低コスト緑色蛍光カーボンドット：バイオイメージングと標的薬物送達の強化

概要

バイオイメージングと細胞内薬物送達強化のため、ドキソルビシン封入カーボンドット（DOX-CDs）を作製しました。CDsはクエン酸と尿素を用い、200℃で1時間の水熱法で合成しました。その後、物理化学的相互作用によりDOXをCDs表面に結合させました。DOX-CDsは良好な結晶構造、優れた水溶液安定性、優れた光ルミネセンス特性、93%の高量子収率を示しました。蛍光画像では、DOX-CDsががん細胞に容易に取り込まれ細胞標識が可能であることが明らかになりました。さらに、エンド・リソソームpHによるDOX放出挙動がDOX-CDsで観察され、MTSアッセイでHO-8910卵巣がん細胞に対するDOX-CDsの細胞毒性が確認されました。また、CDsは動物イメージングテストで明るい蛍光信号を示し、7日および21日投与後も低毒性を示しました。したがって、作製されたCDsは生体医用イメージングと細胞内薬物送達のための有望なイメージングプローブとなり得ます。

はじめに

ドキソルビシン（DOX）は、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、甲状腺がん、多発性骨髄腫、肉腫、小児がんなど、いくつかのがん治療に広く使用されるアントラサイクリン系化学療法薬です。DOXの抗がん作用機序はDNA合成と修復プロセスへの干渉と考えられています。したがって、がん治療中にDOXは細胞膜を通過し、細胞核に到達してDNA合成を攪乱する必要があります。しかし、フリーDOXは細胞核に容易に接近できず、重度のin vivo心毒性を誘発し、がん治療としての応用を妨げています[1, 2]。

最近、リポソーム、ミセル、ナノエマルション、高分子ナノ粒子、その他のナノ粒子などの多機能ナノキャリアが、抗がん薬物送達における意義から多大な注目を集めています[3]。その中で、量子ドットファミリーの新しいタイプとして、カーボン量子ドット（CD）は2004年の発見以来、世界中で莫大な関心を集めています[4]。特に、蛍光CDsは準ゼロの重量とサイズ（<10nm）、高い光安定性、広く連続的な励起スペクトル、調整可能な波長、満足のいく生体適合性、低毒性、蛍光での優れた性能により、細胞イメージング²、光触媒、薬物送達、汚染物質および重金属イオン検出、光電気機器で優先的に使用されています[5-14]。例えば、YangらはDOXをCDsに結合させて抗がん治療を強化することに成功し、CDsが核標的薬物送達に大きな意義を持つことを示唆しました[1]。

以前、バイオマス材料、炭化、パッシベーション、表面官能基化など、CDs調製のためのさまざまな技術が提案されてきました[14, 15]。詳細には、2つの主要な方法に分類されます。1つは「トップダウン」アプローチで、アーク放電、レーザーアブレーション、電気化学的エッチング、酸化法など、大規模な炭素構造をカーボンナノ粒子に分解する方法です[16-20]。もう1つは「ボトムアップ」法で、分子前駆体からカーボンドットを合成する方法で、主に水熱法、超音波法、波支援合成が含まれます[21-24]。Xuらはアーク放電、酸化、抽出、ゲル電気泳動でカーボンドットを得ました。Mingらは電解でカーボンドットを取得しました。Yangらは元の水熱法を最適化して異なる蛍光を持つカーボンドットを合成しました[21]。しかし、これらの方法は複雑な合成プロセス、時間のかかる手順、厳格な製造要件、高価な原料によって制限されています[25]。さらに、反応のパッシベーターとして有機溶媒を使用するとCDsの毒性が増加する可能性があります[26]。また、報告されているほとんどのCDsはUV光励起下で青色蛍光を発し、強い組織自己蛍光の干渉により生体医用イメージング分野での可能性を深刻に阻害しています。

