カーボンナノチューブとその誘導体がinvitroでの腫瘍細胞および生化学的パラメーター、invivoでの細胞血液組成に及ぼす影響

背景

カーボンナノチューブの最も印象的で有望な用途の1つは医学です。カーボンナノチューブ（CNT）は、独特の化学的および生物学的特性を特徴としています[1,2,3,4,5]。 CNTは表面積が大きいため、さまざまな生体物質を付着させることができます[6]。さらに、CNTは細胞膜や毛細血管を貫通し、細胞や組織に蓄積することができます[7、8、9]。 CNTは細胞に吸収されやすく、細胞核に到達するCNTの能力を促進し、遺伝子治療の可能性を示唆しています[10]。そのため、CNTは、タンパク質、抗原、RNA / DNAベクター[11]、ワクチン、および薬物を細胞に輸送するための魅力的な媒体です[12]。特に関心があるのは、抗癌剤[13]、抗菌剤[14]、および免疫療法[15]の制御された薬物放出を伴う個人化された担体としてのCNTの使用の見通しです。標的化された送達および制御放出は、特に細胞毒性特性を伴う、薬物の現代の使用の実際の問題である。薬物放出の正確なメカニズムは、標的組織における活性物質の効果的な濃度を保証し、他の組織における最小濃度を保証します。それは、その有効性を維持し、副作用による害を減らしながら、薬の投与量を減らすでしょう。現在、リポソーム[16]、高分子ミセルおよびデンドリマー[17]、生分解性粒子[18]、およびその他のナノ粒子[19]を使用した送達など、目的のある薬物送達にはさまざまな方法があります。しかし、最近の実験では、他のナノ粒子と比較して、薬物の送達にCNTを使用することによる多くの利点が実証されています[20、21]。それらの1つは、小分子からタンパク質、抗体、RNA / DNAに至るまで、目的の化学物質で満たすことができるかなり大きくて活性な表面を持つCNTです。 CNTの開放端は、機能化のために内部ボリュームと表面にアクセスできるようにします。したがって、CNTの大きな表面積は、さまざまなタイプの機能化のための多くの結合部位を提供します。 CNTの見通しと同時に、CNTの溶解度の低さ、凝集能力、親水性、半減期の長さ、生物全体への影響などの問題があります[22]。文献によると、実験動物の体内へのCNTの導入は、消化管、脾臓、腎臓[23]、筋肉[24]、および肺組織[25]の器官におけるCNTとその誘導体の蓄積を伴います。 。次のステップでは、CNTは代謝および炎症過程の活動[25、26]、免疫系の状態[27]、および実験動物の生存[28]に影響を与えます。それにもかかわらず、これらの問題は、カーボンナノチューブの使用をさらに進歩させるための活発な研究の対象となっています。ドラッグデリバリー用のナノベクターとしてのCNTの利点は、多くの研究で説得力を持って実証されています。 [29、30]の著者は、特定のナノチューブは薬物のナノキャリアよりも害が少ない可能性があると報告しました。単純な機能化（-OH、-COOH、-NH、PEG）[31]またはCNTのカプセル化[22]は、水溶性を高め、バイオアベイラビリティを改善し、CNTの毒性を低減することも示されています。また、腫瘍が移植されたマウスへのCNTの導入は、標的となる形質転換組織に対して効果的であり、腫瘍体積の減少と動物の生存率の向上につながる可能性があります[32]。

以前の調査[33]に基づいて、カーボンナノチューブペプチド結合の表面に活性抗腫瘍物質（ドキソルビシン）を固定化できると仮定しました。得られた化合物、ドキソルビシン（CNT-Dox）によって機能化されたカーボンナノチューブは、ドキソルビシン（Dox）としてのCNTの細胞毒性を低下させる可能性があります。同時に、処理された構築物の崩壊は、細胞毒性特性ＣＮＴおよびＤｏｘを実現することを可能にし得る。これにより、両方の物質の抗腫瘍活性を高めることが可能である。したがって、本研究の目的は、invitroでプロテアーゼ（トリプシン）の存在下でのCNTs-Doxコンストラクトの細胞毒性効果を決定することでした。 CNTとその誘導体が2Dおよび3D細胞モデルの腫瘍細胞に及ぼす影響をinvitroで分析しました。もう1つの目的は、得られた化合物（CNT、CNTox、およびCNT-Dox）が、肝酵素系の活性、タンパク質の代謝回転、およびinvivoでの細胞の血液組成に及ぼす影響を調査することでした。そのため、著者らは、消化管の腫瘍に対するCNTとその誘導体の使用の毒性、バイオアベイラビリティ、および有効性の複雑な推定を実現しました。

メソッド

白人結腸腺癌グレードII癌（HT29）の細胞株は、in vitroで2D（単層）および3D（スフェロイド）システムの実験細胞モデルとして使用されました。この株は、Kavetsky’Institute of Experimental Pathology、Oncology、and Radiobiology NASUkraineの細胞株と組織のバンクから購入しました。細胞は標準的な細胞培養条件（湿度95％、CO ₂ 5％）で処理されました。 放送中; 37°C）実験室封じ込めレベル2で10％FBSを含むDMEM完全培地で。

CNTの合成、酸化、および機能化

初期の多層カーボンナノチューブ（MWCNT）は、化学蒸着（プロピレンと、Mo / Fe / Al ₂ を含む水素）によって得られました。 O ₃ 触媒として）。合成されたMWCNTは、10〜30層、内径5〜15 nm、外径10〜60 nm、長さ20〜500 µm、比表面積120 m ² でした。 / gおよびかさ密度5〜50 g / l [33]。

金属/触媒からのMWCNTの精製は、HF処理によって実行されました。カーボンナノマテリアルからのアモルファスカーボンの除去は、450〜500°Cの空気中での酸化によって実現されました。 MWCNTを含む粗サンプルは、空気中の酸素と反応し、二酸化炭素または一酸化炭素を生成しました。触媒担体のHF（アクア）溶解が450〜500°Cの空気中で酸化された後、ある程度の炭素堆積物が得られました。この手順では、エアフロー石英管状反応器を130〜150分間使用しました。以前の研究で得られたMWCNTの物理的および化学的特性を分析して説明しました[33]。

