膀胱癌細胞を阻害するための疎水性修飾プルランナノ粒子を用いたミトキサントロンの新規送達および阻害効率に対するナノ薬物サイズの影響

背景

化学療法は腫瘍の一般的な治療法です。しかし、組織特異性がないため、化学療法の治療効果は限られており、多くの場合、強い副作用があります[1、2]。したがって、化学療法薬の標的能力を増強するためにナノ粒子（NP）製剤を使用する研究が増加しています[3,4,5]。

強化された透過性と保持（EPR）効果を介して腫瘍組織を受動的に標的化した後、NPをロードした低分子抗腫瘍薬などのナノドラッグは、主に2つの方法でその有効性を発揮します。遊離型の細胞は有効性を発揮し、（2）微粒子の形で細胞に取り込まれ、細胞内に放出されて薬力学的効果を発揮します[6、7]。ナノ医薬品が受動的に腫瘍を標的とする場合、2つの方法のどちらが主要な役割を果たすか、または両方が同時に主要な役割を果たすかどうか、および他の要因が関与するかどうかは複雑な問題です。腫瘍組織の代謝活性、虚血および低酸素症、ならびに乳酸の蓄積のため、および腫瘍組織の細胞外液は弱い酸性度を示すため、多くのナノ薬物は、有効性を高めるために酸性環境での放出の増加を示します[8]。酸性環境におけるナノ薬物の薬物放出効率は、ナノ材料の物理化学的特性と密接に関連しており、NPのサイズにも影響されます[9、10、11]。 NPが腫瘍組織を受動的に標的にした後、腫瘍細胞は食作用機能を持っているため、ナノ医薬品製剤は主に飲作用と細胞膜タンパク質によって媒介される複雑なプロセスを介して細胞に入ります[12、13]。細胞内リゾチームの分解下で、ナノ医薬品は薬物を放出し、有効性を発揮します[14]。

標的組織における標的細胞の取り込み効率は、ナノマテリアルの特性、表面修飾、形態、電荷、およびNPサイズと密接に関連しています[15、16、17、18]。細胞の取り込みは、NPサイズに大きく依存します。 Her-gold NPの内部移行（エンドサイトーシス）はサイズに大きく依存します。最も効果的な吸収は、25〜50nmの範囲のNPで発生します[19]。非常に小さいまたは大きいNPは、非効率的な吸収を示します。 40〜50 nmのサイズは、受容体を介したエンドサイトーシスの重要なポイントです[20]。さらに、NPサイズは細胞毒性に影響を与えます。 45nmと90nmのNPを比較すると、ポリマーNPのサイズは細胞毒性に反比例します[21]。 NPのサイズは、腫瘍組織での薬物の放出と細胞の取り込み効率に影響を与え、最終的には薬物の有効性に重要な役割を果たします。

多糖類の局所接着は、局在化および標的化機能を改善します。外部の癌細胞の酸性環境は、多糖類ナノ薬物の部分的な放出をもたらし、腫瘍組織の受動的標的化後の薬物負荷NPと遊離薬物の二重治療効果を引き起こします[22、23]。

毒性のないプルランは体内で分解されやすく、コレステロールは体内に内在する物質であるため、安全で薬物の担体として適しています[24、25]。疎水性コレステリル基と親水性糖鎖を有するコレステリル疎水性修飾プルラン（CHP）ポリマーは、疎水性の中心コアと親水性のシェルを備えたナノスフェアのような構造に自己集合することができます[26、27]。両親媒性ポリマーは、回転楕円体構造のNPに自己集合し、疎水性コアはコレステリル基などの疎水性基によって形成されます[28]。

DNAを挿入し、トポイソメラーゼIIを阻害することができる広域スペクトルの抗癌活性アントラサイクリン抗生物質であるミトキサントロンは、古典的な抗腫瘍薬です。ただし、その心毒性のため、ミトキサントロンの使用は制限されています。ミトキサントロンは、疎水性相互作用によってCHP NPの疎水性中心にロードされ、EPR効果を介した受動的ターゲティング効果を持つCHPナノメートル調製物を形成します。遊離薬物と比較して、薬物をロードしたCHP NPは、薬物の毒性効果の低下と抗がん効率の向上を示します[29、30]。 CHPポリマーの疎水性基コレステリルはNPのコア構造の形成を促進し、特定の範囲内で、疎水性基の置換度が高いほど、NPのサイズは小さくなります[31、32]。 CHPの安定性は少なくとも2か月間優れており、サイズやゼータ電位に大きな変化はなく、プルランナノ粒子は腫瘍組織を標的にして、EPR効果によって癌細胞を殺すことができます[33、34]。