ここでは、緑色蛍光CDsを、クエン酸二水和物と尿素の緑色で効率的な一段階制御熱分解により合成しました。DOXは疎水性相互作用、静電相互作用、およびπ-πスタッキング相互作用により[27-29]、調製されたCDs表面に非共有結合で薬物送達のために結合させました。CDsの形態と構造を透過型電子顕微鏡（TEM）とX線回折分析で調査しました。光学特性をUV-vis分光光度計と光ルミネセンス（PL）発光スペクトルで評価しました。持続的薬物放出を透析法で実施しました。細胞取り込みとDOX-CDsの細胞内分布を蛍光顕微鏡で調査しました。DOX-CDsの抗がん効果を標準MTSアッセイで評価しました。CDsのin vivoイメージングをBALB/cヌードマウスで実施しました。最後に、組織学的分析でCDsの長期毒性を調査しました。したがって、調製されたCDsはin vivoイメージングと標的薬物送達の潜在的薬剤となり得ます。

材料と方法

材料

クエン酸二水和物、尿素、L-アルギニン、エチレンジアミンアセトン、キニーネ硫酸塩、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、酢酸、二塩基性リン酸ナトリウム、パラホルムアルデヒドはシノファームケミカルリエージェント有限公司（中国上海）から入手しました。MTS細胞増殖比色アッセイキット（MTS）、デュルベッコ改変イーグル培地（DMEM/高グルコース）、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、トリプシン-EDTA溶液はベイタイムバイオテクノロジー有限公司（中国上海）から購入しました。胎児牛血清（FBS）は天杭バイオテクノロジー有限公司（中国杭州）から入手しました。HO-8910卵巣がん細胞とEA.hy926ヒト臍帯静脈内皮細胞は中国科学院上海栄養健康研究所（中国上海）から入手しました。塩酸ドキソルビシン（DOX）はシグマアルドリッチ（中国上海）から購入しました。透析バッグ（MWCO=1000Da）はスペクトラムラボ（米国ロサンゼルス）から購入しました。

CDsとDOX-CDsの合成

簡単に説明すると、クエン酸二水和物（0.2mmol）と尿素（5mmol）をまず1mLのDI水に溶解しました。次に、混合物をガラス容器に移し、200℃で1時間炭化しました。その後、1mLのDI水とアセトン（v/v、1/3）を加え、10000rpmで10分間遠心分離を3回繰り返しました。

DOXは非共有結合相互作用によりCDs表面に結合させました。簡単に説明すると、DOX·HCl（0.5mg）をCDs（5mg/mL）5mLに加え、暗所で48時間撹拌しました。結果の溶液を透析バッグ（MWCO=1000Da）でDI水に対して24時間透析し、DOX-CDsを得ました。最後に、DOX-CDsを凍結乾燥し、4℃で保存しました。

CDsとDOX-CDsの特性評価

CDsのサイズ形態を透過型電子顕微鏡（TEM、FEI Tecnai G2 Spirit）で特性評価しました。PL発光測定をLS55蛍光分光光度計（PerkinElmer、米国ウォルサム）で実施しました。CDsの量子収率（QY）をキニーネ硫酸塩溶液（H₂SO₄中）を標準として測定しました。結晶構造をブルッカーテンソル27フーリエ変換赤外分光光度計（Pike Corporation、米国ウィスコンシン州マディソン）で観察しました。X線光電子分光法（XPS）をESCALAB250Xi分光計（Thermo、米国）で実施しました。ゼータ電位をゼータ電位計（Malvern Panalytical、英国マルバーン）で測定しました。

In Vitro薬物放出試験

DOX-CDsからのin vitro DOX放出を透析バッグを用いて調査しました。簡単に説明すると、DOX-CDsを透析バッグに充填し、それぞれPBS（pH 7.4と5.0）に浸漬し、振とうインキュベーター（37℃、100rpm）に入れました。所定の時間に0.5mLサンプルを採取し、同量のPBSで置換しました。放出されたDOXを590nmでの蛍光強度で記録しました。

In Vitro細胞毒性試験

DOX-CDsの細胞毒性をMTSアッセイでHO-8910卵巣がん細胞とEA.hy926臍帯静脈内皮細胞に対して測定しました[30, 31]。簡単に説明すると、細胞を96ウェルプレートに0.5×10⁵cells/mLの濃度で播種し、24時間維持して細胞付着を許容しました。次に、さまざまな濃度のDOX-CDsを各ウェルに添加しました。24時間インキュベート後、培地を除去し、90μLの培地と10μLのMTSを各ウェルに添加しました。4時間後、マイクロプレートリーダー（BioTek Epoch、サービスカード）で490nmの吸光度を測定しました。細胞生存率を生存細胞の割合として表し、3回測定の平均として報告しました。

