トランスフェリン受容体による細胞内在化が増強されたパクリタキセルベースの標的脂質ナノ粒子の抗増殖およびアポトーシス誘発能—白血病細胞での研究

背景

白血病は、白血球の多数の重複と増殖を特徴とする典型的な血液がんです[1]。したがって、白血病はリンパ系と骨髄に深刻な影響を及ぼし、数人の患者の死亡率が高くなります。異常な造血幹細胞は、骨髄で制御されていない増殖を引き起こし、未熟なWBCの産生をもたらします[2、3]。化学療法は、この病気の治療の最も好ましい選択です。しかし、ほとんどの化学療法薬は治療効果をもたらさず、正常組織に重度の毒性を引き起こします[4、5]。したがって、白血病の即時治療は、癌患者の生存に不可欠です。薬物の有効性を高めながらその毒性効果を減らすことができる新しい送達戦略は、時間の必要性です[6]。

パクリタキセル（PTX）は、白血病を含む複数の癌の治療における強力な薬剤の1つと見なされています[7]。 PTXの潜在的な臨床効果は、健康な組織への骨髄抑制などの全身的な副作用によって大幅に妨げられます。さらに、遊離薬物は、その治療効果を引き出すことなく、体循環から迅速に排除されることが報告されました[8]。したがって、抗がん剤の安定性と治療効果を高めるために適切な送達システムを設計することが重要です。複数の担体システムの中で、脂質ナノ粒子は優れた全身安定性を持っていると報告されています[9、10]。具体的には、固体脂質ナノ粒子（SLN）は、カプセル化された薬物の化学的分解を防ぎ、バイオアベイラビリティを高めるユニークなクラスの魅力的なナノキャリアシステムです[11]。 SLNの顕著な特徴には、優れた安定性、薬物の制御放出、室温での安定性、生体適合性および生分解性脂質システムの使用、およびパクリタキセルなどの親油性薬物の高い捕捉効率が含まれます。薬物のナノ粒子カプセル化は、強化された透過性および保持（EPR）効果により、優先的に腫瘍に蓄積すると予想されます[12、13、14]。ナノ粒子はカプセル化された薬物の有効性を高める可能性がありますが、ただし、腫瘍へのターゲットの特異性はまだ問題です。この問題に対処するために、ナノ粒子は、癌細胞で過剰発現する受容体を特異的に標的とし、薬物の蓄積と有効性を高めることができる標的リガンドで修飾することができます[15、16]。この研究では、白血病細胞で過剰発現しているトランスフェリン受容体に特異的に結合するトランスフェリンを採用しました。白血病は、膨大な数のトランスフェリン受容体を過剰発現することが知られています。トランスフェリン結合ナノ粒子は、受容体を介した方法で癌細胞に蓄積します[17]。

この研究では、パクリタキセルでカプセル化されたトランスフェリンで装飾された固体脂質ナノ粒子からなる多機能ナノ粒子を開発しました。トランスフェリンをSLNに組み込むために、T _f を合成しました。 -PEGとオレイン酸のコンジュゲーションによるPEG-オレイン酸コンジュゲート。次にトランスフェリンとコンジュゲートしました。 PEGの存在は、invitroおよび全身環境でのナノキャリアの安定性を高めます。さらに、キャリアの外面にPEGが存在すると、キャリアシステムの循環器系の可能性が高まり、それによって治療効果が高まります。

全体として、この研究の主な目的は、PTXをロードした多機能ナノ粒子を開発し、白血病細胞を標的にすることでした。ナノ粒子の物理化学的側面を調査した。遊離薬物および薬物負荷製剤の細胞毒性効果を白血病癌細胞で試験した。トランスフェリンリガンドの標的特異性を描写するために、細胞取り込み実験を行った。標的ナノ粒子の優れた抗癌効果は、Hoechst 33342アポトーシスアッセイによってさらに研究され、アネキシンVおよびPIで染色した後、フローサイトメーターを使用して定量的に研究されました。

