相乗的抗腫瘍活性のための制御された細胞内ドラッグデリバリーナノシステムとしてのマイクロ波支援キトサン官能化酸化グラフェン

はじめに

HER2受容体は、癌細胞の成長と分化を仲介するEGFR受容体ファミリーのメンバーであり、ヒト乳癌の20〜30％で高度に過剰発現し、転移性腫瘍の表現型と予後不良を引き起こします[1]。 HER2は、ヒトの胃がんの約20％でも過剰発現しています[2]。ヒト化モノクローナル治療用抗体であるトラスツズマブは、HER2過剰発現乳がん患者の第一選択治療として有望な治療上の利点を示しています[3]。ただし、トラスツズマブに対する全体的な奏効率は依然として控えめであり、単剤療法として治療した場合は15〜30％、化学療法薬との併用治療で使用した場合は50〜75％です[4]。トラスツズマブに反応する患者の大多数は、最終的には最初の反応に続いて進行し、継続的な治療後に時間の経過とともに耐性を獲得します[5]。したがって、全生存率を改善するために、HER2過剰発現患者のための追加の新規治療法を開発することが不可欠であり、必要です。

アントラサイクリンは依然として癌治療のバックボーンとして機能します。アントラサイクリン剤の場合、トポイソメラーゼII阻害剤であるアドリアマイシンは、乳がん、肺がん、リンパ系がんなどの多くのがんの治療に広く使用されています[6]。アドリアマイシンは、HER2遺伝子とトポイソメラーゼII遺伝子が近接しているため、HER2過剰発現乳がん患者の治療に効果的です[7]。乳がんにおけるアントラサイクリンベースの治療で観察された臨床的利益にもかかわらず、心機能障害は、より広範な治療用途を制限してきました。臨床試験では、トラスツズマブとアドリアマイシンの併用が有意な有効性を示しましたが、用量依存性の高い心毒性は解決しなければならない問題でした[8]。癌標的の組織での化学療法剤の持続放出は、治療効果に必要な低用量への優れた解決策として認識されており、安全性プロファイルを改善します[9]。より良い抗腫瘍効果を達成するが、より少ない副作用を達成するために、癌細胞を標的とする際の抗癌剤送達効率を改善することが緊急に必要である。

酸化グラフェン（GO）ベースのナノ材料は、化学療法剤の制御された送達において大きな期待を示しています[10]。 GOの毒性はその表面機能化に関連していることが多くの研究で実証されています[11]。最近、キトサンやPEGなどの環境に優しい薬剤が、毒性の少ない表面官能基でGOを官能化することが報告されています[12、13]。生物学的媒体におけるナノ粒子コロイドの安定性は、臨床使用のための効果的で安全なドラッグデリバリーシステムの開発に不可欠です[14]。機能化されたGOナノシートは、生体適合性や安定性などの特性により、生物医学的用途で大きな注目を集めています。グラフェンベースの生体材料の優れた候補として、GOまたはrGOのコロイド安定性は、薬物担体の性能を制御するために重要です。ポリ（エチレングリコール）で官能化されたGOは、細胞培養培地で改善されたコロイド特性を示しました[15]。 P. Khanraは、酵母細胞を還元生体触媒として使用することにより、GOの還元と生体機能化を同時に行うための新しい方法を報告しました[16、17]。 Avinav Gは、オートクレーブ処理中に酵母エキスを利用することにより、GOのワンポット生合成を発表しました[18]。マイクロメートルサイズのGOシートを数時間超音波処理すると、GOナノシートが生成され、通常のマイクロメートルサイズのGOと比較して高いコロイド安定性が示されました[19]。以前の研究は生体材料に対するGOの高い可能性を示しましたが、無細胞酵母エキスを使用したマイクロ波支援還元によるキトサンを含む生体機能化GOナノシートはこれまで研究されていません。この目的のために、酵母エキスを還元剤として利用する簡単なマイクロ波合成システムによって、新しいキトサン官能化酸化グラフェン（ChrGO）構造が構築されました。さらに、生体適合性キトサンによるGOの効果的な機能化は、効率的な薬物のロードとデリバリーのための潜在的なプラットフォームを提供します。薬物の負荷と放出の研究は、アドリアマイシンが効率的にChrGOナノシートに負荷され、ChrGOナノシートから放出されることを示しました。 ChrGO /アドリアマイシン複合材料は、濃度依存的に有意な抗腫瘍活性を示しました。特に、ChrGO /アドリアマイシンとトラスツズマブの併用治療は、単剤療法と比較して、BT-474細胞の増殖阻害効果を増強しました。これらの薬剤の相乗的な抗腫瘍効果は、細胞周期の停止とアポトーシスによって媒介されることが明らかになり、最終的には癌細胞死に至りました。この研究は、効率的な癌治療のために時空間的に制御された方法で化学療法剤を送達する、ChrGO複合材料の迅速で費用効果の高い生産のための有望なルートを報告しました（スキーム1）。