MWCNT（JEOL SL6060LA、日本）の走査型電子顕微鏡（SEM）を使用して、MWCNTの構造特性を決定しました。リガンドを固定化した後、形態は変化しませんでした。

MWCNTの酸化

次のステップでは、精製されたカーボンナノチューブ（CNT）を70％HNO ₃ で酸化しました。 99°Cで4時間、蒸留水と10％NH ₄ で洗浄します。 12時間のOH溶液。その結果、カーボンナノマテリアル酸化物MWCNTox（CNTox）が合成されました。その後、CNTをdH ₂ で3回洗浄しました。 Oから中性pH。 CNT表面の酸性部位は、0.1 MHCl溶液で再生されました。得られた酸化されたCNTs-oxを遠心分離によって分離し、十分にすすぎ、dH ₂ に再懸濁しました。 水よ。

CNT-Dox粒子の準備

次のステップのタスクは、MWCNT粒子の表面にDox塩酸塩（Dox、Teva Nederland B.V、オランダ）を固定化することでした。酸化されたCNT（200 mg）の表面をアミノ含有Dox-ラクトース一水和物で官能化するために、二官能性結合剤であるN-シクロヘキシル-N '-（2モルホリノエチル）カルボジイミドメト-p-トルエンスルホネート（C 1011、Sigma Aldrich）とともにインキュベートしました。 、米国）室温で15分間（図1a）。その後、100mgのDOX-ラクトース一水和物を10mlの0.15Mリン酸緩衝液pH6.5に各ナノカーボン材料に添加しました。混合物を30℃で24時間反応させた。このような条件では、DoxとCNTの間に共有結合が形成されました（図1b）。 10,000 rpmで15分間遠心分離して組成物を収集し、dH ₂ で洗浄しました。 3回。分光光度計による遊離DOXの検出濃度には上清を使用した。 CNT表面へのFITSの固定化は、図2a、bに示すスキームによって提供されました。

a CNTとカルボジイミドの反応スキーム。 b ドキソルビシンによるCNTの機能化のスキーム

a CNTと尿素の反応スキーム。 b FITCによるCNTの機能化のスキーム

MWCNTの安定した懸濁液の調製

MWCNTのコロイド懸濁液は2段階で実施されました。最初の段階では、カーボンナノ材料は、超音波分散器UZDN-2 Tを使用してリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で超音波処理されました。処理モードは I でした。 =10 mA、 R =22 kHz、持続時間-30分。第二段階では、得られたヒドロゾルを室温での遠心分離によって分散させた。このプロセスには、いくつかの遠心分離サイクルが含まれます。したがって、親水性溶解SWCNT画分をこのように選択しました。浮遊培養細胞に添加する前に、MWCNTの溶液を30分間煮沸して滅菌しました。 CNTの誘導体（CNT-DoxおよびCNT-FITC）は、100倍濃度のPSGA（ペニシリン：ストレプトマイシン：ゲンタマイシン：アンホテリシン）によって滅菌されました。

ナノチューブの懸濁液のゼータ電位

サンプルのゼータ電位は、電気泳動光散乱（M3-PALS）によって測定されました。測定には、Malvern Instruments（Malvern、UK）製のZetasizer NanoZSアナライザーを使用しました。実験は25°Cで7回繰り返して実施しました。サンプルの測定には、ユニバーサル水中電極（Universal Dip Cell）ZEN1002と、光源であるポリスチレンキュベット（DTS001）（H-Ne 633 nmレーザー）を使用しました。

FTIR分光法

得られたナノ材料の化学組成をフーリエ変換赤外（FTIR）分光法で調べた。 IRスペクトルは、FTS 7000e VarianFTIR分光計によって決定されました。分析用のサンプルは、約1mgのCNTと150mgのスペクトル的に純粋なKBrの混合物をミルで粉砕することによって準備されました。サンプルは、3.0–3.5×10 ³ の圧力のプレスを使用して準備されました。 kg / cm ² 。サンプルは、600°Cの温度で60分間加熱することによって脱水されました。 KBrのショット前のスペクトルは予備的に取得され、その後、サンプルのスペクトルから差し引かれました。すべてのスペクトルは、有機化合物の分光学的同定のカタログ[34]に従って分析されました。比較のために、酸化されたMWCNT（CNT-O）、ドキソルビシンで官能化されたMWCNT（CNT-D）、および蛍光標識で官能化されたMWCNT（CNT-F）のサンプルを使用しました。サンプルと濃度のすべての処理と条件は、3つの材料で同じでした。

CNT表面からのドキソルビシン放出の比色分析

CNMに固定化した後の遊離Doxの量と、Dox放出の有効性を評価するために、495nmの波長で蛍光を発する遊離Doxの能力を使用しました[35]。 Dox塩酸塩中のDoxの活性濃度は16.7％ w でした / w 。キャリブレーションラインを描画するために、Dox Teva 20 mg / mlを8×10 ^-3 に10倍に希釈します。 mg / mlを使用しました。次に、分光光度プレートリーダーMultiscan（Labsystem、フィンランド）を使用して、CNTとの複合体DOXの上清で遊離Doxの蛍光を測定しました。

CNT-DOX、CNT-FITC粒子の官能基濃度

Dox固定化の場合、1 ml dH ₂ に1gのMWCNTを入れます。 Oを使用しました。 Dox-TEVAの量は、1 ml dH ₂ に100mg（16.7 mgのアクティブDox）でした。 O.反応後の上清中の遊離Doxの量は、0.37 mg、つまり有効成分から2.2％でした。したがって、16.23mgのDOXが1gのCNToxに固定化されているという結論に達しました。 FITCの場合、固定化の割合は低かった。次に、8.35mgのFITCを1mlのdH ₂ 中の1gのCNToxに固定化しました。 O.機能化の有効性は1.62％ w でした / w CNT-DOXおよび0.84％ w の場合 / w CNT-FITC用。 CNT-DoxおよびCNT-FITCの濃度のさらなる計算は、これらのデータに基づいています。