In Vitro細胞イメージング研究

HO-8910卵巣がん細胞を6ウェルプレートに播種し、37℃で24時間インキュベートして細胞付着させました。次に、細胞をDOX-CDsでインキュベートして細胞取り込みを許容しました。4時間インキュベート後、培地を除去し、冷PBSで3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定しました。最後に、細胞の形態と蛍光分布を蛍光顕微鏡（Leica Microsystems、ドイツ・ヘッセン州ヴェツラール）で可視化しました。

In Vivoイメージング

動物実験は徐州医科大学動物管理委員会の承認を得ました[32]。BALB/cヌードマウスを用いてCDsの蛍光イメージングでの可能性を評価しました。簡単に説明すると、BALB/cヌードマウスに腹腔内注射で2%ペントバルビタールで麻酔後、投与部位にCDs水溶液（50μL、6mg/mL）を皮下注射しました。さらに、マウス体内でのCDsの生体分布も、CDs（5mg/kg）を尾静脈注射して調査しました。異なる臓器（心臓、腎臓、脾臓、肝臓、膀胱）をさまざまな時点に採取し、蛍光評価を行いました。動物蛍光イメージングをTanon-5200Multi Gelイメージングシステムで撮影し、すべての蛍光画像の露出時間を1.0秒に設定しました。

In Vivo毒性試験

クンミンマウス（雌、7週齢）を用いてCDsのin vivo長期毒性を調査しました。クンミンマウスをランダムに2群に分けました：CDs群と対照群。マウスにPBSとCDsを尾静脈注射（6mg/kg）しました。その後、注射後7日と21日に心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓などの主要臓器を採取しました。その後、臓器を4%パラホルムアルデヒドで固定し、スライスし、ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色しました。最後に、組織学的切片を光学顕微鏡（Leica Microsystems、ドイツ・ヘッセン州ヴェツラール）で観察しました。

結果と考察

CDsとDOX-CDsの特性評価

CDsはナトリウムクエン酸二水和物と尿素（ナトリウムクエン酸二水和物/尿素=1/25）を用いた一段階戦略で200℃、1時間で作製されました。DOXは調製されたCDs表面に薬物送達のために共有結合で結合させました（スキーム1）。TEM画像（図1a）に示すように、CDsは平均直径2.75nmの均一な球状形態を示し、比較的狭いサイズ分布を持ちました。さらに、高分解能TEM画像（図1aインセット）でCDsの結晶構造を観察でき、顕著な格子縞を持つ良好な結晶性を示しました。

CDsの化学構造をFTIR分光法で特性評価しました。図1dに示すように、3499cm⁻¹と1729cm⁻¹の鋭いピークはそれぞれ-OHと-COOHに割り当てられ、780cm⁻¹と1372cm⁻¹のピークはN-Hに帰属できます。カーボンドット表面にカルボキシル基とアミノ基の両方が官能基として存在し、特定の機能を持つ生物学的高分子を修飾できることが結論付けられ、カーボンドットの更なる応用研究の可能性を提供します。

さらに、CDsの光学特性をUV-vis吸収とPL分光法で調査しました。図1cに示すように、CDsは410nmに吸収ピークを示し、DOXは500nmに吸収ピークを示しました。一方、DOX-CDsはCDsとDOXの吸収ピークをそれぞれ410nmと500nmで維持し、DOXがCDsに成功裏に結合したことを示しています。さらに、図1cのインセット図に示すように、DOX-CDs水溶液は自然光下で薄黄色透明でしたが、UV励起下で明るい緑色に変わりました。さらに、キニーネ硫酸塩を標準（QY=54%）として蛍光量子収率を93%と計算しました。CDsを340-440nmの波長で励起すると、PLピークはほとんどシフトせず、CDsの励起波長非依存性発光特性を示しました。CDsの最大励起波長とPLピークはそれぞれ400nmと525nmでした。励起非依存性PL挙動はCDsの均一な表面状態に起因する可能性があります[33]。