HER2過剰発現BT-474細胞における二重標的療法のための制御されたドラッグデリバリーナノシステムとしてのマイクロ波支援生体機能化と酸化グラファイトの還元

材料と方法

資料

グラファイト粉末は、Qingdao Huatai Tech（Qingdao、China）から入手しました。キトサンとアドリアマイシンはAladdinCo。、Ltd。（Shanghai、China）から購入しました。トラスツズマブはHoffmann-LaRoche Ltd（バーゼル、スイス）から購入しました。 Roswell Park Memorial Institute-1640（RPMI-1640）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、およびウシ胎児血清（FBS）は、Invitrogen Corporation（Camarillo、USA）から購入しました。 Amicon ^® 超遠心フィルターはMerckMilliporeから購入しました。 CellTiter96 ^® 水性一液細胞増殖アッセイキットおよびCaspase-Glo ^® 3/7アッセイシステムキットは、Promega Corporation（Madison、USA）から入手しました。ドライパン酵母はAB / Mauri Co.、Ltdから入手しました。BT-474およびCos-7細胞株は、中国科学院のCell Bank（上海、中国）から入手しました。 Luria–Bertani培地は、Sangon Biotech Co.、Ltdから購入しました。すべての化学物質は分析グレードであり、さらに精製することなく市販されています。

マイクロ波を利用したキトサン機能化GOの削減

酸化グラファイト（GO）は、修正されたHummerの方法を使用してネイティブグラファイトフレークから調製されました[14]。ナノサイズのGOの単層を得るために、GOを800 Wで8時間動作する超音波プローブ（Scientz、中国）で剥離しました。最後に、剥離したGOを脱イオン水に分散させてさらに使用しました。部分的に還元されたキトサン-GO（ChrGO）ナノシートは、マイクロ波合成システムを使用したキトサン水溶液によるGOのマイクロ波支援還元によって合成されました。無細胞酵母エキスは、マイクロ波支援還元によるChrGOの生合成に使用されました。まず、ストックされた酵母細胞を、ルリア-ベルターニ培地に接種し、135 rpmで18時間、25°Cで振とうすることにより活性化しました。活性化した酵母細胞を2％ショ糖溶液に移し、135 rpmでさらに6時間、25°Cで振とうしました。次に、2000rpmで5分間の遠心分離により6mLの無細胞酵母エキスを取得しました。次に、50mgのキトサンを25mLの2％（v / v）酢酸溶液に溶解し、酵母エキスと混合しました[20]。強力なマグネチックスターラーで5mgのGO溶液を加えました。最後に、調製したままの溶液を、マイクロ波反応のためにNOVA-2Sマイクロ波合成装置（PreeKem Scientific Instruments、中国）に移しました。マイクロ波システムの加熱スキームでは、80°Cで5分間加熱し、さらに5分間温度を保持しました。得られたChrGOを100kDa MWCOフィルター（Millipore、USA）で精製し、凍結乾燥してさらに使用しました。