2Dおよび3D細胞モデルでのCNT誘導体の細胞毒性アッセイ

Dox、CNT、CNT-FITC、およびCNT-Doxの細胞毒性は、MTTアッセイを使用してHT29腫瘍細胞に対して評価されました。生細胞におけるNAD（P）H依存性ミトコンドリアオキシドレダクターゼ酵素による3- [4,5-ジメチルチアゾール-2] -2,5-ジフェニルテトラテトラゾリウム塩のホルマザン結晶への変換に基づくMTTテスト。プロトコルはT.Mosmann [36]によって説明されました。簡単に言うと、1×10 ⁴ HT29を96ウェルプレートに播種し、完全培地で12時間培養しました。次に、現在の培地を、CNTox（サンプル＃1）、MWCNT（サンプル＃2）、CNT-Dox（サンプル＃3）、Dox（サンプル＃4）、およびCNT-FITC（サンプル＃5）を含む培地に交換しました。 。サンプル＃1、2、3、5の濃度は12.5–25–50–100–200μg / ml、サンプル＃4のストック濃度は20μg/ ml、最終濃度は1〜10μg / mlでした。細胞を完全培地で培養し、対照として使用した。 24時間のインキュベーション後、比色分析により細胞をMTTで分析しました。 100μlの細胞懸濁液に、20μlのMTT溶液（5 mg / ml PBS、Sigma）を追加しました。その後、細胞をMTTとともに標準状態で4時間インキュベートしました。次に、サンプルを1500 gで5分間遠心分離し、上清を抽出しました。全部で、ウェルに10μlのDMSO（Sigma）を加えてMTT結晶を希釈し、20μlの25mMグリシンを加えました。反応した溶液の吸光度を、分光光度プレートリーダーMultiscan（Labsystem、フィンランド）で540nmで測定しました。

多細胞腫瘍スフェロイドの生成

腫瘍微小転移のモデルシステムとしてのHT29細胞多細胞腫瘍スフェロイド（MTS）（3D培養）は、以前に記載された確立された方法によって培養された[33]。簡単に説明すると、トリパンブルーを使用して細胞懸濁液をカウントし、同数の細胞を植えました（5×10 ⁴ 細胞/ ml）。 3D細胞培養は、標準条件（95％湿度、5％CO ₂ ）で10％FBS（Sigma、USA）を含むDMEM（Sigma、USA）培地で維持されました。 空気中、37°C​​）。 MTSの生成は、私たちの研究室で開発された技術によって実行されました。腫瘍細胞の培養は、0.24％のカルボキシメチルセルロースを含む培地中の1％寒天でコーティングされた24ウェルプレートで24時間維持されました。 MTSのサイズと数のCNTの濃度とタイプへの依存性を調査するために、MTSはさまざまな濃度のCNTの存在下で生成されました。細胞培養物へのMTS生成の前に、PBS中のCNTs溶液を、MTTアッセイについて前述したように最終濃度まで培養物に添加しました。オービタルシェーカー（80 rpm）でプレートを一定に回転させながら、48時間の間にさらに培養を行いました。次の段階では、マイクロ写真画像を「暗視野」法で撮影しました。全体として、120以上の画像が作成されました。次に、ファイルにあるすべてのMTSのボリュームを、Axio Vision Rel4.7プログラムZeissを使用して計算しました。 Rolf Bjerkvigの式を使用しました： V =0.4∙ a ∙ b ² 、回転楕円体の幾何学的サイズ（ b < a ）[37]。結果の視覚化は、Stemy 2000C顕微鏡、Zeissで実行されました。

CNTが肝酵素系、タンパク質代謝回転、および生体内の細胞血液組成に及ぼす影響の分析

動物とその世話に関する手順は、地域の動物実験倫理委員会によって承認された欧州指令2010/63 EUに準拠していました（プロトコル№121.10.2016）。得られた物質が生物の恒常性の一般的な状態に及ぼす影響を分析するために、invivoで一連の実験を行った。 Balb / 2a系統のinvivo研究マウスを使用した。オスとメスのマウスは、6〜8週齢のグループで同等であり、各グループで10匹でした。マウスは、鋼線の上部とトウモロコシの穂軸の寝具を備えたケージに収容され、12/12の暗/明サイクル、22°C±3°Cの温度、50〜70％の湿度の制御された雰囲気に維持され、自由にアクセスできます。食物と淡水に。したがって、マウスの4つのグループが形成されました。グループ1：無傷の動物を200μlのPBS、コントロールで処理しました。グループ2：マウスを1.5 mg / kgの用量のCNToxで治療しました。グループ3：マウスを1.5 mg / kgの用量のCNT-DOXで治療しました。また、グループ4では、マウスにドキソルビシンを20 mg / kgの用量で投与しました。マウスは、4週間の間、3日ごとに200μlのPBSでCNT非経口投与を受けました。ドキソルビシンは、3日に1回、20 mg / kg体重の濃度で腹腔内投与されました。

血清生化学的分析

一ヶ月後、マウスは実験から撤退した。心臓の血液サンプルは、死んだ動物からすぐに収集されました。午前10時から11時まで同時に動物から採血しました。血漿の場合、血液を37°Cで40分間インキュベートした後、遠心分離しました（20分、2000 rpm）。次に、生化学的パラメーター、総タンパク質、アルブミン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アルカリホスファターゼ（ALP）を、診断キット（Cormay、ワルシャワ、ポーランド）を使用して血漿中で測定しました。実験は、半自動生化学分析装置FP-901M（Labsystems、フィンランド）で統一された実験プロトコルによって実施されました。細胞の血液組成は、血液分析装置Mindray BC-3000 Plus、中国で測定されました。

統計分析

3D培養の統計分析では、すべての細胞凝集体を1×10 ^-4 のサイズに従ってグループに分類しました。 mm ³ 〜1×10 ⁻² mm ³ ステップイン1×10 ⁻³ mm ³ 。次に、各グループのMTSの数と、各グループのMTSボリュームの中央値を推定しました。すべての測定を3回繰り返しました。正規分布の確率変数のマイクロ統計アッセイでは、人口が少ない場合は学生の係数を使用しました。示された p 値は* рでした ≤0.05または** р ≤0.01。