さらに、CDsの元素組成をXPSで決定しました。図1fに示すように、XPSスペクトルはCDsが主に炭素（C）、窒素（N）、酸素（O）で構成され、対応する原子比がそれぞれ78.39%、7.52%、14.1%であることを明らかにしました。C₁s、N₁s、O₁sの3つの典型的なピークがそれぞれ284.8、399.5、532.6eVで観察されました。具体的には、C₁sスペクトルは284.8、286.7、288.3eVの3つのピークを示し、それぞれC-C、C-N、C-OまたはC=O結合の存在を表します（図S1A）。N₁sの高分解能スペクトルは399.5eVのピークを示し、C-Nに割り当てられました。さらに、O₁sスペクトルも531.9と532.6eVでそれぞれC=OとC-O結合の存在を確認しました（図S1B）。

CDsの蛍光強度は4℃と室温の両方で素晴らしい安定性を維持しました（図S2A）。4℃での2週間での蛍光強度減少は10%未満で無視できます。したがって、カーボンドットは生体医用イメージング剤として使用するための長期安定性を持つことが期待されます。

図S2Bは、CDsのPL強度が高（>10）または低（<3）pHの水溶液で減少することを示しました。しかし、pH 3-10の水溶液ではPL強度が安定でした。バイオマーキングとバイオイメージングに適用される調製CDsは細胞と共培養され、pH条件は中性付近（pH=6-8）であり、PL安定性を保証します。理論的に、調製CDsが細胞内でバイオマーキングとバイオイメージングのために高い安定性で蛍光を発することが示されました。

CDsの蛍光安定性を明確にするため、蛍光抗光漂白試験を実施しました。図S2Cに示すように、量子ドット（CdTe）と従来の蛍光染料（DAPI）と比較して、カーボンドットはより高い蛍光強度だけでなく、優れた光漂白耐性も示しました。さらに、CDsはDI水、PBS、FBS培地、DMEM培地、CM1-1培地などさまざまな溶液に良好に分散し、血液系での優れた安定性が期待されます（図S3）。

CDsは-31.1mVのゼータ電位値を示しました（図S4）、これはこれらの粒子表面に酸素とカルボキシル官能基が存在することに起因します。正に帯電したDOXは、カルボキシル基との静電相互作用と疎水性相互作用によりCDs表面に物理的に付着できます。DOX-CDsは-9.7mVのゼータ電位値を示し、DOX-CD複合体の形成を確認しました。さらに、CDsはsp²炭素ネットワークを含み、強いπ-π相互作用でDOXの芳香族構造を担持できます。最適封入効率と薬物担持効率をさまざまなDOX濃度で調査しました。図S5に示すように、最大封入効率はDOX 0.1mg/mLで50.82%と計算され、対応する担持効率は6.82%でした。

DOX-CDsのIn Vitro薬物放出

DOX-CDsからのin vitro DOX放出挙動をPBSで実施し、pH感受性DOX放出を調査しました。これを実証するため、DOX-CDsを異なるpH値（pH 7.4、6.0、5.0）でインキュベートし、DOX放出をモニターしました。図2に示すように、DOX-CDsは休止期間中にpH 7.4、6.0、5.0で持続的放出プロファイルを示しました。結果はDOX放出がpH依存的であることを示しました。DOX-CDsをpH 7.4でインキュベートした場合、8時間以内にDOXのわずか13%が放出されました。しかし、pH値を6.0または5.0に下げると、それぞれDOX-CDsから35%以上または65%以上のDOXが放出され、DOX-CDsの低pH感受性を示唆しました。酸性環境下でのDOX上の-NH₂基のプロトン化増加に起因して、より低いpHで放出DOX量が増加することが実証されました。したがって、DOX-CDsは血液循環中のDOX早期漏出を防止し、細胞内薬物放出を強化する可能性があります。これはがんの効果的治療に大きな利益をもたらします。

In Vitro細胞毒性試験

生体適合性問題は、生体医用イメージングと薬物送達への応用におけるCDsにとって重要です。さまざまな濃度でのCDsの細胞毒性をHO-8910卵巣がん細胞とEA.hy926臍帯静脈内皮細胞で実施しました。図3aに示すように、HO-8910とEA.hy926細胞の両方が5mg/mLの高濃度でも85%以上の高い生存率を維持し、CDsの優れた生体適合性と低細胞毒性を示しました。