この研究では、ミトキサントロンをロードするための抗腫瘍薬担体としてコレステロールで疎水的に修飾されたプルラン（CHP）NPを使用しました。さまざまなサイズのミトキサントロン負荷プルランNPは、さまざまな無水コハク酸コレステロールエステル（CHS）電荷比でCHPポリマーを合成して、薬物の持続放出、酸性環境での薬物放出、膀胱癌に対する毒性に対するNPサイズの影響を研究することによって生成されました。細胞、細胞取り込み効率、および細胞移動。この実験では、薬物担体として適切なNPをスクリーニングし、より強力な薬物効率を実現するために、パッシブターゲティングを使用してNPのサイズ範囲を評価しました。

材料と方法

試薬と機器

ミトキサントロンはAladdinChemistry（Shanghai）からのものでした。透析バッグ（BioSharp、米国、8000〜12,000 Da）は、Tianjin JunyaoBiotechnologyから入手しました。他の試薬はBeijingXinzeTechnologyからのものでした。

日本F-4500蛍光分光光度計、J-810円二色性クロマトグラフ（Jasco Co.、日本）、粒子サイズ分析器（MALVERN、Nano 2S-90、日本）、および投影電子顕微鏡（JEM-100CXII、日本）を使用しました。 。

CHPポリマーの合成と特性評価およびコレステロールの置換度の計算

無水コハク酸CHSの合成は以前に報告されました[35]。 0.5gのプルランサンプルを15mLの脱水ジメチルスルホキシドに溶解して保存しました。 CHS（糖単位/ CHS =0.20、0.15、0.05 mmol / mmol）、4-ジメチルピリジン（DMAP ∕ CHS =1 mmol / mmol）、および1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチル-カルボジイミド塩酸塩（EDC ∕ CHS =1.2 mmol / mmol）を別々に10 mL DMSOに溶解し、室温で攪拌し、1時間活性化しました。活性化反応をプルラン溶液に落とした。 48時間後に反応を停止しました。反応液を200mLの無水エタノールに滴下すると、白い沈殿物が形成されました。ろ過は吸引によるもので、生成物を適量のエタノール、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルで洗浄した後、80℃で乾燥させました。コレステロール置換度の異なる3種類のCHPポリマーが得られました：CHP-1、CHP-2、およびCHP-3 [36]。プルラン多糖類とCHPポリマー10〜20 mgは、超音波条件下でDMSO-d6によって溶解され、 ¹ HNMRスペクトルを調べた。 CHPポリマーのコレステロールの置換度は、α-1,4およびα-1,6グリコシド結合とメチレンピークの下の面積に基づいて決定されました。

薬物をロードしたCHPNPの調製と特性評価

記載されているようにミトキサントロンをロードしたCHPNPの合成[37、38]、薬物をロードしたNPは、さまざまな程度のコレステロールで置換された3つのCHPNPのそれぞれ40mgとバックアップ用の4mgのミトキサントロンを用いた透析によって得られました。凍結乾燥後に蒸留水に分散させた新たに調製した薬物負荷NPまたは薬物負荷NPを、炭素支持フィルムを備えた銅グリッド上に滴下し、濾紙を排出した。グリッドはデシケーターに配置され、次に2％（ w / w ）リンタングステン酸（2％）を添加しましたが、これは自然乾燥後に陰性であり、透過型電子顕微鏡（TEM）で観察されました[38]。凍結乾燥後に蒸留水に分散させた、新たに調製した薬物負荷NPまたは薬物負荷NPの溶液をキュベットに注ぎ、粒子サイズ分析器に入れて検出しました。各サンプルを3回処理して、NPのサイズと可能性を均等にしました。

薬物負荷および薬物負荷CHPNPのカプセル化効率の測定

ミトキサントロンを負荷したCHPNPの薬物負荷量（LC％）とカプセル化効率（EE％）は、次のように測定されました[31、39]。

薬物放出の研究

3種類のミトキサントロンをロードしたNPを、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）と、pH =6.8および4.0の放出媒体に入れました。ミトキサントロン放出は、透析によってインビトロで研究され、累積放出パーセンテージ（Q％）は、記載されているように計算された[40]。