結果と考察

MWCNTの走査型電子顕微鏡

プロトコル[38]によると、CNTの平均直径は10〜20 nmであり、アルゴン脱着によって決定された比表面積は200〜400 m ² でした。 / g。 20〜40 g / dm ³ 以内のかさ密度 。特に、20〜500μmの寸法の絡み合ったチューブの形の凝集体は、CVD法を適用した工業用CNT製造中に得られます（図3）。

CNTのSEM画像、1）スケール0.5μm; 2）スケール5μm

ナノチューブの懸濁液のゼータ電位

CNToxとCNTは、ゼータ電位の値に直接依存する凝集に対する有意な安定性を示しています。 CNT-DOXは、CNToxやCNTよりもゼータ電位が小さく、測定の再現性が高く、粒子の均一性を示しています（表1）。 CNT-FITCのゼータ電位の値が小さい場合は、測定時のノイズ比が高いことからわかるように、粒子サイズが大きいか、濃度が低いことを示している可能性があります。

CNT、CNT-Dox、およびCNT-FITCのFTIR分光法

図4に示すように、CNToxとドキソルビシン（DOX）およびフルオレセイン（FITC）の間の結合は、赤外線スペクトルデータに基づいて推定されました。

CNTox（CNT-O）、CNT-DOX（CNT-D）、CNT-FITC（CNT-F）の赤外線スペクトル

υ=3311 cm ^-1 に強いバンドが存在する （CNT-O）およびυ=3451cm ^-1 （CNT-D）CON-H結合の変動、およびυ=1634 cm ^-1 での強いバンドの存在に起因します （CNT-O）およびυ=1631cm ^-1 （CNT-D）O-CNH結合振動に起因し、CNTとDox間のアミド結合のタイプを明確に示します。また、IRは、2969〜2834 cm ^-1 にあるC-H結合の吸収を示しました。 1460〜1407 cm ^-1 の広帯域 C-O-Hフラグメントから。したがって、化学反応の結果、CNTは抗腫瘍薬（ドキソルビシン）と蛍光標識（FITC）で機能化されたと結論付けることができます。

単層およびスフェロイド細胞増殖モデルでの機能化のさまざまな段階でのCNTの細胞毒性

次のステップは、酸化されたCNT（CNTox）、ドキソルビシンで機能化されたCNT（CNT-Dox）、および蛍光標識（CNT-FITC）の細胞毒性を決定することでした。 HT29の単層培養でのMTTテストの結果を図5に示します。

CNTおよびその誘導体（CNT-DoxおよびCNT-FITC）との48時間のインキュベーション後の、単層培養における腫瘍細胞HT29の生存率。統計的有意性：* р ≤0.05または** р ≤0.01

その結果、CNTox、CNT-Dox、およびCNT-FITCは、12.5μg/ ml（81％）の濃度で中程度の細胞毒性効果があることが実証されました。 CNTox濃度を25から50および100μg/ mlに増加させると、用量依存的に腫瘍細胞の生存率が対照と比較して71.8〜69.6〜62.5％に減少しました。 200μg/ mlまでのCNToxの濃度では、HT29の生存率は39.2％に低下しました。当時、低濃度（12.5〜50μg / ml）のCNT-Doxは、CNToxと比較して統計的に有意な細胞毒性を示しませんでした。高濃度（200μg/ ml）では、CTN-Doxの細胞毒性はCNTox（50％）よりもさらに低くなりました。同時に、フルオレセインで機能化されたCNTは、腫瘍細胞に対して比較的高い細胞毒性効果を示しました。 25μg/ mlの濃度でCNT-FITCとインキュベートした後、HT29細胞の生存率は55％に減少し、100〜200μg / mlではそれぞれ23％と7％に減少しました。したがって、その場合、CNTはかなり不活性な細胞基質の役割を果たしました。それ以上に、CNTはDoxを固定化し、Doxの細胞毒性を低下させました。以前の研究[33]で、一次ナノチューブは疎水性であり、細胞毒性効果を緩和し、多数の細胞凝集体の形成を刺激することを実証しました。文献[39]によると、CNTの表面電荷は酸化中に変化します。 CNTはより親水性になり、より小さな凝集体の形成につながり、CNTの細胞毒性効果を高めます。以前の研究で受け取ったデータは、この傾向を裏付けています。 CNToxは、コントロールと比較して腫瘍細胞の生存率を少なくとも60％低下させ、CNT-Doxは45％、CNT-FITCは97％（200μg/ ml）で減少しました。得られたデータの説明は、機能性リガンドが、ほとんどの場合、CNTの表面ゼータ電位を変化させ、CNTの溶解度を刺激し、CNTの細胞浸透を増加させるという他の著者の報告にあるかもしれません[40]。酸化および機能化後に凝集体を形成するCNTの能力は低下しますが、細胞膜の透過性は増加し、細胞小器官の反応性は増加します。それ以上に、高濃度のCNT-Doxは、CNToxよりも細胞毒性効果が低くなります。同時に、得られたデータによれば、ペプチド結合はドキソルビシンをCNTの表面に保持していると推測することができます。 CNTとDoxの間のペプチド結合は、細胞培養条件で十分に安定しています。それは分解せず、ドキソルビシンを不活性な形で摂取します。同時に、フルオレセイン-ナトリウム分子（C ₂₀ H ₁₂ O ₅ ）、サイズが332.311 g / molのリガンドは、CNTの表面から非常に簡単に解離し、細胞に入ります。その結果、DNA構造、核、ミトコンドリアの不可逆的な違反があります[41]。