メソッド

資料

Compritol 888 ATO（Glycerol behanate）は、Gattefosse（中国）から提供されました。コレステロール、オレイン酸、およびパクリタキセルは、中国のSigma-Aldrichから購入しました。ヒトトランスフェリン（Tf）は、中国のSigma-Aldrichから購入しました。他のすべての化学物質は試薬グレードであり、そのまま使用されました。

パクリタキセルをロードしたトランスフェリン結合固体脂質ナノ粒子の調製

トランスフェリン-PEG-オレイン酸（Tf-PEG-OA）コンジュゲートは、アミド結合相互作用に基づいて合成されました[18]。簡単に説明すると、モル比1：2：2のオレイン酸、NHS、およびDCCを有機溶媒に溶解し、16時間撹拌しました。反応は室温で行った。これとは別に、NH2-PEG-COOHをDMSOに溶解し、トリエチルアミンを添加して、不活性雰囲気下で12時間まで反応させました。そのように形成されたPEG-OAは、透析および凍結乾燥プロセスによって収集された。ここで、モル比1：2：2のPEG-OA、DCC、およびNHSをDMSOに溶解し、トランスフェリン（TEAとともに）を反応混合物に添加し、不活性雰囲気中で12時間反応を行いました。このように形成されたTf-PEG-OAを含む製剤は、48時間透析された後、凍結乾燥され、実験のさらなる処理の下で保存されました。

SLNは溶媒蒸発法[19]によって調製されました。簡単に説明すると、PTX、Compritol 888 ATO、コレステロール、およびTf-PEG-OAをエタノール/クロロホルム（1：5）からなる有機混合物に溶解し、30分間撹拌しました。得られた有機溶液を1％ポリビニルアルコールを含む水相にゆっくりと加え、T25ホモジナイザー（IKA、インド、バンガロール）を使用して12,000rpmで直ちにホモジナイズしました。次に、溶液を3分間プローブ超音波処理しました。すべての有機溶媒が蒸発するまで、分散液を12時間撹拌しました。捕捉されていない遊離薬物は、Amicon Ultra-4遠心フィルター（Millipore Corporation、Bedford、USA）を使用して、水によって薬物をロードしたナノ粒子から3回分離されました。捕捉効率（EE）とローディング効率（LE）はHPLC法で測定しました。薬物をロードしたナノ粒子はメタノールで、30分間攪拌し、等量の水で希釈しました。ロードされた薬物の量は、HPLCカラムに注入することによって計算されました。薬物をロードした脂質ナノ粒子は、さらに使用するまで4°Cで保存しました。

ナノ粒子の物理的特性評価

さまざまなナノ粒子の粒子サイズと分布は、Zetasizer ZS Nano Malvern Instruments、UKを使用した動的光散乱（DLS）法によって評価されました。粒子を蒸留水で希釈し、分析に使用しました。研究は室温で3回行った。

ナノ粒子の形態は、JEM-2000EX（JEOL、日本）を使用した透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して観察されました。ナノ粒子をリンタングステン酸で染色し、15分間放置しました。次に、粒子を水から排出し、赤外光で5分間乾燥させました。粒子はTEMを使用して画像化されました。

インビトロ薬物放出研究

2つのナノ粒子のinvitro薬物放出特性は、透析法を使用して研究されました。簡単に説明すると、1 mlのナノ粒子分散液を透析メンブレンバッグ（MWCO：3500）に詰め、メンブレンの両端を適切に密封しました。放出実験は、エンドシールされた透析バッグを100rpmの速度で自動シェーカー内の10mlの放出媒体に入れることによって開始されました。特定の時点で、1 mlのサンプルを収集し、HPLCを使用して薬物放出を分析しました。ポンプ（シリーズ200）、オンライン真空デガッサ（シリーズ200）、オートサンプラー（シリーズ200）、カラムオーブン（シリーズ200）、UV / VIS検出器（シリーズ200）を備えたPerkin Elmer HPLCシステム（米国ノーウォーク） ） 使われた。プレカラムガードカートリッジRP18（30×4.6 mm、10μm; Norwalk、USA）で保護されたC18カラム（250mm×4.6mm、5μm）を使用しました。線形勾配が適用されました。 0分、10％アセトニトリル; 30分、90％アセトニトリル、214nmで分析。