特性

ナノサイズのGOの透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、加速電圧200 kVのJEM-2100透過型電子顕微鏡（JEOL、日本）で取得されました。紫外可視（UV-Vis）スペクトルは、UV / Vis / NIR分光光度計Lambda950（Perkin-Elmer、USA）を使用して取得しました。フーリエ変換赤外（FTIR）スペクトルは、4000〜400 cm ^-1 をスキャンするVertex70FTIR分光計を使用して収集されました。 KBrペレットとして調製されたサンプル（Bruker、ドイツ）。ラマンスペクトルは、励起波長532nmのSenterraR200-Lラマン顕微鏡（Bruker Optics、ドイツ）を使用して記録しました。 X線回折（XRD）パターンは、Bruker D8 Advance回折計（Bruker、ドイツ）によって調べられました。表面元素は、X線光電子分光法（XPS）Kratos AXIS Ultra DLDと単色AlKa放射線（1486.6 eV）（島津製作所）を使用して記録されました。熱重量分析（TGA）は、PerkinElmer Pyris 1 TGAで、窒素雰囲気中、30〜800°Cで5°C /分の加熱速度で実施されました（PerkinElmer、米国）。複合材料の表面電荷は、Malvern Zeta Nano ZS-90装置（Malvern、英国）によって測定されました。

薬物のロードとリリース

4ミリグラムのChrGOナノ粒子を、20 mLのアドリアマイシン水溶液（0.4 mg / mL）に懸濁しました。 0.5時間超音波処理した後、光を避けて暗所で24時間攪拌しました。アンロードされたアドリアマイシンは、50 kDa MWCO Amiconフィルター（Millipore、USA）による遠心ろ過によって除去され、上澄みが無色になるまでリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 8.0）で洗い流されました。アドリアマイシンの濃度は、SpectraMax ^® を使用した490nmでのUV-Vis分光法による標準的なアドリアマイシン濃度曲線を使用して決定されました。 M5マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、米国）。 ChrGOにロードされているアドリアマイシンの量は、Amicon ^® の上清中のアドリアマイシンの損失濃度を測定することにより、UV-Vis吸光度で測定されました。 Ultra-15mL遠心フィルター。

ChrGOのアドリアマイシン放出特性を研究した。アドリアマイシンをロードしたChrGOを10mLのPBS緩衝液に浸しました。指定された間隔で、ChrGOから分離された2 mLの放出されたアドリアマイシン溶液を、50 kDa MWCO Amiconフィルター（Millipore、USA）による遠心ろ過によって収集しました。 ChrGO /アドリアマイシン溶液の量は、各サンプリング後に2mLの新鮮なPBS緩衝液を加えることによって一定に保たれました。 ChrGOから放出されるアドリアマイシンの量は、SpectraMax ^® による490nmでのUV-Vis吸光度によって測定されました。 M5マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、米国）。放出研究は、さまざまなpH溶液（pH値5および7.4）で調査されました。

生体適合性分析と治療効果アッセイ

BT-474およびCos-7細胞は、それぞれ10％FBSを添加したRPMI-1640または10％FBSを添加したDMEMで維持し、5％CO ₂ の加湿雰囲気で培養しました。 37°Cで。 GOおよびChrGOの生体適合性アッセイは、細胞毒性アッセイを介してBT-474またはCos-7細胞で実施されました。細胞を3×10 ⁴ の密度で96ウェル平板にプレーティングしました。 ウェルあたりの細胞数を18時間プレインキュベートした後、GOおよびChrGOで処理します。次に、テストした薬剤の希釈液をセルに追加し、さらに24時間インキュベートしました。細胞の生存率はCellTiter96 ^® によって決定されました 水性1溶液。 SpectraMax ^® により490nmで吸光度を測定しました。 M5マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、米国）。

BT-474細胞の増殖に対するChrGO /アドリアマイシン複合体単独またはトラスツズマブとの併用治療の有効性は、増殖阻害アッセイによって調査されました[16]。 BT-474細胞を1×10 ⁴ の密度で96ウェル平板にプレーティングしました。 ウェルあたりの細胞数を24時間インキュベートします。次に、ChrGO /アドリアマイシン複合体を単独で、またはトラスツズマブと組み合わせて処理して、培地中のBT-474細胞に導入しました。 96時間のインキュベーション後、生細胞をCellTiter96 ^® で測定しました。 水性1溶液。 SpectraMax ^® で吸光度を測定しました 490 nmのM5マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、米国）。データは一元配置分散分析で分析されました。 p <0.05は統計的に有意であると見なされました。