CNTとその誘導体の細胞毒性と腫瘍細胞の接着特性への影響を検証するために、HT29細胞の2Dコロニーの面積を分析しました。結果を図6に示します。CNTとその誘導体は、単層培養における腫瘍細胞の接着能力と腫瘍細胞コロニーの形成に影響を与えることが実証されました。腫瘍細胞を12.5、50.0、および200μg/ mlの濃度のCNTox（サンプル＃1）とインキュベートすると、対照と比較して、2D細胞コロニーが55.2％、57.8％、および78.3％で用量依存的に減少しました。同時に、同じ濃度のCNT-Doxのサンプル（サンプル＃3）はそのような影響を引き起こしませんでした。 2Dコロニーの面積は、それぞれ34.8％、61.6％、82.4％減少しました。 CNT-FITC（サンプル＃5）は、単層培養で腫瘍細胞に最大の影響を及ぼしました。 CNT-FITCとのインキュベーション後の2Dコロニーの面積は、それぞれ59.8％、85.2％、および89.8％に減少しました。得られた結果はMTTアッセイと同じ傾向があることに注意する必要があります。しかし、MTT分析の結果はそのような有意な細胞毒性効果を示さなかった。結果として生じる不一致は、細胞コロニーに対するCNTの非細胞毒性効果、および部分的には抗接着性の影響の結果である可能性があります。以前に、CNTは抗癒着よりも細胞毒性が低いことを示しました。私たちのデータによると、CNTは腫瘍細胞の懸濁液画分への移動と多細胞腫瘍スフェロイド（MTS）の形成を刺激します。単層培養とスフェロイド培養における抗腫瘍剤に対する細胞の感受性は異なります。そのため、次のステップでは、CNTox、CNT-Dox、およびCNT-FITCの存在下で腫瘍細胞HT29によるMTSの形成を調査しました。 CNTの濃度は以前の実験と同じでした。図7では、CNTox（サンプル＃1）がMTSの形成を刺激できることが実証されました。 CNTox濃度の増加は、MTSの体積中央値の用量依存的な増加を伴います。 CNToxの濃度が12.5、50、200μg / mlの場合、MTSの体積の中央値は1.79から2.18および10.98 mm ³ に増加します。;ほぼ10倍です。 CNTの誘導体は、腫瘍細胞にそのような影響を与えません。 CNT-Dox（サンプル＃3）は、2.83倍でMTSの形成を刺激します。同時に、3D腫瘍細胞培養をCNT-FITC（サンプル＃5）とインキュベートすると、MTSの量が2.4分の1に減少します。

CNTox（＃1）、CNT-Dox（＃3）、CNT-FITC（＃5）とインキュベートした単層培養におけるHT29腫瘍細胞のコロニーの面積。統計的有意性：* р ≤0.05または** р ≤0.01

多細胞腫瘍スフェロイド体積の中央値。 MTSは、CNTox（サンプル＃1）、CNT-Dox（サンプル＃3）、CNT-FITC（サンプル＃5）の存在下で生成されました。統計的有意性：* р ≤0.05または** р ≤0.01

ほとんどの実験で、CNT-Doxは、2Dおよび3D培養の両方で、腫瘍細胞に対してそのような細胞毒性効果を持たないことは注目に値します。これは、単一のドキソルビシンの効果と比較できます。ドキソルビシンの細胞毒性作用のメカニズムは、細胞核への浸透とヌクレオチドペア間のインターカレーション、複製とDNA修復の違反、タンパク質合成、そして結果として細胞死に基づいています。 ＣＮＴ－Ｄｏｘの細胞毒性効果の低下の原因は、ペプチド結合を介したドキソルビシンのＣＮＴ表面との結合である可能性がある。 CNT表面からのDoxの解離、および細胞や細胞小器官へのDoxの浸透を防ぎます。この事実により、「非標的」オブジェクトに悪影響を与えることなく、特定の組織に化合物を送達できる可能性があります。

この場合、研究の次のステップはドキソルビシンの制御放出でした。ペプチド結合の切断には、一般的に知られているペプチダーゼトリプシンを離型剤として使用しました。 ＣＮＴの表面からのＤｏｘ放出に対するトリプシンの効果を、スペクトル分析によって調査した。遊離ドキソルビシンは495nmに蛍光ピークがあるため、結合ドキソルビシンにはそのような能力はありません。トリプシン濃度の増加が遊離ドキソルビシンの濃度にどのように影響するかを分析した。結果は以前の研究[42]に示されています。間もなく、培地中の0.05％トリプシンの濃度を11％から20％に増やすと、遊離ドキソルビシンの濃度が3.13から6.55μg/ mlに増えることが実証されました。トリプシンの濃度をさらに60％に増やしても、遊離ドキソルビシンは増えませんでした。ただし、トリプシンの濃度が約66％になると、放出が再び刺激され、ドキソルビシンの濃度が2倍の11.38μg/ mlに増加しました。したがって、0.05％トリプシンにはいくつかの有効濃度があると結論付けられました。これらの条件下で、ドキソルビシンとCNTの間のペプチド結合が切断され、ドキソルビシンが放出されました。したがって、CNT-DoxがDox放出後に腫瘍細胞にどのように影響するかを分析するために、トリプシンを含むウシ胎児血清（FBS）栄養培地を含まないCNT-Doxの存在下で腫瘍細胞をインキュベートしました。腫瘍細胞の生存は、MTTテストを使用して決定されました。栄養培地、トリプシン、CNT-Doxの濃度、およびドキソルビシンの比率を表2に示します。48時間のHT29のインキュベーションの結果は、図8に示されています。トリプシンの存在下での細胞生存率-青いカラムのみドキソルビシン-オレンジ色のカラム、およびCNT-トリプシンを含むDox-ピンク色のカラム。その結果、トリプシンとCNT-Doxを同時に使用すると、これらの物質を別々に使用した場合と比較して、CNTとドキソルビシンの細胞毒性効果が大幅に増加することがわかりました。したがって、0.05〜1.0μg / mlの濃度のドキソルビシン単独では、用量依存的に、対照と比較して生きているHT29細胞の割合が7.18〜45.7％に減少します（図8、オレンジ色の列）。 20.0〜1.25μg / mlの濃度のCNT-Doxを0〜0〜70％の濃度のトリプシンとインキュベートすると、生細胞の割合がそれぞれ80.9％と99.8％から用量依存的に減少しました（図8、ピンク色の列） 。同時に、トリプシン単独でのインキュベーションでは、生細胞の割合が34.0〜42.0％しか減少しません（図8、青い列）。したがって、CNT-DOXとトリプシンの相乗効果が観察されたと結論付けることができます。個々の成分は細胞に対して小さな細胞毒性効果を持ち、一緒になって物質の細胞毒性の可能性は数倍になります。

