生分解性Feドープ酸化亜鉛ナノ粒子：生物学的応用に向けた有望な鉄送達システム

概要

鉄は生物にとって不可欠な元素であり、その欠乏は世界で最も一般的な栄養障害とされています。現在、ヒトと動物の両方に対するより効果的で安全な鉄補給戦略は、栄養欠乏症治療における最重要課題の一つとなっています。我々の以前のin vivo研究では、自社製造の酸化亜鉛系ナノ粒子の安全性と生分解性、および体内の大半の臓器・組織への迅速な分布が確認されています。Caco-2細胞株（消化管上皮細胞モデル）を用いたin vitro試験では、検討中のナノ材料の低毒性が明らかになりました。本研究では、Fe(III)ドープ生分解性酸化亜鉛ナノ粒子を鉄欠乏症に対する有望な補給戦略として調査しました。成獣マウスに生分解性ZnO:Feナノ粒子を経口投与し、24時間後に臓器を回収して分析しました。原子吸光分析と組織学的染色（Perls法）による鉄濃度測定では、鉄恒常性に関連する組織への鉄ドープナノ粒子の迅速な分布が示されました。肝細胞内および脾臓の血管周囲にも鉄の蓄積が見られ、Feドープナノ粒子が血流から組織へ移行する可能性を示唆しています。まとめると、本研究で得られた予備的結果は、生分解性ZnOナノ粒子にFeをドープすることが、生体内での外因性鉄の良好な担体となり得ることを示唆しています。したがって、組織への鉄沈着の正確なメカニズムとナノ粒子担体が鉄代謝に及ぼす影響を明らかにする後続研究が必要です。

はじめに

鉄は、ヒトを含む地球上の生物を構成する最も重要な元素の一つです。この元素の重要性は、体内の多くの構造とプロセスで鉄が必須の役割を果たすことに関連しています。例えば、全身の組織と細胞への酸素運搬（ヘモグロビンとミオグロビンの構成要素）、エネルギー産生（ミトコンドリア呼吸鎖タンパク質の構成要素）などです[1,2]。したがって、鉄は細胞と生物全体の重要な生命プロセスに関与し、その欠乏は生体機能に重大な障害をもたらす可能性があります。

世界的な報告によれば、鉄欠乏はヒト社会における深刻な公衆衛生問題となっています。WHOによると、1993〜2005年の間に世界人口のほぼ30%が貧血の影響を受けました。貧血の有病率は幼児と妊婦で依然としてはるかに高いです[3]。妊娠中の鉄補給の重要性は、鉄欠乏が早産、低出生体重児、新生児の全般的な健康状態悪化のリスク因子であることに関連しています[4]。乳幼児および就学前児童の場合、全身の急速な成長とそれに伴う鉄貯蔵の消費により鉄欠乏のリスク因子となるため、0〜5歳児への鉄補給も推奨されています[5]。興味深いことに、子供の適切な鉄レベルとその情緒的・神経心理学的発達との相関を示す科学的報告もあります[6]。また、鉄欠乏は他の哺乳類、特に哺乳仔豚においても深刻な栄養障害であり、子宮内での鉄供給が限られ、豚の乳に鉄含有量が少ないことが原因です[7,8]。また、仔豚の急速な成長により鉄貯蔵が急速に枯渇し、生後数日で体重が倍増し、赤血球数と総血液量が増加します。したがって、現在、ヒトと動物の両方に対するより効果的で安全な鉄補給戦略は、栄養欠乏症の予防と治療における最重要課題の一つとなっています。

生物への外因性鉄送達には、静脈内、筋肉内、経口の3つの主要な方法があります。それぞれに利点と欠点があります。経口投与はシンプルで体にとってより自然であり、鉄の吸収と輸送の生理的経路を利用します。また、ヘプシジンに基づく体内循環鉄量の自然な制御システムを維持できます[9]。しかし、経口補給は吸収不良と最終的な低効率に悩まされることが多いです。科学的研究では、標準的な可溶性経口鉄補給戦略が動物の腸内マイクロバイオームの組成と代謝活性に強く影響することも報告されています[10]。一方、静脈内または筋肉内投与は、毒性副作用のリスクによって妨げられます[11]。さらに、工業的豚飼育では、鉄デキストラン単回投与を個別に筋肉注射する標準的鉄補給法が、動物にストレスを与え、飼育者にとって煩雑です。また、不適切な注射は動物に炎症やその他の合併症を引き起こし、無菌条件が守られない場合は様々な疾患の群内蔓延に寄与する可能性があります。

