電子励起エネルギー移動によって研究されたポリスチレン-ジフェニルオキサゾール-ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）ハイブリッドナノシステムによるクロリンe6光増感剤の取り込み

背景

癌の光線力学療法の主な欠点は、組織への励起ビームの浸透の深さが浅いことです[1]。このように、癌治療への放射線力学療法のアプローチ（感作物質を体の奥深くまで浸透できるX線で効率的に励起できる）が提案され[2]、ここ数年集中的に研究されています[3,4,5]。研究範囲の1つは、X線励起時に一重項酸素を生成する増感剤の開発です[5、6、7、8]。このようなX線増感剤の重要なプロセスは、そのシンチレーションコンポーネントと増感コンポーネントの間の電子励起エネルギー移動（EEET）です[2、6、9、10、11]。前述のX線増感剤のもう1つの重要なコンポーネントは、EEETに最適な距離でシンチレーション部品と増感部品を一緒に維持する方法です。化学的共役[2、3]、静電引力[8、12]、界面活性剤[11]、またはポリマーシェル[4]が挙げられます。以前、一重項酸素のX線励起増感用のナノシステム（NS）を設計するフレームで、ポリスチレン（PS）-ジフェニルオキサゾール（PPO）-クロリンe ₆ でEEETを研究しました。 NS、光増感剤クロリンe ₆ 界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム）シェル[15]を介してPS-PPOナノ粒子（シンチレータとして使用可能[13、14]）に結合しました。

ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（PNIPAM）は、内部または外部の刺激に応答してその特性を変化させる刺激応答性材料に属します[16]。線形PNIPAMは、加熱するとコンフォメーション変化を起こすことが知られています。つまり、線形PNIPAMの32°Cに等しい下限臨界溶液温度（LCST）を超える温度で、ポリマーが収縮します（疎水性になり、水分子が排出されるため）[17]。 。 [17]のPS-PNIPAMナノ粒子では、LCSTでの温度転移によるPNIPAMシェル幅の大幅な減少が示されました。同時に、デキストランに結合したPNIPAM鎖の場合、コンフォメーションを妨げるPNIPAM鎖間の立体相互作用により、同様の分子量と多分散性の線形PNIPAMと比較して、コンフォメーション転移の温度が2〜4°C高いことが示されました。遷移[18]。

この作業では、架橋PNIPAMシェル（図1および2）で覆われたPS-PPOナノ粒子が得られ、PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSが得られました。クロリンe ₆ を結合するために架橋PNIPAMを使用する可能性 PS-PPONPシンチレータに対する増感剤を研究した。このポリマーは、生理学的温度でコンフォメーション変化を示します（架橋PNIPAMの場合、LCSTは32°Cより高くする必要があります）。したがって、励起下での加熱後の架橋PNIPAMネットワークの収縮は、PS-PPOドナーとクロリンe ₆ の間の距離の減少をもたらす可能性があります。 EEETの効率を高め、腫瘍破壊の効率を高めるアクセプター。

PS-PPO-PNIPAMハイブリッドナノシステムとクロリンe ₆ の構成要素の構造

得られたPS-PPO-PNIPAMハイブリッドナノシステムのTEM画像（倍率が低い（左）と高い（右））

実験的

資料

p.a.のスチレン（ST、ウクライナ）品質は、重合の直前に標準的な方法で精製されました。 N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAM、Sigma-Aldrich Inc。）、N、N'-メチレンビスアクリルアミド（BIS、Sigma-AldrichInc。）、過硫酸カリウムK ₂ S ₂ O ₈ （KPS、ウクライナ）、リン酸二水素ナトリウム一塩基性二水和物NaH ₂ PO ₄ ×2H ₂ O（ウクライナ）および陰イオン界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、Sigma-Aldrich Inc.）は試薬グレードであり、さらに精製することなく使用しました。クロリンe ₆ （Frontier Scientific Inc.）はT.Yから提供されました。 Ohulchanskyy（ニューヨーク州立大学バッファロー校のレーザー、フォトニクス、バイオフォトニクス研究所）。 50ミリモルのTRIS-HClバッファー（pH 7.2）を溶媒として使用しました。