細胞株と培養条件

P Guo博士（西安交通大学泌尿器研究所、西安、陝西省、中国）から提供されたマウス膀胱癌細胞株MB49を、10％ウシ胎児血清（Hyclone、Logan）を添加したDMEM（Lonza）で培養しました。 、UT、USA）および5％CO ₂ を含む加湿空気中37°Cで1％ペニシリン-ストレプトマイシン 。

細胞生存率アッセイ

細胞生存率は、テトラゾリウムベースのアッセイによって評価されました。簡単に説明すると、細胞を2×10 ⁴ で播種しました。 96ウェル培養プレートのウェルあたり、24時間付着させました。実験の開始時に、さまざまな播種密度が最適化されました。インキュベーター内で、細胞をさまざまな濃度のミトキサントロンで24時間処理しました。 0.0078、0.0156、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、および1μMのミトキサントロンを1％ウシ胎児血清を添加したDMEMに溶解しました。ハンクの平衡塩類溶液に2mg / mLで溶解した50μLのMTTテトラゾリウム塩（Sigma）を、指定された処理で各ウェルに添加し、CO ₂ でインキュベートしました。 5時間のインキュベーター。最後に、培地を各ウェルから吸引し、150μLのDMSO（Sigma）を添加してホルマザン結晶を溶解しました。各ウェルの吸光度は、DynatechMR5000プレートリーダーを使用してテスト波長490nmおよび参照波長630nmで取得しました。

IC ₅₀ ミトキサントロンの値は、用量反応曲線によって決定されました。 3つの置換度を持つNPの3つの濃度（0.0625、0.125、0.25μM）をMTTで比較しました。実験手順はミトキサントロンの場合と同じでした。

アポトーシスの評価

細胞アポトーシス率は、アネキシンV-FITC /ヨウ化プロピジウム（PI）を用いたフローサイトメトリーによって決定されました。簡単に説明すると、処理した細胞を冷PBSで2回洗浄した後、2×10 ⁶ の結合バッファーに再懸濁しました。 製造元の指示に従ってcells / mL。次に、5μLのアネキシンV-FITCと5μMのPIを100μLの細胞懸濁液に加え、暗所で室温で30分間インキュベートしました。 300μLの結合バッファーを加えた後、1時間以内にフローサイトメトリーで標識細胞を検出しました。

すべての初期アポトーシス細胞（アネキシンV-FITC陽性[緑色に染色]、PI陰性）、壊死細胞（アネキシンV-FITC陰性、PI陽性）、後期アポトーシス細胞（二重陽性）、および生細胞（二重陽性）ダブルネガティブ）はフローサイトメトリー（FCM）で検出され、Cell Questソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して分析されました。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）のアルゴンレーザー励起波長は488 nm、発光波長は530 nm（FL-1チャネル）、PIの発光波長は670 nm（FL-3 c3チャネル）でした。また、アポトーシスを蛍光顕微鏡で調べた。まず、1.0×10 ⁵ 細胞を96ウェル培養プレートに播種し、24時間後、細胞を上記のように処理し、24時間後、100μLの結合バッファー、1μLのアネキシンV-FITC、および1μLPIを室温、暗所で細胞に添加しました。 15分間、低温に保ち、蛍光顕微鏡で観察します。

細胞遊走アッセイ

合計8×10 ⁵ 細胞を6ウェルプレートに播種し、完全にコンフルエンスに到達させました。カクテルスティックを使用して単層を傷つけた。示されているように、細胞を無血清DMEMとともにインキュベートした。デジタル画像は0、6、12、24、48時間に撮影されました。画像Jを使用して平均面積を計算し、実験を3回繰り返しました。

結果と考察

CHPコンジュゲートとコレステロールの置換度

¹ CHP（TMSを含むDMSO-d6、ppm）のHNMR値は2.53ppm（2つのメチレン基、–OCH ₂ ）でした。 CH ₂ O–）。図1は、 ¹ を示しています H NMRスペクトル、コレステロールがコハク酸スペーサーアームを介してプルラン長鎖に化学的に結合していることを確認。異なる飼料要求率（a、b、c）で合成された3つのCHP NPのスペクトルは、プルランの特徴的なピークを示しました。 α-1-4およびα-1,6グリコシド結合は∂ _4.68 （1Hα _1–6 ）、∂ _5.05 （1Hα _1–4 ）、および∂ _2.53 （2つのメチレン基、–OCH ₂ CH ₂ それぞれO–）であり、これも簡単に区別できました。 0.40〜2.40（コレステリック骨格の水素）に新しい特徴的なピークが現れ、3つのCHPポリマーが正常に合成されたことを確認しました。ピークの下の面積は原子の数を反映しており、コレステリック置換度は次のように計算できます[41]：