前述の外因性鉄送達の毒性副作用は、体内での遊離・非結合鉄の存在に関連しています。鉄は遷移金属として（価数変化を通じて）フェントン反応により有害なフリーラジカル（反応性酸素種-ROS）を生成する可能性があります[12]。科学的報告では、体内のフリーラジカル増加が細菌感染、腫瘍、肝疾患など様々な状態に寄与するリスク因子であることが示されています[13]。遊離鉄によるROS生成を防ぐ自然な生理的戦略は、鉄の吸収と輸送経路の各段階で特定のタンパク質と鉄を結合させることです。経口鉄過剰投与や静脈内/筋肉内投与の場合、鉄循環の生理的経路が一般的に圧倒され、ROSが急速に増加します[14]。

鉄ベースナノ粒子（FeベースNPs）は、医療目的での有望なツールとして広く研究されてきました。最も広範な用途は磁気特性に関連し、腫瘍イメージングや特定組織への蓄積を目的とした臨床診断技術の造影剤としてテストされてきました[15]。最近では、ナノ構造が生理活性物質を生物に送達する新しいより効果的な形態としても研究されています。NP担体は、バルク形態の物質と比較して、その小さなサイズに主に関連して、生物に対して相当なバイオアベイラビリティの向上を示す可能性があります[16,17]。ある研究では、貧血ラットにおいて鉄含有NPsの有効性と硫酸鉄（貧血治療の標準サプリメント）を比較しました。血液分析に基づき、貧血動物への鉄含有NPsの経口単回投与後に鉄バイオアベイラビリティが増加することが示されました。ナノ粒子と硫酸鉄の複数回投与では、結果は類似でした[18]。別の研究では、ヒトと齧歯類モデルにおけるFeベースナノマテリアルを代替鉄送達剤として記述し、可溶性鉄形態と比較したナノFeの優れた安全性、特に腸粘膜への鉄蓄積の欠如と有益な微生物叢の促進を強調しました[19]。同様に有望な結果は、ビタミンCでキャップされたFeベースNPsで治療した貧血ラットの研究で得られ、消化管からのFe吸収の標準経路を回避できました。結果は、標準的な鉄欠乏症療法と比較して短期間で検査動物が貧血から回復し、血液パラメータが改善したことを示しました[20]。

材料と方法

ナノ粒子の合成

鉄ドープ酸化亜鉛ナノ粒子（ZnO:Fe NPs）をマイクロ波水熱法で合成しました。この方法は確立されており、比較的安価、生体親和性が高く、工業的にスケールアップ可能で、様々な酸化物[26-28]に異なる外来イオンを機能性ドーパントとして導入できます[21-25]。現在のナノ粒子の鉄濃度は5 mol%に設定しました。合成は硝酸塩から開始しました：Zn(NO₃)₂·6H₂O（99%、Sigma-Aldrich）とFe(NO₃)₃·9H₂O（96%、Carl Roth）。最も均一な製品を提供し、測定可能なレベルの不溶性残渣を含まないサプライヤーを選択しました。化合物を蒸留水に溶解：硝酸亜鉛(V) 17.63 gと硝酸鉄(III)(V) 1.25 g。澄んだ溶液を25%水酸化アンモニウム水溶液（Carl Roth）でpH 8にアルカリ化しました。その結果生じた赤色残渣をビュッヒロートで約1 Lの蒸留水で洗浄し、吸引ろ過しました。沈殿物を100 mLテフロン容器に入れ、水を容器の80%まで満たし、Ertec Magnum IIリアクター室で密閉しました。マイクロ波水熱プロセスを4 MPaで20分間実施しました。反応後、淡赤色の生成物を回収し、60℃で一晩乾燥させました。