細胞周期分析とアポトーシスアッセイ

細胞周期分析のために、BT-474細胞を5×10 ⁵ の密度で6ウェルプレートにプレーティングしました。 ウェルあたりの細胞数を16時間付着させます。細胞をChrGO /アドリアマイシン複合体単独またはトラスツズマブと組み合わせて24時間処理しました。 BT-474細胞を回収し、70％（v / v）エタノールで4°Cで24時間固定しました。固定したBT-474細胞を、リボヌクレアーゼA（10μg/ mL）を含むヨウ化プロピジウム溶液（15μg/ mL）で25°Cで1時間染色しました。次に、細胞をフローサイトメーター（BD Biosciences、USA）で分析した。アポトーシスアッセイでは、BT-474細胞を2×10 ⁴ の密度で白い壁の96ウェルプレートに播種しました。 ウェルあたりの細胞数を18時間付着させます。細胞をChrGO /アドリアマイシン複合体、トラスツズマブ単独、または24時間の併用治療で処理しました。その後、培地を廃棄し、100 µLのCaspase-Glo ^® 3/7試薬を各ウェルに加え、RTで2時間インキュベートしました。発光はSpectraMax ^® によって測定されました M5マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、米国）。結果は一元配置分散分析によって分析されました。 p <0.05は統計的に有意であると見なされました。すべての研究は、関連するガイドラインと規制に従って実施されました。

結果と考察

合成と特性評価

合成されたままのGOシートの形態は、透過型電子顕微鏡（TEM）によって特徴づけられました。図1aは、100 nm未満のGOナノシートの均一なサイズ分布を示しており、平均サイズは約45nmです。 GOの高い電子密度は、キトサンと比較してより良いコントラストを示しました。キトサンは、その低い電子密度と水和した性質のためにほとんど見えません[21]。表面積が大きいため、ナノスケールのGOまたは還元型GOシートが薬物担体として広く使用されています[22]。図1cの選択領域電子回折（SAED）パターンは、同心リングを示しています。これは、酸化グラフェンに対応する多結晶性の存在を示しています[23]。

a GOナノシートの低倍率TEM画像、 b ナノシートと c の高分解能TEM画像 GOナノシートの典型的なSAEDパターン

生理的溶液中でGOナノシートを安定化するために、キトサンで官能化されたGOナノシートは、マイクロ波システムを使用したマイクロ波支援還元によって調製されました[24]。得られた還元型GO-キトサン（ChrGO）をUV-Vis分光法で分析しました。図2aは、GOとChrGOのUV-Visスペクトルを示しています。 GOは、230 nmに鋭い吸収ピークを示し、300 nmにショルダーを示しました。これは、πによるものです。 – π *芳香族C =C結合と n の遷移 – π *それぞれC =O結合の遷移[25、26]。キトサンがGOにグラフトされた後、ChrGOでは230nmのピークが270nmに赤方偏移し、300 nmのショルダーは明らかに消失しました。これは、芳香族炭素原子間の電子共役が部分的に回復したためです[27]。合成されたChrGOの黒い溶液を図2bに示します。これは、部分的に還元された酸化グラフェン（p-rGO）の形成を示しています。 GOナノシートとChrGOの両方が脱イオンH ₂ によく分散していました O.水溶液中のGOまたはGO誘導体のコロイド安定性は、それらの生物医学的応用にとって非常に重要です。結果は、キトサンが還元後にGOと結合したことを示唆しました。