DOXと結合すると、DOX-CDsはHO-8910卵巣がん細胞に対してDOX濃度依存的な細胞生存率を示しました。図3bに示すように、DOX濃度が0.05mg/mL以上で特に、DOX-CDsの細胞生存率はフリーCDsより有意に低く、DOX-CDsの優れた抗がん効果を示しています。

In Vitro細胞取り込みと標識研究

DOX-CDsの細胞内取り込み能力を評価するため、HO-8910細胞で細胞イメージングを調査しました。図4に示すように、CDsとDOXに起因する鮮やかな緑色と赤色の蛍光ががん細胞内で観察されました。特に、強い緑色蛍光信号が主に細胞質に局在し、CDsの細胞内分布を示しました。逆に、赤色信号は細胞質と比較して細胞核で有意に強く、DOXがCDsから離れ、DNAへの高い親和性により直接細胞核に移動したことを示唆します。これは、エンドソームとリソソームの低pH値（5.0）がDOX-CDsからのDOX放出を助けることで説明できます。したがって、DOX-CDsは細胞標識と細胞内薬物送達の有望な薬剤となり得ます。

In Vivo動物イメージング研究

ヌードマウスにCDs水溶液（50μL、6mg/mL）を皮下投与しました。マウスを腹腔内注射で1%ペントバルビタールで麻酔し、488nm励起光と535nm放出フィルターでTanon-5200Multi Gelイメージングシステムで撮影しました。図5aに示すように、投与部位で強い緑色蛍光が観察され、CDsの蛍光がマウスの皮膚と組織を効果的に透過できることが示唆されました。さらに、マウスは注射後も健康を維持し、CDsが動物に対して優れた生体適合性と低毒性を持つことを示しました。すべての結果を考慮すると、CDsはin vitroとin vivoで優れたルミネセンスプローブとして機能可能です。

さらに、ナノプローブを尾静脈注射してCDsの生体分布と排泄経路を実施しました。異なる時点（0、0.5、1、3時間）にさまざまな臓器を剖出し、蛍光イメージングを行いました。図5bに示すように、注射後、腎臓と膀胱が心臓、脾臓、肝臓など他の臓器と比較してはるかに強い蛍光信号を示しました。さらに、腎臓の蛍光信号は注射後0.5時間以内に有意に増加し、1時間後には徐々に減少しました。その後、膀胱の蛍光信号が0.5時間から1時間にかけて徐々に増加し、CDsが腎臓から膀胱に運ばれたことを示しています。結果は、CDsが腎臓と膀胱系で排泄・クリアランス可能であることを示しました。

In Vivo長期毒性試験

さらに、CDsを臨床研究に採用する可能性を完全に調査するため、in vivo長期毒性研究も実施しました。クンミンマウスに尾静脈からPBSとCDsを注射し、主要臓器（心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓）を7日と21日後に採取して組織学的分析を行いました。その後、組織学的組織の画像を顕微鏡で撮影し、実験群と対照群の病理学的差異を評価しました。図6に示すように、CDs投与動物の主要臓器で顕著な臓器損傷と炎症病変は観察されず、調製されたCDsが臨床使用とin vivo研究に安全であることを示唆しています。したがって、合成された緑色CDsはバイオマーカーとバイオイメージングプローブとして生体適合性があります。

結論

結論として、本研究はバイオイメージングと細胞内薬物送達強化のため、93%の高QYを持つ緑色蛍光CDsのコスト効率の良い調製を実証しました。DOXがCDsに成功裏に結合し、良好な結晶構造、優れた水溶液安定性、優れた光ルミネセンス特性を持つDOX-CDsを形成しました。DOX-CDsは細胞内pH環境に応答して酸誘発性細胞内放出を促進しました。pH感受性に起因し、DOX-CDsはHO-8910細胞の増殖に効果的な阻害を示しました。DOX-CDsは優れた細胞標識能力を示し、エンド/リソソームpHに応答して細胞内でDOXを放出しました。CDsはin vitroとin vivoの両方で蛍光プローブとして機能しました。最後に、組織学的分析でCD投与マウスから顕著な毒性効果は観察されませんでした。それにもかかわらず、本研究はコスト効率の良い方法で作製されたCDsが生体医用イメージングと細胞内薬物送達に大きな可能性を持つことを実証しました。