ナノ粒子の評価

走査型電子顕微鏡（SEM）、光ルミネセンス（PL）および陰極ルミネセンス（CL）分光法、エネルギー分散型元素分析（EDX）を用いて生成物を評価しました。SEM測定は、特性放射線検出器と陰極ルミネセンスシステムGATAN Mono CL3を搭載した高分解能（1 nm）日立SU-70顕微鏡で、二次電子（SE）および透過（TE）モードで実施しました。光ルミネセンス発光および励起スペクトルは、キセノンランプ励起源と浜松R928P光電増倍管を備えたHoriba/Jobin-Yvon Fluorolog-3分光蛍光計で記録しました。動的光散乱（DLS）とゼータ電位はDelsaMax Pro粒子評価システムで測定しました。熱重量分析（TGA）はアルゴンガスフロー下でNETZSCH STA 449 F1 Jupiter熱重量計で実施しました。SEM測定は、ナノ粒子をアガーポリカーボネートコート400銅メッシュに堆積させた後に実施しました。試料をSonics VCX500超音波プロセッサで蒸留水に分散させ、懸濁液の滴をメッシュに置いて乾燥させました。試料は2時間の重い粒子沈殿後に調製しました。

In vitroモデル

消化管上皮細胞モデルとして、Caco-2細胞株（コーカサス系結腸腺癌細胞）を使用しました。細胞株はECACC（Sigma-Aldrich、Cat. No. 86010202）から入手しました。細胞を0.5×10⁶ cells/mLで6ウェルまたは96ウェルプレートに播種し、Dulbecco's Modified Eagle's Medium-DMEM（Gibco）、10%胎仔牛血清-FBS（Gibco）、1%非必須アミノ酸-NEAA（Gibco）、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン-PSN（Gibco）、0.2%炭酸水素ナトリウム（Gibco）で補充し、37℃、5% CO₂で維持しました。95-100%コンフルエントになったとき、培地を除去し、新鮮な培地中のZnO:Fe NPs懸濁液を添加しました。ZnO:Fe NPsの4つの異なる濃度（1.0、0.1、0.01、0.001 mg/mL）で37℃、5% CO₂、24時間インキュベートしました。

細胞生存率解析

Caco-2の細胞生存率をXTTアッセイとトリパンブルー染色の2法で評価しました。XTTアッセイに必要な全試薬は市販キット（Cell Proliferation Kit II、Roche）から提供されました。96ウェルプレートで培養された細胞を異なる濃度のZnO:Fe NPsでインキュベートした後、50 μLのXTT標識混合液で37℃、5% CO₂、4時間インキュベートしました。その後、フォルマザン濃度を分光光度法で評価しました。吸光度を470/650 nmで測定し、結果を生存細胞数と相関付けました。以降の実験では、最高吸光度結果を細胞生存率100%とみなしました。最終結果は4回の独立実験複製（n=4）に基づいて計算しました。

トリパンブルー染色を行うため、6ウェルプレートで培養された細胞を異なる濃度のZnO:Fe NPsでインキュベートした後、細胞を回収（0.05%トリプシンと0.2% EDTAで10分）、遠心分離し、ペレットを1 mL培地に再懸濁しました。無菌0.4%トリパンブルー溶液100 μLと細胞懸濁液100 μLを混合しました。試料10 μLをカウントスライドに載せ、JuLi Brカウントソフトウェア（NanoEnTek）で生存細胞数を評価しました。最終結果は3回の独立実験複製（n=3）に基づいて計算しました。

動物モデル

この予備研究のために、成獣雄性Balb-cマウス（n=6）を標準的で管理された生活条件（12/12時間明暗周期、25℃、湿度30%、標準餌と水を自由摂取）で個別に飼育しました。全手順は地域倫理委員会の承認を受けました（承認番号 WAW2/59/2017）。7日間の馴化後、ZnO:Fe NPs水懸濁液（10 mg/mL、0.3 mL/マウス）を実験群（n=4）に経口強制投与（IG）しました。対照群には0.3 mL飲料水をIG投与しました（n=2）。実験中、試験動物に行動変化や組織異常は見られませんでした。24時間後、実験群と対照群の両方のマウスをCO₂-O₂チャンバー（CO2 Box、Bioscape、Merazet）で安楽死させ、組織を回収しました。新鮮に回収した試料の半分を-20℃で凍結し、原子吸光分析（AAS）用としました。残り半分を4%緩衝ホルマリンで固定し、24時間後に70%エタノールに移しました。その後、エタノール濃度を段階的に上げて脱水し、パラフィン（Leica TP1020、Leica EG1150）に包埋し、マイクロトーム（Leica RM2255）で6 μm厚（病理組織学的検査用は4 μm厚）のスライスを作製しました。