a 水溶液中のGOナノシートとChrGOのUV-Visスペクトル、 b GOナノシートと合成されたChrGOの写真

FTIR分光法を実行して、GO、キトサン、およびChrGOの構造を特徴付けました（図3a）。 GOの特徴的なピークは、3440 cm ^-1 にありました。 および1376cm ^-1 、それぞれO–HおよびC–OH結合に対応します。 1072 cm ^-1 のピーク C–N–Cの伸縮振動に割り当てられました。注目すべきことに、2912 cm ^-1 でのキトサン分子のピーク および2848cm ^-1 CH ₃ の伸縮振動に起因していました –および–CH ₂ – [28、29]。キトサンで官能化されたp-rGOは新しい結合をもたらし、ChrGOスペクトルに新しいピークをもたらしました。 1636 cm ^-1 ではC =Oバンドの強度が大幅に低下しています。 GOのそれと比較したChrGOのそれは、還元プロセスがGOの酸素含有基を除去したことを示唆している[30]。 ChrGOのFTIRスペクトルにより、GOでのキトサンの結合が成功したことが確認されました。さらに、ラマン分光法を使用して、グラフェンの電子特性と構造を特徴付けました。 Gバンドは E によるものです _2g sp のフォノン ² 炭素ドメイン、Dバンドは sp の振動に割り当てられています ³ 炭素原子ドメインと無秩序な炭素原子。 Dバンドの強度は、カーボンシートの障害と欠陥の特徴を示しています[31]。 GOナノシートの減少は、D対Gバンドの信号比でも分析されました[32]。 GOの代表的なラマンスペクトルは、Dバンドの2つの特徴的なピーク（1341 cm ^-1 ）を示しています。 ）とGバンド（1591 cm ^-1 ）図3b。 I _D の相対強度の変化 / I _G 値は、還元プロセスにおけるGOの電子共役状態の変化を示しています[33]。 Dバンドのシフトは、減少したGOの正常な機能化を示します。 I の値 _D / 私 _G sp3 の導入により、0.99（GO）から1.12（ChrGO）に増加します。 グラフェンの特徴的な構造の機能化と不完全な回復後の欠陥[34]。この観察結果は以前の報告とよく一致しており、キトサンで官能化されたグラフェンの形成を示唆しています[16]。

a GO、ChrGO、キトサンのFTIRスペクトル、 b GOおよびChrGOのラマンスペクトル

ChrGOの表面組成はXPSによって確認されました。 ChrGOのXPSスペクトルのフルスキャンでは、284、399、533 eVに3つのピークがあり、それぞれC1、N1、O1に割り当てられています（図4a）。相対元素分析では、ChrGOの酸素および窒素レベルの増加と、それに伴うGOと比較した炭素含有量の減少が示されました。図4bに示すChrGOの高解像度C1sスペクトルは、C–CまたはC =C（ sp ）に対応する4つの分離したピークを示します。 ² 、284.7 eV）、C-O（エポキシ/ヒドロキシル、286.4 eV）、C =O（ sp ³ 、288.2 eV）およびO =C–O（カルボン酸塩、289.1 eV）結合。 ChrGOでのアミドピークの出現は、GOでのキトサンの機能化の証拠を提供します[35]。表面に豊富な親水性官能基があるため、ChrGOは水溶液に非常に溶けやすく、FTIRの結果と一致しています。酵母エキスに含まれる還元性アミノ酸やα-リノレン酸などの生体分子は、マイクロ波を利用したChrGOの製造に重要な役割を果たしている可能性があります[20]。

a GOおよびChrGOのXPSスペクトルを調査します。 b C1の高解像度スペクトル

GOおよびChrGOのX線回折（XRD）パターンを図5aに示します。 GO XRDスペクトルでは、11.0°の主要なピークと20.7°の弱いピークが明らかにグラファイト構造を示しています。 GOの（001）面に対応する11.0°の特徴回折ピーク。これは、GOの合成が成功したことを示しています[36]。 20°と24°の間の小さな隆起は、酸化されていない元のグラファイトに起因するグラファイト部分を示しています[37]。キトサンの官能化により、GOの（001）ピークが消え、21.4°の広い回折ピークが顕著になります。このシフトは、GOの削減に起因する可能性があります。この削減により、rGOパックはGOよりもタイトになります。 ChrGOサンプルの（002）反射は非常に広く、サンプルがスタッキング方向に沿って非常に不十分に順序付けられていることを示唆しています。これは、GOの不完全な還元に起因する可能性があります[33]。 GO、キトサン、ChrGOの分解挙動は、熱重量分析（TGA）によって研究されています[38]。 ChrGO、GO、キトサンのTGA曲線を図5bに示します。これらは、窒素雰囲気で測定されたものです。 GOは、100°C未満で重量が減少し始めました。これは、積み重ねられた構造で吸着された自由水が除去されたためです[39]。 GOは、191〜231°Cの範囲で重量の42％を失いました。これは、不安定な酸素含有基の分解に関連していました。 100〜250°CでのChrGOの重量減少率は、GOよりも大幅に低く、ChrGOがGOと比較して異なる分解パターンを示したことは明らかです。 ChrGOと純粋なキトサンの熱除去は250〜440°Cで行われました。これは、キトサンのグリコシド単位やカルボキシル基など、より安定した官能基の解重合と熱分解に関連しています[40]。 GOと比較すると、ChrGOは熱的に安定しており、250〜440°Cでの最初の分解段階で36％の大幅な重量減少が見られましたが、GOではほとんど重量減少が見られませんでした。 450〜800°Cの高温領域での大幅な体重減少は、炭素骨格の熱分解によるものでした。これは、キトサン残基とアミノ酸などの酵母エキスからの生体分子に起因する可能性があります[41]。