CHP-1のNMRスペクトル（ a ）、CHP-2（ b ）、およびCHP-3（ c ）

ここで、A _∂4.68の合計 およびA _∂5.05 糖単位の数を表します、A _∂2.53 は–OCH ₂ の水素原子の数です CH ₂ コハク酸コハク酸のO–、およびA _∂2.53 / 4は–OCH ₂ の数です CH ₂ O–、つまり、無水コハク酸CHSに含まれるコレステロールの数。したがって、上記の式は、CHP分子のコレステリック置換度を100グルコース単位あたりのコレステリル基の数として表しています。コレステリルおよびプルラン糖単位の計算された飼料要求率およびモル比は、それぞれ1 / 5、3 / 20、および1/20であり、3つの合成されたCHP-1、CHP-2、およびCHP-3の置換度でした。ポリマーはそれぞれ6.82％、5.78％、2.74％でした。プルラン鎖上のコレステロールの置換度は、飼料比率の増加とともに増加しました。ただし、実際の置換度は両方の飼料要求率よりも低かった。

プルラン鎖は、溶媒中に柔軟なコイル状の鎖として存在する可能性があり、一定量のコレステロールを添加すると、グラフトされたコレステロールはより大きな分子立体障害を示し、スクシニルコレステロールとヒドロキシル基のさらなる直接エステル化反応に影響を与えますプルランチェーンに。反応の難易度が大幅に向上したため、置換度が小さくなりました。

薬物をロードしたCHPNPとそのサイズ

CHP-1、CHP-2、およびCHP-3の3つのブランクCHP NPのサイズは、79.1、104.9、および166.8nmでした。ある程度の置換度では、コレステロールの置換度が高くなるにつれて疎水性が強化されました。疎水性が強いほど、CHP自己凝集NPはよりコンパクトな疎水性コアを形成し、NPのサイズが小さくなります[42]。図2は、薬物をロードしたCHPNPのサイズを示しています。 CHP-1、CHP-2、およびCHP-3の粒子サイズはそれぞれ86.4、162.30、および222.28nmでした。薬物と材料の同じ比率で、ポリマー疎水性基の高度な置換を伴う薬物負荷NPの粒子サイズは小さかったが、薬物負荷NPの粒子径はカプセル化されていない薬物よりも大きかった。 -同じ程度の置換度を持つブランクNPを含みます。ミトキサントロンが疎水性コアに入ると、NPの粒子サイズが大きくなります。図2dでは、薬物をロードしたCHPNPのゼータ電位は-1.12mVです。図2eは、薬物をロードしたNPが球状であることを示すTEM画像です。

ミトキサントロン（CHP-1（ a ）をロードしたNPサイズの画像 ）、CHP-2（ b ）、CHP-3（ c ））、潜在的な画像（CHP-2（ d ））、およびTEM画像（CHP-2（ e ））

さまざまなサイズの薬物負荷NPおよびさまざまな酸性媒体下での薬物放出

薬物とCHPポリマーの比率が同じである場合、薬物を負荷したCHP-1、CHP-2、およびCHP-3 NPの薬物負荷と捕捉効率は8.17％と88.92％でした。 7.62％および82.28％;それぞれ4.83％と50.67％。 CHPポリマーのコレステリック疎水性置換が高ければ高いほど、形成される粒子サイズは小さくなり、薬物の負荷と捕捉の効率は高くなります。図3は、3つの薬物負荷CHPNPの薬物放出プロファイルを示しています。 PBSでは、薬物は48時間放出されました。 CHP-1、CHP-2、CHP-3の放出率はそれぞれ38.73％、42.35％、58.89％でした。 3つのNPはすべて徐放性を示しましたが、NPサイズが小さいほど、疎水性が強くなり、薬物放出が遅くなります。 pH 6.8では、CHP-1、CHP-2、CHP-3の薬物放出率はそれぞれ43.82％、49.48％、64.18％でした。弱酸性条件では、CHP NPは薬物を持続的に放出しましたが、放出速度は大幅に増加しました。 pH 4.0では、48時間の薬物放出後、CHP-1、CHP-2、およびCHP-3の薬物放出率はそれぞれ51.25％、56.23％、および75.46％でした。 CHP NP薬物の放出は、特に3つのCHPNPの中で最大のCHP-3NPの場合、より低いpHで大幅に速くなりました。