Perls染色による鉄蓄積評価

脾臓、肝臓、脳の顕微鏡スライスをPerls法（プルシアンブルー）で染色し、鉄の存在を検出しました。試料を脱パラフィン化し、蒸留水まで再水和させ、5%フェリシアン化カリウム（Sigma-Aldrich）と5%塩酸（Sigma-Aldrich）を等量混合した作業液に入れ、30分間染色しました。その後、水で洗浄し、核ファストレッド（Sigma-Aldrich）で5分間対比染色し、水で洗浄し、パーマウント（Fisher Scientific）でカバースリップ下にマウントしました。染色試料の画像をオリンパスBX60顕微鏡とCell^P画像取得ソフトウェアで撮影しました。各試験試料からランダムに選択した16枚の画像を、自社画像解析プロトコル[29]に従ってMicroImage v.4.0（オリンパス）でさらに検討しました。脾臓検査では、組織内の赤髄のみを解析対象としました。鉄含量を、画像内の鉄陽性染色（青色）の面積と強度の比を細胞核面積で割った値として計算しました。

原子吸光分析による試験組織中の鉄濃度測定

以前回収し、-20℃で保存し、その後解凍した組織試料を、以前詳細に記載されたプロトコル[24]に従って原子吸光分析（AAS）法で鉄濃度の定量評価のために調製しました。簡単に言うと、組織を秤量し、65%硝酸5 mLと30%過酸化水素1 mL（Merck）を含む溶液で16時間以上保持しました。その後、マイクロ波システムEthos 900（Milestone、米国）で鉱化して液体溶液とし、AAS（Perkin-Elmer）で鉄含量を評価しました。

統計解析

本研究で得られたデータを平均±平均標準誤差（SEM）で示しました。Perls染色で得られた鉄蓄積の統計的評価には、全群に対してTukey-Kramer多重比較事後検定を用いた一元配置分散分析を行いました。AAS解析からの対照群と実験群の有意差評価には、対応のないt検定を用いました。in vitro実験における対照群と実験群の有意差評価には、Dunnett多重比較検定を用いた一元配置分散分析を行いました。統計解析はGraphPad InStat 3.10で計算しました。全検定で、P≤0.05を有意、P≤0.01を高度に有意、P≤0.001を極めて有意としました。

結果

ナノ粒子の評価

マイクロ波水熱プロセスで結晶化したZnO:Feナノ結晶のSEM像を図1に示します。合成後に保存した乾燥粉末を超音波浴で水に分散させ、銅400メッシュに堆積させました。超音波処理による懸濁液を2時間放置し、大きな粒子の凝集と沈殿を促しました。試料では一般的に、細長い六方柱状のZnO結晶が見られます。結晶はc面成長方向[001]に延長しています。柱の断面は画像で明確に見え、六方形は50-100 nmのサイズです。基本的にナノ粒子は凝集してより大きな構造を形成します。図1bには、重度に凝集・集合したZnO:Fe結晶の構造が示されています。試料は不均一な粒子で構成され、そのサイズ分布は数百ナノメートルからマイクロメートルの間です。ZnO以外の明確な相（例：酸化鉄）の結晶化の兆候はなく、鉄ベース相の不在を示唆しています[30]。

室温から800℃までアルゴンフロー下で熱重量分析（TGA）と示差走査熱量測定（DSC）を実施し、結果を図2に示します。最初の質量減少は200℃までで、初期質量に対して4.78%の減少を引き起こしました。2番目の減少は200-400℃の間で記録され、その値は約7.36%です。800℃まで他の質量減少はありませんでした。最初は表面吸着水分子の蒸発に関連し、2番目は水酸基の還元によるものと考えられます。DSC曲線は118.3℃に吸熱ピーク（-0.6175 mW/mg、水の蒸発）と283.1℃に発熱ピーク（0.4356 mW/mg、水酸基の分解）を示します。分解に関連する小さな効果は、ZnO:Feナノ粒子のほぼ完全な結晶化がマイクロ波水熱プロセスで起こったことを示しています。