a GOおよびChrGOのXRDパターン、 b GO、キトサン、ChrGOのTGA曲線

GOおよびChrGOの表面電荷は、コロイド安定性の重要なパラメーターであるMalvern Zeta NanoZS-90装置によって測定されました。 GOナノシートの表面電荷密度が高いほど、より安定したコロイド分散が得られます[42]。追加ファイル1：図S1に示すように、GOのゼータ電位はpH3の-10.7mVからpH11の-35.5mVに単調に減少し、GOナノシートの表面に負の電荷があることが確認されました。 ChrGOのゼータ電位値は、3〜11の範囲のpHでGOの電位よりも比較的小さかった。ChrGOナノシートは、pH値の全範囲で安定性を示したが、還元されたGOコロイドは、脱イオン水中での安定性が低いと報告された。増加したπ – π 脱酸素化された表面での積み重ね[43]。キトサンの表面にはいくつかの遊離アミン基が存在していましたが[44]、ChrGOのより高いゼータ電位は達成されませんでした。 ChrGOのゼータ電位値が低いのは、酵母エキスからの豊富な負のアミノ酸分子が原因である可能性があり、これにより生理溶液中でのコロイド安定性が向上しました[20]。 ChrGOの負に帯電した表面により、薬物の装填と送達に適用できる可能性があります。

合成されたままのChrGOの生体適合性

合成されたままのChrGOの生体適合性は、ドラッグデリバリーでのアプリケーションにとって重要です。 ChrGOおよびGOの細胞毒性を細胞毒性アッセイにより調べた。 Cos-7細胞とBT-474細胞を、ChrGOまたはGOのいずれかの存在下で24時間インキュベートしました。細胞毒性の結果を図6に示します。ChrGOはCos-7およびBT-474細胞に対して明らかな細胞毒性を示さなかったと結論付けることができます。 100μg/ mLの濃度でも、細胞生存率は90％を超えていました。ただし、GOは用量依存的に有意な細胞毒性を示し、100μg/ mLの濃度でCos-7およびBT-474細胞の細胞生存率はそれぞれ73.0±0.5％および71.0±0.5％にすぎませんでした。結果は、GOの表面で官能化されたキトサンが非常に低い細胞毒性を示し、生体適合性を改善したことを示した。高分子によるGOの表面機能化は、その細胞毒性効果を著しく弱めることが報告されています[45]。 Hu etal。細胞培地中のウシ胎児血清は、非小細胞肺癌A549細胞におけるGOの細胞毒性を著しく低下させたと報告しました[46]。

GOとChrGOの生体適合性。さまざまな濃度のナノ粒子を a で培養しました Cos-7セルと b BT-474細胞、および細胞生存率に対するそれらの影響が決定されました

薬物の装填と放出

薬物担体としてのChrGOの潜在的な生物医学的応用は、薬物の負荷と放出の挙動によって測定されます。グラフェン誘導体の構造特性は、比表面積が非常に大きいため、芳香族ドラッグデリバリーに非常に効果的です。アドリアマイシンは、さまざまな血液悪性腫瘍および固形腫瘍に対する原発腫瘍化学療法剤の1つであり、グラフェン誘導体ドラッグデリバリーシステムを評価するためのモデル薬として頻繁に使用されます[47]。 ChrGOナノシートへのアドリアマイシンの負荷容量は、490nmでのアドリアマイシンの特徴的なUV-Vis吸光度ピークによって検証されました。予想通り、ChrGOナノシートに結合したアドリアマイシンの最大負荷効率は169.8％と高く、これはChrGOナノシートの表面積が大きいことに部分的に起因していました。アドリアマイシンをロードしたChrGO /アドリアマイシンナノコンポジットは、生理学的バッファーに容易に分散され、わずかに赤みがかった色の透明な溶液を示しました。