細胞毒性アッセイ

遊離薬物および薬物負荷ナノ粒子の細胞毒性は、4,5-（ジメチルチアゾール-2-イル）2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイによって評価されました。ウェルあたり8000細胞の播種密度のHL-60細胞を、96ウェルプレートに播種し、24時間インキュベートしました。次に、細胞をさまざまな濃度の遊離薬物および薬物負荷製剤で処理し、加湿CO ₂ 中で37°Cで24時間さらにインキュベートしました。 （5％）インキュベーター。次に、細胞を10μlのMTT溶液（5 mg / ml）で4時間処理しました。次に、細胞をDMSOに曝露し、20分間インキュベートしました。次に、マイクロプレートリーダー（Multiskan GO、USA）を使用して、570nmでホルマザン結晶の吸光度を調べました。ホルマザンの吸光度は、各ウェルに存在する生細胞の量に正比例します。

ナノ粒子の細胞への取り込み

白血病細胞に対するナノ粒子の標的化効率は、invitroレベルでの細胞取り込み実験によって評価されました。簡単に説明すると、HL-60細胞を6ウェルプレートに3×10 ⁵ の播種密度で播種しました。 ウェルあたりの細胞。処理前に細胞を24時間インキュベートしました。蛍光とナノ粒子の追跡を観察するために、ナノ粒子に蛍光色素としてローダミンBをロードしました。色素をロードしたナノ粒子をがん細胞に曝露し、3時間インキュベートしました。次に、細胞を洗浄し、スライドガラスにマウントした。次に、共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM、ニコン、日本）を使用して細胞を観察しました。

Hoechst33342アッセイ

ヘキスト33342染色を使用して定性的アポトーシスアッセイを実施した。簡単に説明すると、HL-60細胞を6ウェルプレートに3×10 ⁵ の播種密度で播種しました。 ウェルあたりの細胞。処理前に細胞を24時間インキュベートしました。細胞をそれぞれの製剤で処理し、24時間インキュベートしました。次に、細胞をPBSで2回洗浄し、4％パラホルムアルデヒド溶液で10分間固定しました。次に、細胞のアポトーシスを蛍光顕微鏡を使用して観察しました。

フローサイトメーターベースのアポトーシスアッセイ

定量的アポトーシスは、アネキシンVおよびPIで染色することによりフローサイトメーターによって評価された。簡単に説明すると、HL-60細胞を6ウェルプレートに3×10 ⁵ の播種密度で播種しました。 ウェルあたりの細胞。処理前に細胞を24時間インキュベートしました。次に、細胞をさまざまな濃度の遊離薬物および薬物負荷製剤で処理し、加湿CO2（5％）インキュベーター内で37°Cで24時間さらにインキュベートしました。翌日、細胞を適切に洗浄し、細胞を注意深く抽出しました。細胞を遠心分離し、ペレットをそれぞれ2.5μlのアネキシンVと2.5μlのPIで処理し、15分間インキュベートしました。次に、容量を1 mlにし、フローサイトメーター（BD FACS、Biosciences、USA）を使用して細胞選別を行いました。

コロニー形成アッセイ

1000細胞/ウェルを6ウェルプレートに播種し、培地の量を2mlに調整しました。細胞を2日間コロニーを形成させました。細胞は、0.1μg/ mlに相当するPTXの用量でさまざまな製剤で処理され、10日間インキュベートされました。プレートをPBSで洗浄し、メタノールで固定し、ヘマトキシリンで染色し、洗浄して風乾します。コロニー密度は、MultimageTMライトキャビネット（Alpha Innotech Corporation、カリフォルニア州サンリアンドロ）を使用し、AlphaEaseFCTMソフトウェアを使用してカウントしました。

