C​​では、ナノリポソームの直径の全体的な変化は、テスト期間中に±6.0％の範囲であり、他のテスト条件と比較して最小の変化度を示しました。テストした3つの条件すべてで、ナノリポソームの直径に有意な変化がなかったという事実に基づいて、私たちの研究で調製したナノリポソームは、凝集することなく少なくとも3週間PBS（pH 7.4）で物理的安定性があると考えられます。または凝集。これは、ナノリポソームにカプセル化された薬物の治療効果、標的化、および毒性に影響を与える可能性があります。ナノリポソームの物理的安定性を決定する2つの重要な要因は T であることが認められています。 _c リン脂質とナノリポソームを構成するコレステロールの含有量[41]。 37°Cでのナノリポソームの高い安定性は、 T が高いDSPCで構成されるリン脂質二重層の相転移の可能性が低いためである可能性があります。 _c そして、一般に、様々なリポソーム製剤の主要な脂質成分として利用されています。また、ナノリポソーム中のコレステロールの40 wt％などの高い組成比は、ナノリポソームの物理的安定性の向上に寄与しているようです[42]。一方、それでも T は低い _c （− 2°C）1つのアシル鎖に二重結合を持つPOPGの場合、POPGの3 wt％などの非常に低い組成比は、ナノリポソームの安定性にほとんど影響しませんでした。

それぞれ4、25、37°C​​の異なる温度でPBS（pH 7.4）でインキュベートされたデュアルドラッグカプセル化ナノリポソームの安定性：インキュベーション時間の関数としての初期直径に対するナノリポソーム直径の変化率

時差薬物放出

物理化学的性質の異なる2種類の薬剤を1台の車両で運ぶことができるシステムはたくさんあります。代表的な例は、システムの同じコンパートメントに2つの薬物を含むミセルシステム、各薬物を含む異なるコンパートメントで構成されるポリマーマトリックスシステム、およびシステムのコアとシェルに各薬物を含むリポソームまたはポリマーソームシステムです。それぞれ[43,44,45,46]。特に、2つの薬物の連続的な作用が薬物の相乗効果を引き起こすために不可欠である場合、二重の薬物カプセル化担体からの各薬物の時間差放出は非常に重要です。二重薬物カプセル化ナノリポソームからのDOXおよびERLのinvitro時間差放出を調査し、結果を図8に示します。ナノリポソームからのDOXおよびERLの放出を、試験媒体であるPBS（pH 7.4）、継続的な攪拌下。指定された放出試験期間後のDOXまたはERLの放出量は、DOXの蛍光強度とERLの吸光度をそれぞれ蛍光分光計とUV-Vis分光計で測定して計算されました。

二重薬物カプセル化ナノリポソームからのERLおよびDOXのinvitro放出プロファイル：時間差放出（ a ）およびERLとDOXのリリース率（ b ）（ n =3、データは平均±SEMとして表されます）

図8に示すように、ERLリリースは36±0.01％でしたが、DOXリリースはリリーステスト期間の8時間まで10％未満でした。特に、この期間中、ERLの放出速度はDOXの放出速度よりもはるかに速かった。 48時間までに、DOXの30±0.01％の放出とは対照的に、65±0.07％のERLがナノリポソームから放出されました。 ERLとDOXの放出率を図8bに示します。 8時間まで、ERLの放出率は1時間あたり4％を超えていましたが、DOXの放出率は1時間あたり1％未満でした。 8時間後、ERLのリリース速度が遅くなりました。 ERLのリリースと比較して、DOXは遅いリリースを示し、ほぼゼロ次のリリース率でした。これらの結果は、放出試験の初期の間に、DOXのものよりはるかに多くの量のERLがリポソームから放出され、ERLとDOXの間に時間差放出があったことを示唆している。薬物の連続放出は、リポソーム中の各薬物の物理化学的状態の違いに起因すると考えられていた[28、32、47]。デュアルドラッグカプセル化ナノリポソームシステムに関するこれらの結果は、各薬剤のPK特性の違いと、同じ癌細胞を適切な時間で標的化することの難しさの両方を克服することにより、2種類の薬剤のinvitro相乗効果のクリニックへの変換に貢献できます。シーケンス。