リン酸緩衝生理食塩水（黒い四角：CHP-1、白い丸：CHP-2、黒い下向きの三角形：CHP-3）、pH 6.8（白い上向きの三角形：CHP-）中のプルランNPからのミトキサントロン（MTO）の放出1、黒いひし形：CHP-2、白い四角：CHP-3）、pH 4.0（黒い三角形：CHP-1、白いひし形：CHP-2、黒い丸：CHP-3）、37°C​​でin vitro

ミトキサントロンをロードしたCHPNPの細胞毒性

MTTアッセイ（図4）では、IC ₅₀ 膀胱がん細胞の増殖を阻害するためのミトキサントロンの値は、24時間、48時間、および72時間でそれぞれ0.25、0.20、および0.06μMでした（表1）。投与時間は24時間を考慮しました。

膀胱癌細胞株MB49の細胞増殖に対するミトキサントロンおよびNPによる治療の効果。細胞生存率は、マウス膀胱がん細胞株MB49でミトキサントロンと0〜0.5μg / mLのナノ薬物を用いた24時間、48時間、および72時間の処理によるテトラゾリウムベースのアッセイによって評価されました。

遊離ミトキサントロンとミトキサントロン-CHPNPの濃度が同じ投与で同じである場合、図5のMTT実験の結果は、遊離ミトキサントロン濃度がミトキサントロン-CHPNPよりも膀胱癌細胞に対して毒性が高いことを示しています。ミトキサントロン-CHPNPを3つのコレステロール置換度と比較すると、最も強力な細胞毒性効果はCHP-3であり、次にCHP-2であり、最も弱いのはCHP-1でした。

24時間での遊離ミトキサントロンおよびミトキサントロン負荷CHPNPの細胞毒性（青い四角：ミトキサントロン、ピンクの丸：CHP-1、緑の三角形：CHP-2、赤い下向きの三角形：CHP-3）

膀胱癌細胞に対するさまざまな濃度のミトキサントロン-CHPNPの毒性効果、特にCHP-2とCHP-3は類似していたが、CHP-1の効果は大幅に減少した。 CHP-1の各濃度はこの現象を示しました。したがって、ミトキサントロン-CHP NPサイズが大きいほど、細胞毒性が強くなります。

ＮＰの治療効果は２つの部分を有する：（１）ＮＰの細胞取り込みおよび（２）ＮＰは細胞外に放出され、薬物はそれらの効力を発揮するために細胞に自由に入る。遊離ミトキサントロンはミトキサントロン-CHPNPよりも強力な効果があるため、CHP-3は、同じ薬剤投与量で他の2つのCHPNPよりも強力な治療効果を示しました。 CHP-3の放出は最速であり、CHP NPの治療効果は、主にナノ医薬品の放出後の細胞内の遊離ミトキサントロンの毒性に依存していました。

ミトキサントロン-CHPNPの細胞アポトーシス

蛍光抗体法とフローサイトメトリーを使用して、同じ濃度の0.2μg/ mLミトキサントロンと3つの薬物負荷CHPNPがMB49細胞のアポトーシスに及ぼす影響を比較しました。遊離ミトキサントロンは、3つのミトキサントロン-CHP NPよりもアポトーシスに対して強力でした（図6）。ただし、CHP-3が最も強力な効果を示し、最も弱いのはCHP-1でした。以前のMTTの結果はさらに確認されました。

MB49膀胱がん細胞での24時間でのミトキサントロンとナノドラッグのアポトーシス（ a DMSO、 b ミトキサントロン、 c CHP-3、 d CHP-2、 e CHP-1）：A。アネキシンV-FITC / PI二重染色が蛍光顕微鏡で検出され、初期のアポトーシス細胞はアネキシンV-FITC陽性染色（緑）を示し、壊死細胞はPI陽性（赤）、後期アポトーシス細胞は陽性の二重染色（黄色）を示した。 B.アポトーシス率はFCMによって決定されました。生細胞（Q3）、初期アポトーシス率（Q4）、後期アポトーシス率（Q2）、壊死細胞（Q1）。細胞染色が大きいほど、アポトーシス率は高くなります