図3にZnO:Fe NPsの室温光ルミネセンススペクトルを示します。発光スペクトル（図3a）は2つの特徴で構成されます：低強度の狭いバンドエッジ近傍発光（NBE）と非常に強い広い深準位発光（DLE）です。前者は~380 nm、後者は600 nmでピークを持ちます。スペクトル上のDLE強度の優位性は、得られたナノ結晶が結晶学的に強く欠陥を持つことを示唆しています[31-33]。励起スペクトル（図3b）は、ZnO:Feのバンドギャップ内の深準位からの発光メカニズムを示しています。

ZnO:Fe NPsの陰極ルミネセンススペクトルを図4に示します。DLE/NBE強度比は≈25です。NBEバンドは約380 nm、DLEバンドは~570、625、653 nmにピークを持つ4成分と、770 nmに非常に弱い成分を含みます。McCluskeyとJokela[34]によれば、570 nmバンドは酸素欠陥に関連し、他のバンドはウルツ鉱型格子の亜鉛欠陥に割り当てられています[35]。

試料中の鉄量を原子吸光分光法（AAS）とエネルギー分散型X線分光法（EDX）の2手法で測定しました。AASの場合、齧歯類実験で使用したものと同様に調製した懸濁液を分析し、ZnO:Fe中に3.98原子% Feを示しました。EDX法では、銅メッシュ上の乾燥粉末を分析し、亜鉛イオンに対する鉄濃度が4.5 at%であることを確認しました。

懸濁液の特性をDLSとTEM法で測定し、ナノ粒子径の分布を図5に示します。分布は二峰性です：1つの集団では最頻径が20-100 nm（TEM）および50-200 nm（DLS）でピークを持ちます。2番目の集団はより少量の大きな物体（100-500 nm（TEM）、約150-500 nm（DLS））を含みます。両手法でナノ粒子の二峰性が明確に観察されます。100 nm以上の径の統計は、ZnO:Feナノ粒子が多くの異なる方法で凝集していることを示しています。水懸濁液中のナノ粒子は負に帯電しており、ゼータ電位が0 V未満で示されました。約-40 mVの値は、最終的な水懸濁液が安定で、ナノ粒子が凝集親和性を持たないことも示しています。

ZnO:Feナノ粒子のin vitro毒性評価

両細胞生存率解析（XTTとトリパンブルー）とも、ZnO:Fe NPsでインキュベートしたCaco-2細胞の吸光度低下を示し、これは生存細胞数の減少と直接相関しました。統計的に有意な変化は、最高濃度のNPs（1.0および0.1 mg/mL）に24時間曝露した後のみ観察され、生理的レベルのNPs濃度（0.01および0.001 mg/mL）は細胞培養に有意な影響を与えませんでした（図6、7）。

動物モデルにおける鉄分布

ZnO:Fe NPsからのin vivo鉄利用性を評価するため、マウス（n=4）にZnO:Fe NPs懸濁液を経口投与し、24時間後に安楽死させて重要な組織を回収しました。全回収臓器の鉄含量定量評価をAAS法で、肝臓、脾臓、脳組織をPerls染色に基づくMicro Imageソフトウェアで分析しました。図8に示すデータは、ZnO:Fe NPs経口投与24時間後に心臓、骨格筋、脾臓、小腸組織で鉄含量が増加（対照群比、統計的有意差なし）することを示しています。骨の場合、実験群の平均鉄レベルは対照結果よりわずかに高いのみでした。肝臓と脳組織の鉄含量は、対照群比で24時間後に有意に増加（P≤0.01）しました（図8）。腎臓、内臓および皮下脂肪組織、肺では、ZnO:Fe NPs投与24時間後にFeレベルが低下しました。

Perls法で染色した肝臓内の鉄含量評価では、全実験動物で対照群比で極めて有意（P≤0.001）なFe増加が明らかになりました（図9b）。同様に、脾臓赤髄組織の結果でも、全実験動物で対照群比で極めて有意（P≤0.001）な鉄含量増加を示しました（図10b）。脳組織の解析データでは、ZnO:Fe NPs IG投与24時間後の実験群でFe増加は見られませんでした（図11b）。

実験群と対照群の各動物の鉄含量結果を図9a、10a、11aにまとめました。肝臓組織内で最も高く有意に異なる（P≤0.05およびP≤0.01）鉄レベルは、マウス-2（24 h 2）で検出され、対照群結果と比較されました（図9a）。脾臓赤髄内の鉄染色レベルは実験群内で類似していましたが、ほとんどが対照群のマウス-1（CTRL 1）より統計的に高かったです（P≤0.05またはP≤0.01）（図10a）。脳組織の結果は、実験群と対照群の各動物間で類似していました（図11a）。