ナノシステムの合成と特性評価

PPOをドープしたポリスチレン-ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）ハイブリッドナノシステム（PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNS）を次のように合成しました。まず、PPOをドープしたPS-co-PNIPAMコアナノ粒子をマイクロエマルジョン重合によって調製しました[13、14、19、20]。簡単に説明すると、0.2 gのNIPAM、0.2 gのドデシル硫酸ナトリウム、および0.01gのNaH ₂ PO ₄ ×H ₂ Oを90gのH ₂ に溶解しました O.次に、0.09gのPPOを1.8gのスチレンに溶解し、得られた混合物も30分間滴下しました。混合物を700rpmで攪拌し、Arを混合物に30分間バブリングしました。温度が70°Cに上昇した後、0.01gのK ₂ S ₂ O ₈ 1mlのH ₂ に溶解 重合を開始するためにOを注入した。次に、PNIPAMシェル層を70°Cで4時間加熱した後に製造しました。この目的のために、モノマーNIPAM（0.69 g）と架橋剤N、N'-メチレンビスアクリルアミド（BIS）（0.06 g）の水溶液をシリンジを使用して反応器に添加しました。反応は70°Cで3時間、さらに90°Cで1時間継続しました。混合物を室温まで冷却し、MWCO 3500Daのセルロース膜を使用して48時間透析しました。

得られたナノシステムの遷移電子顕微鏡（TEM）画像を図2に示します。サンプルの準備では、グロー放電処理（Elmo、Cordouan Technologies Bordeaux France）により、プレーンカーボンフィルムを備えた400メッシュのCuグリッドを親水性にしました。 5μlの液滴を堆積させて1分間吸着させた後、余分な溶液を濾紙で取り除きました。 PS-PPO-PNIPAMナノシステムの観察は2つのTEM、Tecnai G2またはCM12（FEI、アイントホーフェン、オランダ）で行われ、画像はTecnaiのssCCDEagleカメラとCM12のMegaviewSISカメラで取得されました。図2から、得られたハイブリッドナノシステムは、いくつかの結合した球状PS-PPONPで構成されていることがわかります。それらは架橋されたPNIPAMポリマーネットによって結合されていると私たちは信じています。このようにして、PS-PPO-PNIPAMハイブリッドナノシステムが得られました。

スペクトル測定とサンプル準備

Specord M40分光光度計（Carl Zeiss、ドイツ）を使用して吸収スペクトルを測定しました。蛍光励起および発光スペクトルは、Cary Eclipse蛍光分光光度計（Varian、オーストラリア）の助けを借りて登録されました。吸光度と蛍光の測定は、1×1cmの石英セルで室温で行いました。 50ミリモルのTRIS-HClバッファー、pH7.2を溶媒として使用しました。スペクトル測定では、得られたPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSの溶液をバッファーに100回溶解しました。クロリンe ₆ のストック溶液 濃度10mMをDMFで調製し、さらにバッファーで1mM濃度に希釈しました。クロリンe ₆ のこの1mM溶液の少量のアリコート 次に、NSの100倍溶解した緩衝液に加えた。クロリンの最終濃度e ₆ は2μMであり、DMF混合物は0.02％でした。クロリンe ₆ を含むPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNS溶液の蛍光励起および発光スペクトル クロリンe ₆ の添加後、0、5、10、20、40、60、80、および100分で測定されました。 PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSのソリューションに。 80分近くで、飽和状態に達しました。

温度依存測定の場合、クロリンe ₆ の存在下でのPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSの溶液 サーモスタット付きセルホルダー（ T =23°C）。サンプルの準備後88分、クロリンe ₆ の取り込み後 PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSが飽和状態に達したため、サンプルを39°Cに加熱すると、ウォーターバスからの水の流れが切り替わりました（この温度は、架橋PNIPAMのLCSTを超える必要があります）。クロリンe ₆ の蛍光励起スペクトル 次に、加熱を開始した後、さまざまな時間間隔で（680 nmでの発光）を測定しました。実験結果によると、加熱を開始してから約3分でコンフォメーションの遷移が始まります。加熱を開始してから約18分後に、NSの凝固が起こり、巨視的な血餅が生じました（ただし、溶液を冷却すると凝固が元に戻ります）。温度実験は3回行われ、同様の傾向が得られました。

