Pd官能化カーボンナノコンポジットによって強化されたマトリックスメタロプロテイナーゼ-7のアンペロメトリーバイオセンサー

背景

細胞外マトリックスの組成を分解することができる酵素であるマトリックスメタロプロテイナーゼ-7（MMP-7）[1]は、腫瘍の進行と転移におけるその極めて重要な役割で強調されています[2、3]。血清サンプル中のMMP-7の含有量は、唾液腺がん[4]、結腸腺がん[5]、高悪性度腎細胞がん[6]などの一部のがん患者のリンパ節転移に関連しています。生理学的プロセスにおけるそのさまざまな役割のために、MMP-7の高感度で正確な検出は集中的な研究の注目を集め[7]、測色[8]、エレクトロケミルミネッセンス（ECL）[9]および蛍光を含むいくつかのアプローチの開発につながりました。共鳴エネルギー移動（FRET）分析[10]。それにもかかわらず、これらのアプローチの検出限界（LOD）は通常、ピコグラムの範囲内であり、したがって、十分に低くはありません。これらの方法と比較して、電気化学バイオセンサーは、フェムトグラムレベルでより低いLODではるかに高度なMMP-7検出能力を提供します[11]。さらに、いくつかの分析方法は、低コストで小型化されているため、電気化学アッセイを使用したMMP-7の超高感度電気化学検出の緊急要件を満たすように構築されています[12]。

多くの電気化学的プロトコルでは、酵素生体触媒反応が信号増幅に適用可能であり、アンペロメトリーバイオセンサーの性能を促進します[13、14]。しかし、触媒反応で最も広く使用されている触媒である酵素には、環境に敏感な活性と低い安定性の両方に明らかな欠点があることはよく知られていました[15、16、17、18、19]。したがって、高効率で安定した触媒の開発は、MMP-7検出用の超高感度電気化学アッセイを構築する上で最優先事項です。 Pdは、優れた触媒特性を備えた貴金属材料であり、触媒反応において高い化学的安定性を備えています[20、21]。さらに、炭素材料は、触媒の化学的不活性担体として機能し、貴金属材料を吸着し、触媒特性を保持することができます[22、23]。

上記の状況を考慮して、インピーダンスエンハンサーとしてPd官能化カーボンナノコンポジットを設計し、次の2つの機能を持つMMP-7のアンペロメトリーアッセイの感度を劇的に向上させました。 （1）カーボンナノスフェアは導電性の低い材料です[24]。 （2）Pdナノ粒子は、H ₂ による4-クロロ-1-ナフトールの酸化を触媒することができます。 O ₂ その場で不溶性の沈殿物を生成し、電極上に高抵抗の沈殿物を形成します[25]。これらの2つの要因により、抵抗率が増加し、電流が大幅に減少します。これにより、バイオセンサーの感度が大幅に向上し、LODが1​​7.38 fg mL ^-1 になります。 。触媒沈殿反応用に構築されたPd官能化ナノコンポジットは、高い選択性と感度を備えたMMP-7のアンペロメトリーアッセイで実用的です。

メソッド

資料

HAuCl ₄ ・3H ₂ O、H ₂ PtCl ₄ 、4-CN、ブドウ糖、H ₂ O ₂ （30％）、ウシ血清（TBS）のトロンビンは、Alfa Aesar（Tianjin、China）から購入しました。酸化グラフェン（GO）は、JCNANO（南京、中国）から購入しました。ウシ血清アルブミン（BSA、標準グレード）は、Beijing Xinjingke Biotechnologies Co.、Ltd。（北京、中国）から商業的に入手されました。ペプチド（NH ₂ -KKKRPLALWRSCCC-SH）は、Science Peptide Biological Technology Co.、Ltd。（上海、中国）から入手しました。ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）および前立腺特異抗原（PSA）は、Shanghai Linc-Bio Science Co. Ltd.（上海）から購入しました。マトリックスメタロプロテイナーゼ-2（MMP-2）は、Yeasen Biotechnologies Co.、Ltd。（Shanghai、China）から購入しました。 MMP-7は、Sino Biological Inc.（北京、中国）から提供されました。臨床ヒト血清サンプルは、ZhongKe ChenYu Biotech（北京、中国）が購入しました。すべての水溶液は超純水（抵抗率>18MΩcm）で調製されました。リン酸緩衝液（PBS）には、0.1 MKClと10mMリン酸緩衝液（pH =7.4）が含まれています。