ChrGO /アドリアマイシン複合体からのアドリアマイシンの放出プロファイルを調査するために、PBSのさまざまなpH値を導入して、腫瘍細胞環境を模倣しました。追加ファイル1：図S2は、pH5および7.4でのChrGO /アドリアマイシンからのアドリアマイシンの累積放出プロファイルを示しています。 ChrGO /アドリアマイシンから放出されたアドリアマイシンは、最初の速い放出と、その後のpH5.0のPBS溶液中での遅い放出の段階によって特徴づけられました。アドリアマイシンの累積放出は、最初の3時間で6.5％でしたが、その後、pH 5.0で96時間で26.7％までゆっくりと増加しました。対照的に、ChrGO /アドリアマイシンのアドリアマイシンの割合はゆっくりと増加し、pH 7.4で低くなり、アドリアマイシンの放出割合は、前の3時間の2.5％から96時間の7.4％になりました。以前の研究では、機能化されたGOからの薬物の放出プロファイルがpH7.4の培地で非常にゆっくりと示されています[48]。 ChrGOのカルボキシル基のプロトン化により、アドリアマイシンとChrGOの間のπ–πスタッキング、水素結合、および静電相互作用が減少し、酢酸媒体中でのアドリアマイシンの放出が促進されます[49]。 pH感度により、ChrGO /アドリアマイシンは部位特異的な薬物送達の可能性があり、これにより腫瘍細胞の細胞毒性が増加します。

ChrGO /アドリアマイシン複合体の治療効果

HER2過剰発現BT-474癌細胞内のChrGO /アドリアマイシン複合体の治療効果を増殖阻害アッセイによって調べた。 HER2受容体の過剰発現は、BT-474乳がん細胞の形質転換において重要な役割を果たします。抗HER2モノクローナル抗体であるトラスツズマブ単独での治療は、BT-474細胞の有意な増殖阻害をもたらします[50]。図7aに示すように、ChrGO /アドリアマイシン複合体で処理した後、BT-474細胞の細胞生存率は大幅​​に低下し、用量依存的な毒性効果を示しています。さらに、遊離アドリアマイシンと比較した場合、ChrGO /アドリアマイシン複合体はBT-474細胞を殺す効果が低いことを示しました。これは、遊離アドリアマイシンによる直接処理ではなく、ロードされたアドリアマイシンの段階的な拡散によるものです[51]。ただし、ChrGO /アドリアマイシン複合体の濃度が増加するにつれて、ChrGO /アドリアマイシン複合体の治療効果は遊離アドリアマイシンの治療効果に近くなりました。これは、ChrGOキャリアからの持続的なアドリアマイシン放出によって説明できます。

a ChrGO /アドリアマイシン複合体にロードされた遊離アドリアマイシンおよびアドリアマイシンの濃度でインキュベートされたBT-474細胞のinvitro細胞生存率 b BT-474細胞におけるトラスツズマブ（5μg/ mL）と組み合わせたChrGO /アドリアマイシン複合体（5μg/ mL）の細胞毒性。アドリア：アドリアマイシン。 ** p <0.01、*** p <0.001

抗HER2モノクローナル抗体であるトラスツズマブがChrGOにロードされた同量のアドリアマイシンの抗腫瘍活性を改善できるかどうかを調べるために、BT-474細胞をトラスツズマブ単独またはChrGO /アドリアマイシンと組み合わせて処理しました。トラスツズマブ単独での治療はBT-474増殖の有意な阻害をもたらし、これは以前の報告と一致しています[52]。トラスツズマブとChrGO /アドリアマイシンの併用療法は、トラスツズマブ単独（5μg/ mL）での54.5％の減少、および同等のChrGO /アドリアマイシンでの59.5％の減少と比較して、88.5％の減少によって示されるように、細胞増殖阻害効果の増強をもたらしました。単独（5μg/ mL）対ネガティブコントロール（図7b）。この結果は、ChrGOシステムを効果的に使用して併用療法用の複合材料を開発できることを示唆しており、ChrGO /アドリアマイシンとトラスツズマブの併用治療は、各薬剤単独と比較して、細胞生存率を適度に、しかし有意に低下させました。