結果と考察

50 mM Tris-HClバッファー（pH 7.2）で得られたPS-PPO-PNIPAMハイブリッドナノシステムの吸収、蛍光励起、および蛍光発光スペクトルを図3に示します。吸収スペクトルには、スチレンに対応するバンドが含まれています（最大260 nm付近）。 ）およびPPO（最大307 nm付近）。同時に、250 nmでの励起時の蛍光発光スペクトル（スチレン吸収の範囲）は、PPOのみに属するスペクトル（最大367 nm）をもたらし、スチレンの発光（307 nmでのピーク）をもたらしました[15]。 ）は観察されなかった。したがって、スチレンから組み込まれたPPOへのEEETはほぼ完了しています。 EEETは、PPO発光の励起スペクトル（380 nm）によってもサポートされており、260 nm付近のスチレンバンドがはっきりと観察されます（図3）。 PSマトリックスへのPPOの取り込みをさらに示す、PPO発光スペクトル（PPO水溶液では観察されない[14]）で明確な振電構造が観察される可能性があることを追加する必要があります。

得られたPS-PPO-PNIPAMハイブリッドナノシステムの吸収（黒の実線）、蛍光励起（380 nmでの発光、正規化、黒の一点鎖線）、および発光（250 nmでの励起、正規化、赤の実線）スペクトル50 mM Tris-HClバッファー（pH 7.2）

さらに、得られたPS-PPO-PNIPAMハイブリッドナノシステムを50 mM Tris-HClバッファー（pH 7.2）に溶解した場合、光増感剤クロリンe ₆ 追加されました。クロリンe ₆ の吸光度スペクトル 最大値での光学密度のわずかな減少を除いて、緩衝液と比較してハイブリッドナノシステムの存在にほとんど変化がないことを示しています（図4）。

クロリンe ₆ の吸光スペクトル （2μM）フリー（黒線）およびPS-PPO-PNIPAMハイブリッドナノシステムの存在下（赤線）、50 mM Tris-HClバッファー、pH 7.2

同時に、クロリンe ₆ の添加効果 PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSの蛍光スペクトルは、吸収スペクトルに比べてはるかに目立ちます。まず第一に、クロリンe ₆ の存在 PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSのPPO蛍光発光の消光につながり、この消光は約1時間で増強されます（図5）。一般に、このような消光は、EEET（すべての発光波長でのドナー発光の消光につながる）または再吸収（アクセプター吸収の波長でのドナー発光の消光につながる）のいずれかが原因である可能性があります。 PPO発光スペクトルの違い（図5）は、クロリンe ₆ の直後を示しています。 さらに、PPO放出抑制への再吸収の寄与は重要です（ただし、EEETも発生します）。同時に、再吸収の寄与は時間とともにさらに減少し、EEETの寄与は大きくなります。

PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSフリー（黒い実線）およびクロリンe ₆ の添加時の蛍光スペクトル 0分（黒い一点鎖線）と80分（黒い一点鎖線）で測定されます。励起波長は250nmです。 50ミリモルのTris-HClバッファー、pH7.2を溶媒として使用します。スペクトルの違い（実線、一点鎖線、一点鎖線の赤い線）は、発光消光に対する再吸収と電子励起エネルギー移動（EEET）の寄与を示しています