Perls法で染色した肝臓と脾臓組織切片を定性的に評価しました。実験群の肝臓切片では、肝細胞内に鉄沈着（淡青色染色）の増加が見られました（図12）。

対照群と実験群の両方で、脾臓の白髄よりも赤髄内での鉄の一般的な蓄積（青色染色）が観察されました（図13）。ZnO:Fe NPs投与後、対照群画像と比較して赤髄内で特に高い鉄レベルが見られました（図13c、d）。実験群では、血管周囲（図13b、d）にも鉄濃度の増加が見られました。

考察

「はじめに」で述べたように、鉄欠乏はヒト集団だけでなく他の哺乳類においても相当な栄養障害です[3,7,8]。したがって、新しいより効率的で安全な鉄補給戦略の実装は極めて望まれます。現在提示する結果は、生分解性ZnO NPsにFeをドープしたものを鉄補給の新戦略として利用する可能性を目指した予備研究から得られたものです。以前に確認されたように、自社製造の亜鉛ベースNPsは経口投与後に非常に効率的に吸収され、生体内の主要臓器と組織に迅速に分布します[22-24]。さらに、これらのナノ構造が体内で生物学的安全性と生分解性を示し、生体からの速やかなクリアランスを示すことも報告しました[36]。本研究で採用した経口NP投与法は、パーソーションプロセス[37,38]に基づく外因性ナノ構造の生体への高効率な迅速送達を提供します。さらに、この戦略は、消化管からのZnとFe吸収に関連する生理的「セキュリティメカニズム」の存在により、鉄ドープ物質投与に関連する最終的な毒性効果の可能性を低減します。この重要な鉄分布の生理的経路は、鉄ドープ物質の静脈内/筋肉内投与では回避される可能性があり[14]、鉄関連毒性副作用の発生可能性を高めることになります。ナノ粒子の内在化経路、その動態、関与する細胞システムの検討は、別の出版物の枠組みで現在進行中です。本論文では、ナノ粒子の生体への全体的効果、特に鉄への効果に焦点を当てて示すことにしました。

ナノ構造の毒性は、化学組成だけでなく、サイズ、形状、凝集能力など様々な材料特性に関連する可能性があります[39]。しかし、より小さなNPsの方がより大きなものよりよく吸収されることが確認されており、高い表面積/体積比により一部の金属粒子が例外的に反応性が高く細胞毒性を持つことになります[40,41]。ナノ構造は細胞に入り込み、その構成要素に影響を与え、細胞生存率を変化させる可能性があります[42,43]。ZnOまたはFeO NPsの細胞毒性に関する以前の調査の一つでは、著者らは高用量のNPsでも（検査細胞の増殖・分裂能力に基づく）毒性効果を観察しませんでした[44]。ここでは、消化管上皮細胞モデルとしてCaco-2細胞株を用いた研究を示し、使用ナノ材料の低毒性を明らかにしました。ZnO:Fe NPsの少量/生理的用量（0.001 mg/mLおよび0.001 mg/mL）は細胞生存率を変化させませんでした（図6、7）。Caco-2細胞を高用量のZnO:Fe NPsでインキュベートした後、生存率の統計的に有意な低下が観察されました。しかし、IC50（特定の生物学的または生化学的機能を阻害する物質の有効性の尺度である半最大阻害濃度）は驚くほど高く、約1 mg/mLのままでした（図6、7）。観察された細胞生存率の低下は、ナノ粒子自体の細胞毒性効果というより、ナノ粒子の表面への物理的堆積と細胞の過剰ストレスに関連していた可能性があります。別の研究では、著者らはZnOおよびZnO:Fe₃O₄ NPsインキュベート後の癌細胞株のIC50低下を結論付け、非癌細胞への検査NPsの比較的低い細胞毒性効果（非用量依存性）を報告しました[45]。ZnOおよび白金NPsについても類似の観察が報告されています[46,47]。それでも、抗酸化活性プロファイリング、反応性酸素種（ROS）産生、他の細胞および細胞株の使用を含む、このような複合体の慢性毒性プロファイルに関する更なる検討が必要です。