統計分析

差異の有意性は、両側の学生の t を使用して評価されました。 テストまたは一元配置分散分析。違いは、 p のレベルで有意であると見なされました <0.05。

結果と考察

白血病は、白血球の多数の重複と増殖を特徴とする典型的な血液がんです。この研究では、パクリタキセルでカプセル化されたトランスフェリンで装飾された固体脂質ナノ粒子からなる多機能ナノ粒子を開発しました。トランスフェリンをSLNに組み込むために、PEGとオレイン酸を結合させてTf-PEG-オレイン酸結合体を合成し、次にトランスフェリンと結合させました（図1）。 PEG-オレイン酸-Tfは、粒子調製の複数の目的に使用されます。粒子表面にTfリガンドが存在すると、受容体が過剰発現している癌細胞に対する粒子の標的特異性が高まります。外面にPEGが存在すると、個々の粒子に安定性を与える、非常に必要な立体的バランスが得られます。このメモを原稿に追加しました。

PTXをロードしたトランスフェリンで装飾された固体脂質ナノ粒子の調製の概略図

ナノ粒子の物理化学的特性評価

薬物をロードしたナノ粒子は、溶媒蒸発法とそれに続く均質化によって調製されました。 PTXをロードした脂質ナノ粒子（PLN）の平均粒子サイズは約140 nmでしたが、トランスフェリンで装飾されたPTXをロードした脂質ナノ粒子（TPLN）の最終的な粒子サイズは約160 nmでした（図2a）。粒子サイズのわずかな増加は、ナノ粒子表面へのトランスフェリンの結合に起因していました。サイズや電荷などの粒子特性は、その全身性能にとって重要な要素であると報告されています。サイズと電荷は、細胞への取り込みと細胞への毒性作用に重要な役割を果たします。本研究で観察された200nm未満の粒子サイズは、強化された透過性と保持（EPR）効果により、癌組織に粒子を特異的に蓄積できるため、癌の標的化に最も適していると報告されています[ 9、20、21]。同様に、ナノ粒子の表面電荷は、細胞表面とのコロイド安定性粒子の相互作用を決定します。 TPLNの平均表面電荷は-22.5±1.56mVであり、癌を標的とする可能性を示しています。次に、粒子の形態をTEMで調べました（図2b）。粒子は完全に球形であり、TEMグリッドに均一に分布していました。粒子の均一な分布は、調製方法の成功を示しています。

a 動的光散乱（DLS）分析によって測定されたTPLNの粒子サイズ分布。 b 透過型電子顕微鏡（TEM）による粒子形状測定。 DLS実験は3回行った（ n =3）

薬物の装填とinvitroでの薬物放出

ナノ粒子へのPTXの捕捉効率は92.5±1.35％であり、アクティブローディング効率は8.6％ w であることが観察されました。 / w 。 PLNおよびTPLNのinvitro薬物放出特性を透析法により研究した。 PLNとTPLNは、キャリアシステムからの薬物の持続放出を示し、癌を標的とするアプリケーションへの適合性を示しています。たとえば、24時間の研究期間の終わりに、両方のナノ粒子から放出された薬物の約30％（図3）。同様に、薬物の放出は75時間の終わりまで持続し、平均放出は約65％でした。 TPLNは、PLNと比較してはるかに持続的な薬物放出を示したことに注意する必要があります。薬物のわずかに低い放出は、主に、ナノ粒子の表面へのトランスフェリンリガンドの結合に起因した。トランスフェリンの高分子量は、薬物の放出を大幅に阻害する可能性があります。全体として、ナノ粒子からの薬物の持続的かつ長期的な放出は、薬物が脂質マトリックスとともに十分に分散され、初期のバースト放出または二相性放出パターンを回避したことを示している。全体として、キャリアシステムからの薬物の制御放出は、癌治療を強化する可能性があります。

PLNからのPTXおよびリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）からのTPLNのinvitro薬物放出特性。薬物放出は透析法によって研究され、薬物はHPLC法によって定量化されます。測定は n で行われました。 =3