クロリンe ₆ の添加による別の効果 PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSは、クロリンe ₆ の出現です。 遊離クロリンe ₆ の発光と比較して、長波長領域にシフトする発光（250 nmでのPSの励起時）;強度とシフトの両方が時間とともに増加し、約1時間で飽和状態に達します（図6）。このシフトは、クロリンe ₆ の結合分子に対する周囲のPNIPAMの影響を示しています。 。同時に、クロリンe ₆ の放出 PS-PPO-PNIPAM NSの存在下では、それ自体の吸収（400 nm）への励起時にわずかに変化します。クロリンe ₆ の小さな変化と一緒に 吸収（図4）、これはクロリンe ₆ のごく一部のみを意味します 分子はPS-PPO-PNIPAMNSに結合しています。

クロリンe ₆ の蛍光スペクトル 無料でPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSに追加されました（追加後0、5、10、20、40、80分で測定）。励起波長は250nmと400nmです。 50 mM Tris-HClバッファー、pH7.2を溶媒として使用しました。一点鎖線の矢印は、250nmと400nmで励起されたスペクトルを示しています。実線の矢印は、クロリンe ₆ の添加後の時間（t）の増加を示しています 250nmで励起されたスペクトルの場合

最後に、PS-PPOバンドは、クロリンe ₆ の励起スペクトルに現れます。 PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSに追加（680 nmでの発光、PNIPAM結合クロリンe ₆ の寄与 クロリンの総排出量e ₆ 最大値に近い）。このバンドは最初は弱いですが、さらにその強度は時間とともに大幅に増加します（図7）。同時に、このPS-PPOバンドは、クロリンe ₆ の励起スペクトルでは非常に弱いです。 660 nmでの発光時（つまり、遊離クロリンe ₆ の最大値 スペクトル）クロリンe ₆ の添加後100分後でも 。

クロリンe ₆ の蛍光励起スペクトル 無料でPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNS（追加後0、10、80、100分で測定）、およびPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNS自体に追加されます。クロリンe ₆ の発光波長 660 nm（正規化された強度）と680nmです。 PS-PPO-PNIPAMNSの発光波長は380nm（正規化された強度）です。 50ミリモルのTris-HClバッファー、pH7.2を溶媒として使用します

したがって、クロリンe ₆ PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSに結合し、PSマトリックスからEEETを発生させ、PPOをクロリンe ₆ にカプセル化します。 。 EEETの効率は時間とともに向上します（クロリンe ₆ 後約1時間） さらに）、クロリンe ₆ の取り込みを示します PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSのPNIPAMネットワークによるこの期間中も進行します。同時に、クロリンe ₆ の比較的少量 ソリューションに存在するものはPNIPAMによってバインドされます。

PS-PPO NPは、X線で励起されたときにPPO [14]または付着したポルフィリン[13]の蛍光を発することが示されたことにも言及する必要があります。したがって、PSからクロリンe ₆ へのEEET PSのUV励起下でPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSで観察されたということは、X線のエネルギーがクロリンe ₆ にも伝達される可能性があることを意味します。 研究されたNSで。同時に、このようなNPのX線誘導放出を直接観察するには、かなり高濃度のPS-PPO NPが必要です[13、14]。このようなNSのX線に対する感度を高める方法の1つは、重原子を含む成分を追加することです。

PNIPAMは、32°Cに等しいLCSTでコンフォメーション転移を経験することが知られています。架橋ポリマーの場合、LCST値はさらに高くなるはずです。 PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSが、PS-PPONPを取り巻く架橋PNIPAMネットワークとクロリンe ₆ で構成されている場合 PNIPAMネットワークにバインドされているため、PPO-クロリンe ₆ の減少が期待できます。 距離、したがってハイブリッドNS全体を加熱したときのEEET効率の向上。