トリプシン、ドキソルビシン、CNT-Doxの存在下で48時間培養した後の生細胞HT29の割合。統計的有意性：* р ≤0.05または** р ≤0.01

官能基（Dox）はペプチド結合によってCNT表面に結合しているため、in vivoでのDox放出は、プロテアーゼやペプチダーゼの含有量が増加した消化管の臓器で実現されます。生物では、プロテアーゼはさまざまな代謝プロセスに使用されます。胃に分泌される酸性プロテアーゼ（ペプシンなど）と十二指腸に存在するセリンプロテアーゼ（トリプシンとキモトリプシン）により、食品中のタンパク質を消化することができます[43]。他のプロテアーゼ（エラスターゼ、カテプシンG）は白血球に存在し、代謝制御においていくつかの異なる役割を果たします。これは、生物の生理学における最も速い「スイッチオン」および「スイッチオフ」の調節メカニズムの1つです。複雑な協調作用により、プロテアーゼはカスケード反応として進行する可能性があり、その結果、生理学的信号に対する生物の応答が迅速かつ効率的に増幅されます。したがって、著者らは、CNT-Dox構築は、胃、膵臓、肝臓、および薬物の非経口投与の場合の小腸癌の局在化の場合に最も効果的であると示唆しています。

CNTとその誘導体が細胞の血液組成、肝酵素系、およびタンパク質の代謝回転に及ぼす影響

タンパク質代謝および肝酵素系の状態に対するCNToxおよびCNT-Doxの影響を決定するために、アルブミン（Al）、総タンパク質（Tp）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）のレベル、アルカリホスファターゼ（ALP）を測定しました。データを図9a、bに示します。その結果、CNT-DoxとDoxが肝酵素活性、すなわちASTとALPに影響を与えることが注目されました。 ASTレベルは、コントロールと比較して、1グループで21.6％、2グループで93.9％、3グループで126.4％のマウス血清で増加しました。同時に、ALPの活性は、マウス血清において、1群で23.5％、2群で119.1％、3群で147.8％増加しました。 CNTox投与では、AST、ALT、およびALPレベルに統計的に有意な変化は見られませんでした。さらに、CNTox、ドキソルビシン、およびCNT-Doxは、実験動物の血中の総タンパク質レベルをわずかに増加させたことに注意する必要があります。したがって、CNToxの体系的な導入はマウスの血清酵素プロファイルに影響を与えないことがわかりました。反対に、CNT-DoxとDoxの投与は毒性の影響を及ぼし、慢性的な肝障害を引き起こしました。特に、肝炎の症状は、CNT-DoxよりもDox治療後に多くの症状を示しました。血液細胞組成の状態に対するCNTox、CNT-Doxの考えられる炎症過程および全身的影響を決定するために、実験動物の血球処方を分析した。結果を表3に示します。得られたデータは、貧血（赤血球数の減少、ヘモグロビン、ヘマトクリット値）、血小板減少症（血小板数の減少）、好中球減少症（血小板数の減少）など、ドキソルビシンの血液毒性のよく知られた症状とよく一致しています。血小板）。興味深いことに、1（CNTox）、2（CNT-Dox）、および3（Dox）の動物グループで、実質的にすべての血液学的パラメーターの変化の方向が同じであることが実証されました。ただし、2群と3群の動物の変化は、対照群と1群に応じて統計的に有意でした。 2つのグループ（CNT-Dox）では、食細胞単核細胞のシステムと細胞の免疫応答に関連する単球含有量の顕著な減少が見られました（9.5％および0.12×10 ⁹ コントロールで/l、4.6％および0.06×10 ⁹ 2グループで/l、4.55および0.05×10 ⁹ / l 3グループ）。 2群と3群の動物は、顆粒球（好中球）の含有量の減少を示しました（12.6および0.16×10 ⁹ コントロールで/l、8.5％および0.2×10 ⁹ / l2グループおよび8.05および0.16×10 ⁹ / l 3グループ）。リンパ球の数は、パーセンテージと絶対値の両方で、2つと3つのグループで増加しました（77.9％と0.97×10 ⁹ コントロールで/l、86.9％および2.0×10 ⁹ 2群で/l、87.8％および2.3×10 ⁹ / l 3グループ）。リンパ球の主な機能は、抗原の認識と体の適切な免疫応答への関与です。 Tリンパ球は調節機能とエフェクター機能を果たします。 Bリンパ球は体液性免疫に関与し、他の人の抗原の刺激に反応して免疫グロブリンを提供します。したがって、実験1、2、および3グループでのリンパ球含有量の指標の増加は、外来抗体（CNT）の導入および/または組織の注意散漫に関連している可能性があると考えられます[44]。 2つの白血球の絶対数がいくらか減少します（1.2×10 ⁹ / l）および3（0.85×10 ⁹ / l）動物の1つのグループと比較したグループ（2.0×10 ⁹ / l）は、Doxの毒性作用の逆転が徐々に蓄積された結果と見なすことができます。実験動物群におけるWBCの反応、および白血球減少症の発症におけるドキソルビシンによるよく知られた毒性の血液学的影響について説明されています。 RBC（赤血球とヘモグロビン）の数と状態を反映する指標の分析でも、2群と3群の動物で同じ不均衡の傾向が示されました。統計的に有意な血小板減少症と貧血は、2群と3群の動物でより多く示されます：赤血球の数（5.54×10 ¹² / lコントロール、3.97×10 ¹² 2グループで/l、3.12×10 ¹² / l 3グループ）、ヘモグロビンの量（無傷の動物で78 g / dl、2グループで55.5 g / dl、3グループで46.2 g / dl）、ヘモグロビン（無傷の動物で25.25％、2グループで16.75％）グループおよび3グループの15.12％）。赤血球の量は減少しましたが、1つの赤血球のヘモグロビンの平均含有量は減少しませんでした。そして、その結果、1赤血球あたりのヘモグロビン濃度が上昇しました。 RBWカウントの分析により、2および3グループの動物には、骨髄での赤血球の形成の減少、赤血球破壊の加速、赤血球の膜の構造の違反など、いくつかのプロセスがあることが示唆されます。ヘモグロビンの分子欠陥（酸化）。血小板減少症（27×10 ⁹ 無傷の動物では/l、14.0×10 ⁹ 2グループで/l、12.05×10 ⁹ / l in 3 group）、用量依存性の可逆的骨髄抑制、白血球減少症および顆粒球減少症（好中球減少症）は、ドキソルビシンの血液毒性の主な症状であり、この薬剤の最も一般的な急性用量制限毒性です。 CNToxとCNT-Doxで処理された実験動物の血中血小板含有量の変化の方向は同じです。ただし、無料のDoxを投与されている動物のグループでは著しく顕著です。