ナノ粒子の細胞への取り込み

白血病癌細胞に対するナノ粒子の標的化の可能性は、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）によってテストされました。ナノ粒子をがん細胞に曝露し、3時間インキュベートしました。ローダミンBは、癌細胞内のナノ粒子の分布を追跡するための蛍光色素として使用されました。図4に示すように、赤色蛍光強度は、TPLNに比べてPLNの方が比較的低かった。結果は、PLNの蛍光と比較して細胞質の蛍光が著しく高いことを明確に示しており、癌細胞に対するTPLNの優れたターゲティング能力を示しています。著しく高い蛍光強度は、主にトランスフェリンのナノ粒子表面への結合に起因していました。 Tfは、癌細胞で過剰発現しているTf受容体に結合することが好ましく、癌細胞でのナノ粒子の蓄積が高くなります[22]。

37°Cで共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を使用したTPLNおよびPLNの細胞取り込み分析。ローダミンBを蛍光色素として使用し、3時間インキュベートしました。ナノ粒子をインキュベーター内で37°Cで3時間インキュベートした後、細胞取り込み分析を実施しました。スケールバーは20μm

インビトロ細胞毒性アッセイ

HL-60細胞における遊離PTX、PLN、およびTPLNのin vitro細胞毒性効果は、MTTアッセイによって評価されました。図5に示すように、すべての製剤は、白血病癌細胞において典型的な用量依存的な細胞毒性効果を示しました。 ＰＴＸは用量依存的効果を示したが、ＰＬＮは比較的高い細胞毒性効果を示したことが分かる。これは、ナノ粒子からの薬物のより高い細胞内取り込みおよび持続放出に起因する可能性がある。具体的には、TPLNは、PLNと比較して癌細胞で有意に高い細胞毒性効果を示し、Tfで装飾されたナノ粒子システムの優れたターゲティング効率を示しています。 TPLNのIC50値は0.45μg/ mlでしたが、PLNのIC50値は2.8μg/ mlでした。 IC50値の6分の1の減少は、主にTf受容体を過剰発現した癌細胞におけるTPLNの細胞内取り込みの増加に起因していました。 PLNと比較してTPLNのより高い送達可能性、および核標的への薬物の持続放出が、癌細胞におけるより高い細胞毒性効果の主な原因である可能性があります。 Tfで装飾されたナノキャリアは、抗がん剤をがん細胞に送達するための標的として探索されており、それによって投与される薬剤の有効濃度を低下させ、多剤耐性（MDR）関連の要因を克服します[23]。

MTTアッセイによる遊離薬物および薬物負荷ナノ粒子の細胞毒性分析。細胞をさまざまな濃度の薬物で処理し、24時間インキュベートした後、MTTアッセイとプレートリーダーを使用して細胞を分析しました。測定は n で行われました。 =6. * p <0.05はTPLNとPTXの統計的差異です

Hoechst33342アポトーシスアッセイ

ナノ粒子の細胞毒性の可能性は、Hoechst33342アポトーシスアッセイによってさらに評価されました。それぞれの製剤で処理した後の細胞をHoechst33342で染色し、15分間インキュベートしました。図6からわかるように、未処理のコントロール細胞は球形で、健康な細胞に典型的な特徴があります。しかし、PTXで処理された細胞は細胞の形に不規則性を示しました。典型的な細胞損傷とアポトーシスは、癌細胞への取り込みの増加が原因である可能性があるPLN治療群で見られる可能性があります。 TPLNは癌細胞の最も顕著なアポトーシスを誘発し、細胞の多くはアポトーシス体形成の巨大な存在によって歪められました。顕著な細胞切断とアポトーシス誘導は、前の段落で説明したように、細胞生存率の特許と一致していました。

Hoechst33342ベースのアポトーシスアッセイ。細胞をHoechst33342で染色し、アポトーシスを蛍光顕微鏡で分析しました。細胞をそれぞれの製剤とともに24時間インキュベートしました。スケールバーは50μm