細胞周期分析とアポトーシス

ChrGO /アドリアマイシン複合体が細胞周期の進行に影響を与えるかどうかを判断するために、ChrGO /アドリアマイシン複合体の単独またはトラスツズマブとの併用治療の細胞周期アッセイをBT474細胞で実施しました。図8aに示すように、フローサイトメトリー分析により、トラスツズマブのみがG0 / G1期の細胞集団を増加させることが明らかになりました。 ChrGO /アドリアマイシン単独での治療は、対照細胞と比較して、G0 / G1細胞の数の有意な減少とS期およびG2 / M期の蓄積を媒介しました。さらに、ChrGO /アドリアマイシンとトラスツズマブを介したS期の停止が組み合わさり、G0 / G1期の細胞数が大幅に減少しました。 ChrGO /アドリアマイシンは細胞周期のS期で最も活性がありますが、トラスツズマブによるChrGO /アドリアマイシン治療は、ChrGO /アドリアマイシン単独と比較してG0 / G1期の増加を引き起こす可能性があります。以前の報告では、トラスツズマブがG1期に細胞停止を引き起こす可能性があることが示されていました[53]。アドリアマイシンは細胞増殖とDNA複製を阻害し、最終的に細胞周期の停止を引き起こします[54]。

a BT-474細胞におけるChrGO /アドリアマイシン単独またはトラスツズマブとの併用による治療後の細胞周期分析 b BT-474細胞のアポトーシスの誘導に対するChrGO /アドリアマイシン（5μg/ mL）とトラスツズマブ（5μg/ mL）の効果。アドリア：アドリアマイシン。 ** p <0.01、*** p <0.001

アポトーシス分子に対するChrGO /アドリアマイシンの効果を評価するために、BT-474細胞をChrGO /アドリアマイシン、トラスツズマブ、または両方の薬剤の併用治療のいずれかで48時間処理しました。アポトーシスの可視化のために、カスパーゼ3/7活性は、アポトーシスのプロセスに関連するその活性のために、アポトーシス特異的マーカーとして広く使用されてきました[55]。図8bからわかるように、ネガティブコントロールと比較して、ChrGO /アドリアマイシン（5μg/ mL）単独での処理は、カスパーゼ3/7活性を有意に増加させました。ただし、トラスツズマブ（5μg/ mL）単独ではカスパーゼ3/7の発現が有意に増加しなかったことから、トラスツズマブはアポトーシスを誘導しないことが示唆されます。対照的に、ChrGO /アドリアマイシン（5μg/ mL）とトラスツズマブ（5μg/ mL）による治療は、各薬剤単独の場合と比較して、カスパーゼ3/7活性を有意に増加させました。二重標的療法はより高いアポトーシスを示し、異なる作用機序の存在による優れた治療効果を示しています。他の研究と同様に、アドリアマイシンはHER2過剰発現癌細胞のアポトーシス応答を増幅します[56]。結論として、トラスツズマブと組み合わせたChrGO /アドリアマイシンは、細胞周期の停止とアポトーシスを誘発し、最終的には細胞死の増加をもたらします。

結論

本研究では、キトサンで官能化された酸化グラフェンナノシートは、生体適合性と良好な分散安定性を実証するマイクロ波支援還元で構造化されました。調製されたままのナノコンポジットは、薬物のカプセル化および送達の高い効率を示した。 ChrGO /アドリアマイシンナノシートは、用量依存的にBT-474の有意な増殖阻害を示しました。 ChrGO /アドリアマイシンとトラスツズマブの併用治療は、各薬剤単独の治療効果と比較して、BT-474細胞で優れた治療効果をもたらしました。この結果は、制御された方法で薬物を送達する細胞内ナノキャリアの開発に有利であり、これにより、HER2過剰発現癌治療に対する治療効果が改善されることが期待されます。

データと資料の可用性

この現在の研究の結論を裏付けるデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

略語

ChrGO：

キトサン官能化酸化グラフェン

EGFR：

上皮成長因子受容体

HER2：

ヒト上皮成長因子受容体-2

GO：

酸化グラフェン

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

FBS：

ウシ胎児血清

TEM：

透過型電子顕微鏡

UV–Vis：

紫外可視

FTIR：

フーリエ変換赤外

XRD：

X線回折

XPS：

X線光電子分光法

TGA：

熱重量分析

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

SAED：

選択領域電子回折

TGA：

重量分析