Balb / 2aマウスにおけるCNTox（1グループ）、CNT-DOX（2グループ）、遊離DOX（3グループ）投与後の臨床パラメーターのモニタリング。マウスは、4週間にわたって3日ごとにCNTox、CNT-DOX、DOXによって、CNT-1.5 g / kgおよびDox-20mg / kg体重の濃度で治療されました。各実験は3回行った。統計的有意性：* р ≤0.05または** р ≤0.01。 ALT アラニントランスフェラーゼ、 AST アスパラギン酸トランスフェラーゼ、 AP アルカリホスファターゼ

したがって、インビボ実験からの我々の結果によれば、ＣＮＴｏｘの体系的な導入は、マウスの血清酵素プロファイルおよびタンパク質代謝回転に影響を及ぼさないことが実証された。反対に、CNT-DoxとDoxの投与は毒性の影響を及ぼし、慢性的な肝障害を引き起こしました。それ以上に、用量依存的な可逆的骨髄抑制、白血球減少症、および顆粒球減少症（好中球減少症）が、遊離のDoxを投与された動物のグループで示された。血液毒性のこの主な症状は、遊離のCNT-DoxおよびCNTを投与された動物のグループではそれほど顕著ではありませんでした。したがって、胃液ペプチダーゼの作用下でのCNT-Doxの非経口投与の場合、CNT-Dox粒子は遊離のCNTとドキソルビシンに分解すると推測できます。その後、ドキソルビシンは胃の細胞に入り、部分的に血流に入ります。それはまた、血球組成に特定の影響を及ぼします。インビボでのDox放出をモデル化するために、トリプシンをインビトロで使用した。

この調査の目的の1つは、カーボンビークルの体への副作用を最小限に抑えることでした。以前、著者らは、CNTが細胞移動を刺激し、浮遊画分で細胞をサポートする能力があるため、腫瘍の発生に対する潜在的な脅威である可能性があることを示しました[33]。この場合、CNT自体が人工の細胞外マトリックスの役割を果たします。 CNTが浮遊細胞を刺激して凝集させる別の方法。このプロセスがCNT表面への抗腫瘍薬の蓄積と一致する場合、CNTは基質非依存性細胞を引き付けてそれらを殺します。同時に、純粋なCNTは腫瘍細胞に対して統計的に有意な細胞毒性を持たないことがわかりました。したがって、CNTだけでは細胞毒性剤として危険ではなく、細胞を標的とする抗腫瘍薬の担体として機能することができます。次に、抗腫瘍抗体によるCNTの機能化に関する研究が行われました。 CNTは、Doxだけでなく、特定の腫瘍抗体である抗EGFrも表面に運ぶことができることが実証されました[42]。トリプシンの作用下で、Doxが放出され、腫瘍細胞に対する強力な細胞毒性効果を実現しました。最近の研究では、トリプシンの存在下でCNT-Doxコンストラクトから放出された後のCNTとドキソルビシンの相乗的な細胞毒性効果が示されています。このような効果は、CNTとDoxで別々に実証されませんでした。したがって、CNTを使用することの利点は、抗腫瘍抗体および薬物の媒体としてのCNTの使用にあるように思われます。一方、ドキソルビシンの悪影響は、他の多くの初期の抗腫瘍薬と同様に、完全に細胞毒性の影響です。 DoxがCNTに結合すると、部分的にブロックされます。この効果により、腫瘍活動に焦点を合わせたDoxの局所的な蓄積と、その後の放出および作用を確実にすることができます。したがって、より少ない投与量でより大きな有効性を達成することができる。この効果は、CNTの表面に腫瘍特異的抗体がある場合にのみ達成できます。そのような構成を作成する可能性は、以前の研究で著者によって実証されました。間違いなく、CNTの普及、蓄積、およびDoxの有効性は、invitroでの混合培養およびinvivoでの腫瘍モデルでテストする必要があります。この目的のために、合成されたCNT-FITCが作成され、実施されました。細胞外マトリックスとして機能するCNTの能力と、「腫瘍体」システムに対するこのプロセスの重要性は、動物モデルでテストする必要があります。この薬の有効性は、エーリッヒ癌と結腸直腸癌のモデルで調査されます[44]。この研究で述べたように、体の組織におけるCNTの分布は、CST-FITCによって作成された構造を使用して調査されます。胃腸系の器官、すなわち胃、肝臓、および腸の組織におけるCNTの蓄積は、組織学的アッセイによって分析されます。これらの研究はすでに著者によって実施されています。