装置

マイクロ波合成は、CEMDiscover®SPマイクロ波リアクター（CEM、米国）を介して実行されました。走査型電子顕微鏡（SEM）画像は、HITACHI S-4800 SEM（HITACHI、日本）を使用して取得しました。透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、HITACHI H7650 TEM（HITACHI、日本）で取得しました。エネルギー分散型X線分光法（EDS）は、HITACHI SU8010 SEM（HITACHI、Japan）で測定されました。すべての電気化学測定は、CHI600電気化学ワークステーション（Chenhua Instruments Co.、上海、中国）で実施されました。ガラス状炭素電極（GCE）（直径4 mm）を作用電極として使用し、白金線とAg / AgCl電極を対極と参照電極として使用したため、実験用の3つの電気化学システムを構築しました。高分解能透過型電子顕微鏡（HR-TEM）画像は、Tecnai G ² によって実行されました。 300kV未満のF30TEMが加速しています。

Pd官能化カーボンナノコンポジットの合成

Pd官能化カーボンナノコンポジット（Pd-CNC）は、以前に報告された文献[26]に従って合成されました。簡単に説明すると、4gのグルコースを40mLの超純水に溶解して透明な溶液を形成しました。次に、上記の溶液を50 mLのテフロンで裏打ちされたステンレス鋼のオートクレーブに移し、170°Cで5時間保持しました。反応後、透明な溶液は暗褐色に変わった。得られたカーボンナノスフェアを遠心分離により回収し、超純水/エタノールで数回洗浄した。得られた製品は、8mLの超純水に再配置されました。

カーボンナノスフェア上でPdナノ粒子を機能化するために[24]、1mLのカーボンナノスフェア懸濁液を25μLのHPdCl ₄ と混合しました。 解決。混合物をマイクロ波反応装置（250 W）で100°Cで15分間反応させた後、自然に室温まで冷却しました。次に、得られたPd-カーボンナノスフェアを遠心分離し、超純水で洗浄し、1mLの超純水に再配置しました。

MMP-7の非特異的吸着を回避するために、BSAはPd-カーボンナノスフェア上でさらに修飾されました。ナノスフェア懸濁液を100μLのBSA溶液（1 wt％）とともに室温で1時間撹拌しました。いくつかの遠心分離と洗浄のステップの後、BSAで修飾されたPd-カーボンナノスフェアを超純水に再配置し、さらなる実験のために4°Cで保存しました。

GCEでのAu-rGOの電着

変更する前に、GCEを0.05μmのアルミナスラリーで研磨し、超純水とエタノールでそれぞれ超音波処理しました。電着液は以下のステップで構成されました[27]。まず、8mgのGO粉末を20mLの超純水に超音波処理しながら2時間分散させました。次に、200μLのHAuCl ₄ 溶液（4 wt％）をGO懸濁液に添加しました。続いて、サイクリックボルタンメトリー（CV）技術によるGCEへのAu-rGOの電着を、スキャン速度50 mV s ^{-で1.5〜-1.5Vの範囲で行いました。 1} 上記の電着液で。最後に、Au-rGOで堆積させたGCE（Au-rGO / GCE）を超純水で洗浄して残留電着液を除去し、室温で窒素でブロー乾燥しました。

バイオセンサーの製造

Au-rGO / GCEを40μLのペプチド溶液（50μM）とともに37°Cで40分間インキュベートしました。続いて、GCEの修飾ペプチドを50μLのグルタルアルデヒド溶液（0.10 wt％）でさらに30分間活性化しました（ペプチド/ Au-rGO / GCE）。次に、20μLのPd-CNC懸濁液をペプチド修飾電極に1時間滴下しました（Pd-CNC /ペプチド/ Au-rGO / GCE）。各修飾ステップの後、修飾された電極は超純水で洗浄されました。

電気化学的測定

80マイクロリットルのMMP-7溶液（1 ng mL ^-1 ）をPd-CNCs /ペプチド/ Au-rGO / GCEとともに37°Cで1時間インキュベートし、超純水で十分に洗浄しました。次に、10 mM H ₂ を含む1.0mM4-CN溶液50μL O ₂ 沈殿反応を50分間進行させるために滴下しました。最後に、方形波ボルタンメトリー（SWV）測定は、5 mM [Fe（CN） ₆ で-0.2〜0.6Vで実施されました。 ] ^{3- / 4-} リン酸緩衝液（0.1 M、pH =7.4）、パルス振幅25 mV、増加電位4 mV s ^-1 。