この考えを検証するために、クロリンe ₆ の存在下でのPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSの加熱の影響 クロリンe ₆ の蛍光励起スペクトルに関する研究 研究されました。加熱実験は3回行った。同様の傾向が示されました。これらの実験の1つの結果を図1および2に示します。したがって、クロリンe ₆ の存在下でのPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSの溶液 39°Cの温度に加熱されました（この温度は、架橋PNIPAMのLCSTを超える必要があります）。クロリンe ₆ の取り込み後に加熱が開始されました PS-PPO-PNIPAMによるハイブリッドNSは飽和状態に達しました。加熱中のクロリンの比率e ₆ 320 nmで励起したときの蛍光強度（680 nmでの発光）（ I _ex320 ;それはクロリンe ₆ PPOからクロリンへの放出e ₆ EEET）および404 nm（ I _ex404 ;それはクロリンe ₆ 独自のソーレー帯への励起時の発光）が研究されました（図8および9）。この比率は、PPOとクロリンのe ₆ の効率を反映していると考えています。 EEET。したがって、加熱が開始されてから最初の3分間は、 I _ex320 / 私 _ex404 おそらくクロリンe ₆ の減少により、0.9から0.85に減少しました。 -温度上昇時のPNIPAM結合親和性。さらに、 I の値 _ex320 / 私 _ex404 比率は1.02まで増加し、これに伴って光散乱が増加しました（図8;散乱は660 nm付近で強度が増加することで明らかになります）。これは、架橋されたPNIPAMネットワークボリュームの減少につながるPNIPAMのコンフォメーション遷移によって説明できます。これにより、PS-PPOドナーとクロリンe ₆ の間の距離が短くなります。 アクセプター分子はPNIPAMネットワークに結合しているため、EEET効率が向上します。

クロリンe ₆ の蛍光励起スペクトル（404 nmで正規化） PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSに23°C（黒線）および39°C（加熱をオンにしてから14分後、赤線）で追加。発光波長680nm; 50 mM Tris-HClバッファー、pH7.2を溶媒として使用しました

クロリンの発光強度比e ₆ の39°Cへの加熱後の時間依存性 320nmで励起すると680nmでPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSに追加されます（クロリンe ₆ へのさらなるEEETによるPPOによる吸収 ）404 nmで励起した場合（クロリンe ₆ の直接励起 ）。エラーバーは、登録された励起スペクトルのノイズを説明します

要約すると、クロリンe ₆ の存在下でのPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSの溶液中のプロセス 加算は次のように説明できます。まず、クロリンe ₆ の添加 PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSを緩衝液に溶解すると（図10、プロセス1）、クロリンe ₆ のごく一部が浸透します。 ハイブリッドNSのPNIPAMネットワークに。これにより、PSおよびPPOからクロリンe ₆ へのEEETが発生しました。 。このような浸透は、EEET効率の向上に伴い、約1時間進行します（図10、プロセス2）。サンプルをLCSTを超える温度までさらに加熱すると、PNIPAMネットワークのコンフォメーション遷移が発生し、PS-PPOとクロリンe ₆ の間の距離が短くなります。 分子、したがってPS-PPOからクロリンへのe ₆ のさらに高い増加 EEETの効率（図10、プロセス3）。

クロリンe ₆ の存在下でのPS-PPO-PNIPAMハイブリッドNSの溶液におけるプロセスの提案されたスキーム クロリンe ₆ の添加時 （プロセス1）、約1時間経過（プロセス2）、さらに23〜39°Cに加熱（プロセス3）

結論

蛍光研究により、クロリンe ₆ の取り込みが明らかになりました PS-PPO-PNIPAMハイブリッドNS、およびカプセル化されたPPOを介したPSマトリックスからクロリンe ₆ への電子励起エネルギー移動による;取り込みは約1時間で飽和状態に達しました。

PS-PPO-PNIPAM-クロリンe ₆ の加熱 21〜39°CのNSにより、EEET効率が向上します。これは、PS-PPOドナーとクロリンe ₆ の間の距離を縮めるPNIPAMコンフォメーション転移と一致しています。 アクセプター。

一方、クロリンe ₆ の比較的小さな部分 ソリューションに存在するものはPNIPAMにバインドされています。したがって、この方向でのさらなる研究が必要です。

略語

EEET：

電子励起エネルギー伝達

LCST：

臨界溶液温度を下げる

NS：

ナノシステム

PNIPAM：

ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド

PPO：

ジフェニルオキサゾール

PS：

ポリスチレン

TEM：

透過型電子顕微鏡