ミトキサントロンをロードしたCHPNPの細胞移動

コントロールとの比較により、遊離ミトキサントロンと3つのCHP NPがMB49細胞の遊走を阻害する24時間および48時間の能力が観察されました（図7）。移動阻害は、3つのCHPNPよりも遊離ミトキサントロンの方が有意に強くはありませんでした。 MTTアッセイとアポトーシス試験では、主に遊離薬物が細胞に入りやすく癌細胞を殺すため、3つのCHPNPよりも遊離薬物の方が遊走阻害が強かった。細胞遊走実験においても、遊離薬物は、CHPナノ医薬品よりも効率的に細胞遊走を阻害する可能性があります。これは、一部のCHPナノ医薬品が細胞間で貪食されないため、癌細胞の遊走抵抗性をもたらす可能性があります。さらに、3つのCHP NPは、癌細胞の遊走を阻害する点で違いがなかったため、NPによって形成される立体抵抗が細胞遊走に重要な役割を果たしました。したがって、薬物をロードしたCHPNPは、2つの方法で癌細胞を阻害します。（1）細胞外放出が支配的な方法であり、ナノ薬物は細胞外に薬物を放出し、癌細胞を遊離薬物として殺します。CHP-3NPはより毒性があります。他のCHPNPよりも、（2）癌細胞の外側のCHP NPは立体抵抗を生み出し、したがって癌細胞の移動をブロックします。

ミトキサントロン単独およびミトキサントロン負荷-CHPNPは、創傷治癒アッセイで移動障害を示しました。 a DMSO、 b ミトキサントロン、 c CHP-3、 d CHP-2、 e CHP-1。画像は、さまざまな時点での引っかき傷のある領域のギャップを示しています。 A ₀ 、A ₂₄ 、およびA ₄₈ それぞれ、DMSO処理の0、24、および48時間を表します

この研究の目的は、薬剤担体として適切なサイズのCHP NPをスクリーニングし、CHPNPの治療作用の実験的証拠を提供することでした。コレステロール置換度がそれぞれ6.82％、5.78％、2.74％、直径が86.4、162.30、222.28の3種類のステロール置換プルランポリマー（CHP）、CHP-1、CHP-2、CHP-3を合成しました。 nm。 3種類のミトキサントロン-CHPNPの48時間の薬物放出率は、それぞれ38.73％、42.35％、58.89％でした。ポリマーの疎水性置換度は、NPの自己組織化プロセスに関連しており、NPのサイズ、したがって薬物放出速度に影響を及ぼしました。酸放出媒体では、放出が大幅に加速されました。 NPが大きいほど、薬物放出速度は速くなります。 24時間で、IC ₅₀ 膀胱がん細胞の増殖に対するミトキサントロンの最良の阻害効果については、値は0.25Mでした。最大サイズの薬物負荷CHP-3NPは膀胱癌細胞に対して最も毒性が高く、CHP-3NPは細胞のアポトーシスの促進に最も強い影響を及ぼしました。すべてのNPはMB49細胞の移動を阻害する可能性がありますが、大型のCHP-3NPが最も強力な阻害を示しました。

両親媒性ポリマーは、水溶液中で自己組織化してNPになります。例としては、多糖類のプルランとキトサンがあります。これらは、小分子の疎水性修飾によって両親媒性ポリマーに修飾され、疎水性基をコアとし、親水性糖鎖シェルを持つ水溶液中で球状NPに自己組織化されます[43、44]。自己組織化の間、疎水性基はNPの形成の原動力であり、それらのシェルおよびコア構造の形成の鍵となります。親水性基の特性と分子量も、NPの形成とサイズに重要な影響を及ぼします[45、46]。同じポリマーが疎水性基のごく一部で修飾されている場合、疎水性置換の程度は中程度である必要があり、特定の範囲内でのみ、疎水性置換を自己組織化してNPにすることができます。疎水性置換度が高すぎると、ポリマーの疎水性が強すぎて、自己組織化を助長しません。疎水性置換が低すぎる場合、疎水性駆動力が小さすぎてNPを形成できません[47]。