フローサイトメーターベースのアポトーシスアッセイ

アネキシンVおよびPI染色キットで染色した後、フローサイトメーターでアポトーシスアッセイの定量分析を行いました。細胞をそれぞれの製剤で処理し、24時間インキュベートしました。次に、細胞をアネキシンVおよびPIで染色した。図7に示すように、未処理のコントロール細胞は生存可能であり、99％以上の細胞が生存チャンバーに存在していました。 PTX処理により、生細胞の割合が90％に減少し、アポトーシスの約9％が発生しました。 PLNは、アポトーシス細胞の約10％、壊死細胞の約7％を示しました。重要なことに、TPLNは有意な（ p <0.05）生細胞の割合が〜65％に減少し、約〜30％のアポトーシス細胞（初期および後期アポトーシス）が見られます。 TPLNの顕著なアポトーシスの可能性は、受容体を介した細胞への取り込みと、腫瘍細胞での抗がん効果を高める可能性のあるがん細胞での抗がん剤の蓄積の増加に起因していました[24、25]。

フローサイトメーターベースのアポトーシスアッセイ。細胞をそれぞれの製剤で処理し、24時間後、細胞をアネキシンVとPIで15分間染色しました。次に、フローサイトメーターを使用して細胞を選別しました。細胞をそれぞれの製剤とともに24時間インキュベートしました。測定は n で行われました。 =3. * p <0.05はTPLNとPTXの統計的差異です

コロニー形成アッセイ

それぞれの製剤の存在下でのコロニー形成能力は、コロニー形成アッセイによってテストされました。図8。示されているように、PTXとPLNは、癌細胞のコロニー形成能力を阻害するわずかな可能性を持っています。重要なことに、TPLNは癌細胞のコロニー形成能力を制御する顕著な能力を示しました。 TPLNは、PTXの約70％のコロニー形成と比較して、約20％のコロニー形成を示し、TPLNの優れた抗癌効果を示しています。急性骨髄性白血病の維持は、コロニーを形成する能力を有する白血病幹細胞および前駆細胞のより少ない集団に依存しています。 TPLNがコロニー形成細胞のプールを標的にできるかどうかをテストすることが重要です。結果が示すように、それは白血病癌のリスクを大幅に減らすことができ、癌の発症を予防し、および/または初期の悪性細胞を排除する能力を示唆しています。したがって、コロニー形成アッセイは、製剤の潜在的な抗がん効果に関する重要な情報を提供します。

コロニー形成アッセイ。それぞれの処理後、細胞をコロニー形成アッセイプロトコルに供した。細胞をそれぞれの製剤とともに24時間インキュベートしました。 ** p <0.001はPTXとPTLNの統計的差異です

結論

全体として、トランスフェリンで装飾されたパクリタキセルをロードした脂質ナノ粒子は、白血病細胞における化学療法の有効性を高めることを目的として調製されました。結果は、PLNのそれと比較して癌細胞に対するTPLNの優れた標的化の可能性を明確に示しました。具体的には、TPLNは、PLNと比較して癌細胞で有意に高い細胞毒性効果を示し、Tfで装飾されたナノ粒子システムの優れたターゲティング効率を示しています。重要なことに、TPLNは癌細胞の顕著なアポトーシスを示し、両方のHL-60細胞で強力な抗腫瘍能力を示しました。全体として、結果は、癌治療の成功への道を開くかもしれない白血病細胞へのリガンド結合脂質ナノ粒子システムの標的化の可能性を明確に示しました。臨床動物モデルにおける製剤の治療効果とその生体内分布は、次の作業の一部になります。

略語

EPR：

強化された透過性と保持効果

OA：

オレイン酸

PEG：

ポリエチレングリコール

PLN：

PTXをロードした脂質ナノ粒子

PTX：

パクリタキセル

SLN：

固体脂質ナノ粒子

Tf：

トランスフェリン

TPLN：

Tf共役PLN