結果と考察

ペプチド切断バイオセンサーの原理

ペプチド切断に基づくバイオセンサーの構築プロセスをスキーム1に示します。最初に、Au-rGOを電気化学的方法でグラッシーカーボン電極（GCE）に堆積させ、次にペプチドをAu-S結合によってAu-rGOに固定化しました。 Pd-CNCは触媒エンハンサーとして構成され、グルタルアルデヒドはペプチドとエンハンサーの間の化学的リンカーとして選択されました。 4-CNおよびH ₂ O ₂ インピーダンスを高めるために触媒沈殿基質として採用されました。特に、ペプチド中のアラニン（A）とロイシン（L）の間のペプチド切断酵素としてMMP-7が選択され[8]、SWVで測定された特徴的な電流信号の変化を引き起こしました。 GCEへのAu-rGOの電着には、次の2つの利点があります。（1）Au-rGOは、センシングインターフェイスの導電率を効果的に向上させることができます。 （2）それは部位がペプチドを固定化することを可能にする。次に、Pd-CNCの高インピーダンスと触媒性能を利用して、Pd-CNCを特定のペプチド（NH2-KKKRPLALWRSCCC-SH）切断に置き換えることにより、ΔIを増幅しました。この現象は、Pd-CNCの電気伝導率が低く、H ₂ による4-CNの酸化によって発生する降水のインピーダンスが高いことに寄与しています。 O ₂ Pd-CNCによって触媒されます。

MMP-7のアンペロメトリーアッセイ用のインピーダンスエンハンサーとしてのPd官能化カーボンナノスフェアの概略図

GCEでの触媒沈殿反応は、ペプチド/ Au-rGO / GCEの表面でPd-CNCをインキュベートすることにより、走査型電子顕微鏡（SEM）によってさらに特徴づけられました（図1a）。沈殿反応後、Pd-CNCは不溶性層でコーティングされており、修飾電極上に不溶性の低導電率層が形成されたことを示しています（図1b）。したがって、MMP-7の超高感度検出用のバイオセンサーは、ペプチド切断と触媒沈殿の両方によって引き付けられる感度増幅から首尾よく確立されました。

Pd-CNC /ペプチド/ Au-rGO / GCEのSEM画像（ a ）接触沈殿反応で処理（ b ）

Pd-CNCの特性評価

典型的な水熱法により、均質なPd-CNCの調製に成功しました。カーボンナノスフェア、Pd-カーボンナノスフェア、およびPd-CNCの形態は、透過型電子顕微鏡（TEM）およびエネルギー分散型X線分析（EDS）によって特徴づけられました。マイクロ波反応後、Pdナノ粒子が形成され、カーボンナノスフェア上に分布し（図2b）、直径150 nmのPdカーボンナノスフェアの調製が成功したことを示しています（図2a）。 Pd-CNCの形態を図2cに示します。 EDSの結果は、カーボンナノ粒子、Pd-カーボンナノスフェア、およびPd-CNCの化学組成を確認します。これは、カーボンナノ粒子にCとOが含まれていることを示しています（図2d）。 Pdナノ粒子の機能化後、PdはPd-カーボンナノスフェアのスペクトルにも存在し（図2e）、Pd-CNCのスペクトルに見られるSとNは、Pd-カーボンナノスフェアのブロックに使用されたBSAに由来します（図2f）。これらの結果は、Pd-CNC触媒エンハンサーの合成の成功を直感的に示しています。 Pd-カーボンナノスフェアのHR-TEM画像（図3a）は、機能化されたPdナノ粒子（図3b）が、観察可能な（1,1,1）格子面を持つ面中心立方（FCC）相にあることを示しています（図3a）。 3c）。対応する高速フーリエ変換（FFT）画像（図3d）も、Pdナノ粒子のFCC結晶性をサポートしています。

カーボンナノスフェアのTEM顕微鏡写真（ a ）、Pd-カーボンナノスフェア（ b ）およびPd-CNC（ c ）カーボンナノスフェアのEDS（ d ）、Pd-カーボンナノスフェア（ e ）およびPd-CNC（ f ）