本研究では、適切な供給比率を設計することにより、コレステロールの置換度が異なる3種類のCHPポリマーの合成に成功し、すべてが特定のサイズのNPに自己組織化することができました。 CHPポリマーの自己組織化中に、ミトキサントロンなどの疎水性薬物をNPの疎水性中心に埋め込んで、薬物をロードしたNPを形成することができます（図8）。薬物をロードしたNPのサイズは、ポリマーCHPの置換度に関連しています。置換度が高いほど、サイズは小さくなります。ポリマーの置換度は、自己組織化後にNPにロードされる薬物の量にも影響します。ポリマーと薬物の比率が同じである場合、置換度が高いほど、薬物負荷が大きくなります[48]。また、薬物に対するポリマーの比率は、カプセル化効率と薬物負荷に影響を与えます。供給比率が適切な範囲にある場合にのみ、薬物の負荷とカプセル化の効率が比較的高くなります[31]。 Drug release of NPs directly affects their therapeutic effects, which is closely related to the kinds of nanomaterials, the surface charge and hydrophobic group of NPs, the pH value of releasing media, and the adsorption of the protein human serum albumin (HSA) in vivo [49, 50]. The drug release of mitoxantrone-loaded CHP NPs showed slow release. The drug release of CHP NPs with large size was faster and that of NPs in an acid environment was faster. The drug release rate of larger-sized NPs was more obvious and faster.

The self-assembly of mitoxantrone-loaded CHP nanoparticles (NPs)

Cancer chemotherapy is the main way to treat cancer currently, but the chemotherapy drugs are not tissue-specific and are toxic to normal tissues, and some cause great damage to immune cells, which harms the overall treatment effect [51, 52]. Nanomedicine can passively target cancer tissues via the EPR effect, thereby reducing drug deposition in non-target tissues and reducing toxicity and side effects. In this study, we used bladder cancer cells as model cancer cells, and we discuss the effects of NPs and NPs size on bladder cancer. The antitumor effect was stronger for free mitoxantrone than CHP NPs; however, if the whole drug is given, mitoxantrone is not tissue-specific. The deposition and wasting of tissues and the toxicity and side effects caused by these drugs will not be as effective as nano-drug treatments. Therefore, the toxic effects on cancer cells and the inhibition of cell migration was better with the free drug than drug-loaded NPs, which does not indicate that the overall therapeutic effect of CHP nanometers is not as good as that of free mitoxantrone. We point out the effect of hydrophobic degree of substitution on the size of nanoscale drugs and the effect of nano size on drug loading, drug release, cytotoxicity and cancer cell migration. After the NPs are passively targeted to cancer tissue via the EPR effect, the therapeutic effectiveness of drug-loaded NPs is mainly derived from the release of drugs in the tissue and the release of NPs to cells (Fig. 9). The therapeutic effect of CHP NPs is whether its extracellular or intracellular release plays the dominant role. From the cell experiments, the size of CHP NPs has a strong effect:with large size, drugs are released more, but the amount of the drug is the same. Therefore, the therapeutic effect of CHP-NPs may depend mainly on the release in the tissue instead of cell uptake.

The treatment efficacy of mitoxantrone-loaded CHP NPs by mainly location release in tumor tissue

Many classical NPs are used as drug carriers, and the CHP NPs we prepared are superior to others. For example, biogenetic NPs (such as exosome, extracellular vesicles-mimetic, modularized extracellular vesicles) are difficult to prepare [53]. The target distribution of common liposomes is not ideal and its instability is still a problem [54]. Inorganic NPs such as quantum dot NPs are very stable, but as foreign matter, their biocompatibility is poor, which may cause side effects to humans [55]. CHP NPs are easy to prepare and we can control their size by controlling the degree of hydrophobic substitution [48]. Because they can be directly degraded by amylase in vivo, they have good biocompatibility [56]. In addition, CHP NPs have good stability and excellent drug release properties [57].The disadvantage is that they will inevitably be swallowed in part by the mononuclear phagocytic system [58]. More research is needed to reduce the removal by the system and improve the effective blood concentration of NPs.

Conclusion

The size of mitoxantrone-loaded CHP NPs is related to the degree of cholesterol substitution in the polymer. The higher the hydrophobicity substitution degree, the smaller the size, and the greater the drug loading and encapsulation efficiency, and the slower the drug release. Under acidic conditions, the stronger the acidity, the faster the release of CHP NPs. Moreover, the release of NPs with larger size is best and larger-sized NPs can inhibit the growth of bladder cells and their migration better than smaller-sized NPs. CHP NPs kill cancer cells mainly by the release of nanoscale drugs outside the cell.