in vivo実験で得られた結果は、ZnO:Fe NPsが鉄恒常性に関連する主要な組織に迅速に分布することを示しました（図8、9、10）。「ナノ」形態からの鉄バイオアベイラビリティに関する類似研究は、主に貧血動物で実施されたか、鉄枯渇期間後に検討されました[18,19,48]が、我々の予備研究は健康で正常に維持されたマウスで実施しました。使用NPsの違い（サイズ、形状、組成、投与経路、用量、頻度）により、現在のデータを類似研究と比較することは誤解を招く可能性があります。肝臓の鉄レベル結果は、ZnO:Fe NPs投与24時間後に対照群比で有意に増加したことを示しました（図8、9）。鉄蓄積は肝臓組織の肝細胞で見られました（図12）、ここは元素の主要貯蔵部位です[49]。同様に、ラットに腹腔内投与した酸化鉄磁性NPsの以前の研究でも、注射6時間後にこれらのナノマテリアルの55%が肝臓に蓄積しました[50]。同様に、本研究では脾臓の鉄レベルが実験群で対照群より明確に高かったです（図8、10）。興味深いことに、脾臓内の血管周囲での鉄蓄積傾向が検出され、これはZnO:Fe NPsが全身血流から組織へ移行することを示唆する可能性があります（図13b、d）。投与後のナノ構造の肝臓と脾臓への一次的蓄積は、これらの組織での単核食細胞系によるクリアランスにも起因する可能性があり、以前にも仮定されていました[50-52]。

脳組織の場合、総鉄レベル測定（AAS法）では、以前にZnO:Fe NPsを投与した動物で元素レベルが有意に高かった（図8）が、Perls染色ベースの解析では確認されませんでした（図11）。研究で用いた両手法間の不一致は、Perls染色の感度に関連している可能性があります。この鉄可視化組織学的手法は鉄凝集体の検出専用です。生理的沈着なしに組織内に分布する「ナノ」形態の鉄は、これらの極めて小さな鉄沈着を染色するには感度が十分でない可能性があります。我々が製造したナノ構造による血液脳関門突破の可能性は既に記載されています[23,24,53]。別の研究では、マウスに超常磁性マグヘマイト酸化鉄NPsを腹腔内投与した場合、実験群での鉄蓄積は脳や心臓組織でも検出されず、我々の結果と矛盾します[52]。別の研究では、生体内での酸化鉄磁性NPsの分布パターンに焦点を当て、我々の研究と類似したナノ構造循環メカニズム（NPs投与後の脳と心臓でのFeレベル増加）を示しました[51]。心臓組織の鉄レベル増加は、ZnO:Fe NPsが全身血流に存在し、結果として組織内レベルが高まることによる可能性があります。同様に、AAS解析で検出された骨格筋の鉄レベル上昇は、この筋肉内の活発な血液循環に関連している可能性が高く、小腸の鉄含量改善は経口投与NPsの残留によるものです。

結論

結論として、鉄欠乏症における有望な新しい補給戦略として、生分解性ZnO:Fe NPsの分布に関する予備研究を実施しました。ナノ構造経口投与後のマウス体内での鉄沈着は、元素の主要貯蔵部位となる重要な組織で検出されました。本研究で得られた結果は、生分解性ZnO:Fe NPsが生体内での外因性鉄の良好な担体となり得ることを示唆しています。しかし、沈着、排泄、ZnO:Fe NPsが体に及ぼす影響の正確なメカニズムを完全に理解するには更なる研究が必要です。

略語

NPs:

ナノ粒子

ZnO:Fe NPs:

鉄ドープ酸化亜鉛ナノ粒子

IG:

経口強制投与

ROS:

反応性酸素種

SEM:

走査型電子顕微鏡

PL:

光ルミネセンス分光法

CL:

陰極ルミネセンス分光法

DLS:

動的光散乱

Caco-2細胞:

コーカサス系結腸腺癌細胞

DMEM:

Dulbecco's Modified Eagle's Medium

FBS:

胎仔牛血清

NEAA:

非必須アミノ酸

PSN:

ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン

EDTA:

エチレンジアミン四酢酸

AAS:

原子吸光分析

SEM（統計解析）:

平均標準誤差