Pd-カーボンナノスフェアのHR-TEM画像（ a ）、Pdナノ粒子の拡大画像（ b、c ）およびPdナノ粒子のFFT画像（ d ）

バイオセンサーの構築手順の特徴

バイオセンサーの構築手順は、SWV測定（図4a）と電気化学インピーダンス分光法（EIS）（図4b）によって監視されました。裸のGCE（曲線の裸のGCE）の電流信号と比較して、電位範囲のピーク電流は、Au-rGOの電着後に約420μA（曲線のAu-rGO / GCE）に増加しました。これは、 Au-rGO。次に、信号電流ピークは、電極へのペプチドの固定化後に減少し（曲線ペプチド）、ペプチドとエンハンサー（曲線Pd-CNC）の高インピーダンスのために、ペプチドとPd-CNC間の結合後にさらに減少しました。 MMP-7とのインキュベーション後、ピーク電流が増加しました（曲線MMP-7切断）。これは、MMP-7によるペプチドの特異的切断と、電極表面からのエンハンサーの部分的な除去が原因である可能性があります。同じ条件下で、電流が変化します（ΔI ₁ ）曲線「Pd-CNCs」と「MMP-7切断」の間は48.7μAと計算されました。次に、4-CNの接触沈殿反応後にピーク電流が減少し、電流ピークは136.1μAでした（曲線MMP-7開裂沈殿）。対照的に、MMP-7のないバイオセンサーは、触媒された沈殿反応の後に、より低い電流ピーク（54.9μA、曲線沈殿）を誘発しました。これはブランク信号として示されました。このような状況では、ΔI ₂ 曲線「降水量」と曲線「MMP-7劈開降水量」の間の現在の信号差であり、48.7から81.2μAに増加しました。 EISは、バイオセンサーの製造を監視するためにも使用されました。電子移動抵抗は、ナイキスト線図の半円直径に対応していました（図4b）。比較のために、ペプチド/ Au-rGO / GCE（曲線ペプチド）のプロットは、Au-rGO / GCE（曲線Au-rGO / GCE）および裸のGCE（曲線裸）よりも大きな半円、したがって大きな抵抗を示していますGC）は最小の円を持ち、ペプチドがGCEで正常に修飾されたことを示します。ペプチドがグルタルアルデヒド（曲線Pd-CNC）を介してエンハンサーと結合すると、耐性が増加しました。半円の直径は、MMP-7とのインキュベーション後にわずかに減少しました（曲線MMP-7切断）。これは、MMP-7がペプチドを特異的に切断したためと考えられます。対照的に、バイオセンサーを4-CNとH ₂ の溶液に浸すと、抵抗が大幅に増加しました。 O ₂ （曲線降水量）_。 ペプチド切断反応と接触沈殿反応の両方を経て、耐性は明らかに低下しました（曲線MMP-7切断沈殿）。

SWV（ a ）およびEIS（ b ）5 mM [Fe（CN） ₆ での電極の修飾プロセスの応答 ] ^{3- / 4-} リン酸緩衝（0.1 M、pH =7.4）

検出条件の最適化

バイオセンサーの検出性能の重要な要素として、ペプチドの量とインキュベーション時間はさらに最適化されました。ペプチド濃度が20から40μMに増加し、50から80μMの間で一定に保たれると、それに応じて電流信号が減少することがわかりました（図5a）。非特異的吸着を避けるために、その後の測定に50 µMを選択し、50 µMペプチドのインキュベーション時間を最適化しました（図5b）。 SWV電流は20分から40分に徐々に減少し、40分後も一定のままでした。したがって、ペプチドのインキュベーション時間として40分が選択されました。切断反応時間も、バイオセンサーの分析性能にとって重要な要素です（図5c）。バイオセンサーのシグナルは、切断時間が30〜50分で増加し、50分後も一定のままであり、ペプチドが完全に切断されたことを示しています。したがって、以下の実験では、切断時間として50分を選択しました。バイオセンサーの感度にも影響を与える沈殿反応（図5d）は、50分以内に増加することがわかり、電気化学的信号は継続的に減少しました。反応時間がさらに長くなっても電流信号は一定に保たれたため、次のアッセイでは沈殿反応時間として50分を選択しました。

ペプチド濃度の影響（ a ）、50μMペプチドのインキュベーション時間（ b ）、ペプチド切断時間（ c ）および沈殿反応時間（ d ）バイオセンサーの現在の応答について

提案されたバイオセンサーの性能

最適な条件下で異なる濃度のMMP-7とインキュベートした後、提案されたバイオセンサーの性能が決定されました。図6に示すように、MMP-7の濃度が低下すると、SWV信号が減少しました。検量線は、電流ピークと0.1 pg mL ^-1 の範囲の分析対象物濃度の対数との間に良好な線形関係があることを示しています。 〜100 ng mL ^-1 。一次方程式は（ I =− 16.53lgCMMP-7-137.26）、相関係数は0.9967です。バイオセンサーの検出限界は17.38fg mL ^-1 でした。 信号対雑音比が3のMMP-7の場合（S / N =3;は、ブランクソリューションでの信号の標準偏差です）。 MMP-7のペプチド切断検出に関する最近の報告と比較して、バイオセンサーはより優れた分析性能を示しました（表1）。

a 5 mM [Fe（CN） ₆ でのMMP-7の電気化学的検出のSWV応答 ] ^{3- / 4-} 100 fg mL ^-1 の濃度でリン酸緩衝液（0.1 M、pH =7.4） 〜100 ng mL ^-1 。 b 電流の線形検量線とMMP-7の濃度の対数。エラーバーは、 n の標準偏差です。 =3