Shang-Lin Wang [4]と私たちのデータによると、遊離ドキソルビシンは同様の副作用を引き起こしますが、CNT-Doxよりも顕著です。他の著者は、CNTの毒性効果は投与方法、用量、曝露時間に依存し、細胞のサイズと種類によって異なると報告しました[45,46,47,48,49]。長期暴露による肝臓、腎臓、胃の組織へのCNTの定着は、酸化ストレス、DNA損傷、細胞増殖の低下、組織の壊死、慢性炎症を引き起こす可能性があります[50]。 Manna [51]によると、CNTは酸化ストレスを引き起こし、細胞増殖を損なう可能性があります。インビトロ研究の場合、CNTの細胞毒性は、CNTの精製、機能化、サイズ、および表面電荷の程度に大きく依存します[52、53、54、55]。我々の結果と以前のデータによると、得られたCNTは有意な細胞毒性効果を示さなかった[33]。それ以上に、私たちのデータは、invitroで発生するCNTとDOXの複合細胞毒性効果があることを示唆しています。そのため、腫瘍組織にCNT / CNT-Doxが標的に蓄積した場合、得られたCNTを腫瘍細胞に対して使用できると仮定しました。ただし、CNTの細胞毒性効果のメカニズムは完全には明らかではありません。一部の著者は、CNT粒子が用量に応じてNF-κB経路を活性化し、活性化のメカニズムがストレス関連キナーゼの活性化によるものであると示唆しました[51]。他の著者は、CNTは、さまざまな癌細胞株および手術標本から得られた腫瘍細胞[56]、細胞膜の脂肪酸を修飾できるCNT [57]、または赤血球膜の損傷[58]において、invitroで直接アポトーシス促進効果があると報告しました。細胞や組織へのCNTの蓄積をさらに調査するために、CNT-FITCコンポジットを使用する予定です。

その他の不明確な質問は次のとおりです。生物レベルでのCNT / CNT-Doxの長期的な影響と、腫瘍組織でのCNT / CNT-Doxの蓄積をどのように刺激するか。 CNT / CNT-Doxの慢性的な導入の影響を調査するために、さまざまな局在の移植または開始された腫瘍のモデルに関する長年の研究が実現されます。他の著者は、肺への曝露後のマウスの体全体にわたるナノチューブの分布を分析しました[59]。その結果、MWCNTの蓄積は、特に脾臓の白脾髄や骨髄など、いくつかの臓器で記録されました。 CNTは通常、目的を果たした後、肝臓、脾臓、または肺に沈着し、そこから腎排泄経路を介して徐々に体外に排出されます[60]。 ZhaoとLiuは、体内にCNTが蓄積すると、肉芽腫性炎症または肺胞中隔肥厚を引き起こす可能性があると報告しました。 Zhuang Liu etal。 SWNT-PTXは、マウス4T1乳がんモデルにおいて、臨床タキソール®よりも腫瘍増殖の抑制に高い有効性をもたらすと報告されています。 ]。腫瘍細胞によって過剰発現される特異的抗体をCNT表面に配置することにより、標的組織へのCNTの蓄積を促進することができます。ナノ構造調製物の標的化送達に抗体を使用する可能性は、多くの著者によって説明されています[62、63]。

結論

2D培養では、CNTox濃度が25から50および100μg/ mlになると、用量依存的に腫瘍細胞の生存率が対照と比較して71.8〜69.6〜62.5％に減少しました。 200μg/ mlまでのCNToxの濃度では、HT29の生存率は39.2％に低下しました。当時、12.5〜25〜50μg / mlの濃度のCNT-Doxは、CNToxと比較して統計的に有意な細胞毒性を示しませんでした。高濃度（200μg/ ml）では、CTN-Doxの細胞毒性はCNTox（50％）よりもさらに低くなりました。 25μg/ mlの濃度でCNT-FITCとインキュベートした後、HT29細胞の生存率は55％に減少し、100〜200μg / mlではそれぞれ23％と7％に減少しました。 3D培養では、CNTox濃度の増加は、MTSの体積中央値の用量依存的な増加を伴います。 CNToxの濃度が12.5、50、200μg / mlの場合、MTSの体積の中央値は1.79から2.18および10.98 mm ³ に増加します。 。 CNTs-DoxおよびCNT-FITCは腫瘍細胞にそのような影響を与えませんでした。 0.05〜1.0μg / mlの濃度のドキソルビシン単独では、対照と比較して、生きているHT29細胞の割合が用量依存的に7.18〜45.7％減少します。 20.0〜1.25μg / mlの濃度のCNT-Doxを0〜70％の濃度のトリプシンとインキュベートすると、用量依存的に生細胞の割合がそれぞれ80.9％と99.8％に減少しました。同時に、トリプシン単独でのインキュベーションでは、生細胞の割合が34.0〜42.0％しか減少しません。そのため、CNT-DOXとトリプシンの相乗効果が観察されました。個々の成分は細胞に対して小さな細胞毒性効果を持ち、物質の細胞毒性の可能性は一緒に数倍に増加します。インビボでは、CNToxの体系的な導入はマウスの血清酵素プロファイルに影響を与えません。反対に、CNT-DoxおよびDoxの投与は毒性の影響を及ぼし、慢性肝障害、血小板減少症、用量依存的な可逆的骨髄抑制、白血球減少症、および顆粒球減少症（好中球減少症）を誘発しました。特に、肝炎の症状は、CNT-DoxよりもDox治療後に多くの症状を示しました。

したがって、CNTを使用した高毒性薬物の標的化送達と制御放出の可能性は、CNTの毒性を低減し、「適切な場所で適切なタイミングで」CNTと抗腫瘍薬の可能性を実現する戦略に依存します。著者と文献によって得られたデータによると、それは可能です。私たちのデータは、このアプローチにより、血液の一般的な生化学的指標に対するドキソルビシンの毒性と血球組成の違反を減らすことができるという仮定を支持しています。同時に、ドキソルビシンの放出は特定の条件下で実現されます。また、CNTとドキソルビシンの複合効果により、invitroでの腫瘍細胞の増殖を抑制する効果が高まります。

略語

Al：

アルブミン

ALP：

アルカリホスファターゼ

ALT：

アラニンアミノトランスフェラーゼ

AST：

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ

CNT-Dox：

ドキソルビシンで官能化されたカーボンナノチューブ

CNT-FITC：

フルオレセインで官能化されたカーボンナノチューブ

CNTox：

酸化されたカーボンナノチューブ

CNT：

カーボンナノチューブ

Dox：

ドキソルビシン

FTIR：

フーリエ変換赤外分光法

MTS：

多細胞腫瘍スフェロイド

MWCNT：

多層カーボンナノチューブ

PTX：

パクリタキセル

Tp：

総タンパク質