免疫センサーのパフォーマンスの評価

バイオセンサーの再現性を評価するために、3つの修飾電極を0.01、0.1、1、10、および100 ng mL ^-1 とインキュベートしました。 MMP-7。対応する標準偏差は、それぞれ1.3％、1.4％、4.0％、1.0％、3.0％と計算され、バイオセンサーの再現性が良好であることを示しています。 MMP-2、NSE、PSA、TBSおよびBSAは、このバイオセンサーの特異性を分析するための気晴らしとして使用されました。バイオセンサーを1ng mL ^-1 の個々の混合物とインキュベートした場合、明らかな反応は観察されませんでした。 MMP-7（100 ng mL ^-1 それぞれ）MMP-2、NSE、PSA、TBSおよびBSA。わずか1ng mL ^-1 でインキュベートしたバイオセンサーと比較して MMP-7、各混合物の電流信号はほぼ同じでした（図7a）。これは、バイオセンサーがMMP-7に対して優れた特異性を示すことを示しています。安定性を調査するために、構築されたバイオセンサーを4°Cで28日間保存し、MMP-7検出のパフォーマンスを7日ごとに評価しました（図7b）。並行実験間の相対標準偏差（RSD）はすべて10％未満であり、バイオセンサーの顕著な安定性を意味します。

SWVの現在の応答（ a ）バイオセンサーの干渉防止能力について（エラーバーは n の標準偏差です =3）。注意散漫の濃度：MMP-2（100 ng mL ^-1 ）、NSE（100 ng mL ^-1 ）、PSA（100 ng mL ^-1 ）、THR（100 ng mL ^-1 ）およびBSA（100 ng mL ^-1 ）、 それぞれ。混合物には、これらすべての注意散漫が含まれています（100 ng mL ^-1 ）およびMMP-7（1 ng mL ^-1 ）。 SWV応答（ b ）1 ng mL ^-1 を検出するために、4°Cで異なる時間保存された提案されたバイオセンサーの MMP-7

提案手法の実用性を検討するために、回復実験を行った。回収率は86.3〜117.2％の範囲であり（表2）、臨床分析におけるバイオセンサーの有望な実用性をさらに示しています。

結論

要約すると、Pd官能化カーボンナノコンポジットは、有望なH ₂ を明らかにする、新しいインピーダンスエンハンサーとして製造されました。 O ₂ 4-CN酸化の触媒性能。電極上の不溶性酸化4-CN沈殿の高インピーダンスを利用して、MMP-7を検出するためのアンペロメトリーバイオセンサーを構築しました。バイオセンサーは、同等の感度、広い検出範囲、優れた実用性、およびMMP-7の検出に対する卓越した選択性を備えており、さまざまなバイオアプリケーションでの潜在的なアプリケーションを示唆しています。私たちの研究は、アンペロメトリーアッセイの性能を改善する上でのインピーダンスエンハンサーの重要性をさらに強調し、高度な触媒活性と高い耐性を備えた新しいエンハンサーの製造を奨励しています。

略語

4-CN：

4-クロロ-1-ナフトール

BSA：

ウシ血清アルブミン

EDS：

エネルギー分散型X線分光法

FCC：

面心立方

FFT：

高速フーリエ変換

GCE：

ガラス状炭素電極

GO：

酸化グラフェン

HR-TEM：

高分解能透過型電子顕微鏡

LOD：

検出限界

MMP-2：

マトリックスメタロプロテイナーゼ-2

MMP-7：

マトリックスメタロプロテイナーゼ-7

NSE：

ニューロン特異的エノラーゼ

PBS：

リン酸緩衝液

Pd-CNC：

Pd官能化カーボンナノコンポジット

PSA：

前立腺特異抗原

RSD：

相対標準偏差

SEM：

走査型電子顕微鏡

SWV：

方形波ボルタンメトリー

TBS：

ウシ血清のトロンビン

TEM：

透過型電子顕微鏡