胆管癌細胞の阻害のための活性酸素種感受性ナノファイバーマットを使用したピペロンギュミン溶出胃腸ステント

背景

通常胆管領域に由来する胆管癌（CCA）は、最も進行性の癌の1つと見なされています[1,2,3]。発がんと発生率の上昇の理由は、その発生率が世界中で増加しているにもかかわらず、依然として不明です[1]。 CCA患者のほとんどは進行状態で頻繁に診断されるため、CCA患者のごく少数の症例が外科的切除に適しています[2]。 CCA患者を治療するために、放射線療法、化学療法、金属ステント置換、免疫アジュバント療法などのさまざまな治療オプションが試みられてきました[3,4,5,6,7,8,9]。胆管は腫瘍の成長や炎症によって閉塞するため、前述の治療法の中で胆管閉塞を防ぎ、患者の生存率を延ばすためにステント留置術が頻繁に使用されます[10、11]。ただし、金属ステントには治療機能がなく、ステント内の腫瘍の異常増殖は通常、胆道閉塞を引き起こします。これらの問題を解決するために、多くの科学者が薬剤溶出性ステント（DES）を調査しました[12、13、14、15]。たとえば、Leeグループは、過去10年間にパクリタキセル溶出性胃腸（GI）ステントを調査しました[12、13、14、15]。パクリタキセル溶出ステントは、カバー付き金属ステントと比較してステントの開存性と患者の生存率にほとんど違いはありませんが、ブタの実現可能性と安全性の研究でパクリタキセル溶出ステントの受容性を観察しました[13、14、15]。キムら動物腫瘍異種移植モデルを使用してHuCC-T1CCA細胞に対してチロシンプロテインキナーゼ阻害剤であるソラフェニブを使用してDESを調査し、ソラフェニブ溶出ステントは動物腫瘍異種移植モデルで腫瘍増殖を阻害する効果があります[16]。 Kwak etal。ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤（ボリノスタット）溶出ステントは、HDACの発現を効果的に阻害し、アセチル化ヒストン（Ac-ヒストン）を誘導し、CCA細胞保有マウスモデルで腫瘍増殖を阻害することを報告しました[17]。新規抗がん剤または分子標的剤を含むDESは、依然として患者の生存率を延長するための魅力的なオプションです。さらに、刺激に敏感なナノファイバーマットまたはナノマテリアルも、抗がん剤を送達するために特別に調査されています[18、19、20]。ポリ（ジ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（PDEGMA）やポリ（ N ）などの感熱性ポリマーをベースにしたナノファイバー -イソプロピルアクリルアミド）ポリ（NIPAM）共重合体は、局所疾患部位での温度感受性薬物放出に適用できます[18、19]。 Bellat etal。自己組織化ペプチドナノファイバーは、RESキャプチャーが減少した優れた腫瘍ターゲティングで示されたと報告されています[20]。

疾患におけるROSの産生と細胞の抗酸化防御システムとの間の不均衡は、生物医学の分野で広く研究されてきました[21、22、23、24]。特に、癌の酸化ストレスも広範囲に調査され、レドックス感受性ドラッグデリバリーシステムに適用されています[23、24、25]。たとえば、ナノ粒子のポリマー骨格のチオエーテル基は、ROSにさらされると、疎水性から親水性に変化する可能性があり、ROS切り替え可能なナノ粒子はROSが豊富な環境の疾患に適用できます[25、26]。 Yu etal。癌細胞への特定のエンドソーム送達は、ROS応答性ポリマーミセルによって達成できる、すなわち、ROSが豊富な環境でコポリマーを疎水性から親水性に変換できることを報告しました。この現象は、より高い抗癌活性に続いて抗癌剤の急速な放出を誘発しました[27]。 。また、レドックス応答性ナノ光増感剤がグルタチオン（GSH）応答性を備えた光増感剤を特異的に放出し、光増感剤自体と比較してより高いROS生成を誘導することも以前に報告しました[28]。最近の研究では、ジセレニド結合を有するポリマーミセルは、ジセレニウム結合の崩壊を介してROSによって引き起こされる薬物放出を示し、ROS特異的な抗癌活性を示すことが知られています[29]。 ROSでトリガーされるナノ粒子は、抗がん化学療法の有望なプラットフォームと見なされています。

Piper longum に由来する天然化学物質であるPiperlongumine（PL） 、正常細胞に対する細胞毒性が低く、有望な抗癌活性を持っています[30]。 Raj etal。 PLの癌細胞選択的毒性は、PLが正常細胞と比較して癌細胞でROSを選択的に産生するという事実によるものであると報告しました。 PLは、癌細胞のDNA損傷とミトコンドリアの形態/機能の変化を誘発します[30]。さまざまな癌細胞に対するPLの抗癌活性が調査されています[31、32、33、34、35]。 Xiong etal。 PLはROSを著しく増加させ、アポトーシスタンパク質の誘導を通じて原発性骨髄性白血病細胞を効果的に阻害したと報告しました[35]。 PLは正常な細胞や臓器に対する毒性は低いですが、腎臓に悪影響を及ぼします[36、37]。さらに、血流中のPLの短い半減期も改善する必要があります[38]。

この研究では、レドックス応答性ナノファイバーコーティングステントを作製し、PLをナノファイバーマットにロードしました。酸化還元応答性のために、ジセレニド結合を有するLEseブロックコポリマーを合成し、DES用のナノファイバーマットを製造するために使用しました。腫瘍領域のROS含有量の増加は、薬物放出速度を加速し、ROSを介した癌細胞死を促進する可能性があります。

材料と方法

資料

PLはLKTLabsから購入しました。 Co。、（ミネソタ、米国）。ポリ（L-ラクチド）（PLA、PLA-0005、M.W。=5000 g / mol、製造元のデータから）はWako PureChemから購入しました。株式会社（大阪、日本）。メトキシポリ（エチレンリコール）-スクシンイミジルグルタレート（MePEG-NHS、M.W。=5000 g / mol）はSunbio Co. Ltd.（ソウル、韓国）から購入しました。胆道用のシリコン膜で覆われたステントは、M.I。 Tech。 （平沢、韓国）。ポリ（ε-カプロラクトン）（PCL、数平均MW =80,000 g / mol）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、N-（3-ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDAC）、テトラヒドロフラン（THF）、クロロホルム、ジメチルスルホキシド（DMSO）、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）、およびセレノシスタミン二塩酸塩はSigma-Aldrich Chemical Co.（St。Louis、MO）から購入しました。 、 米国）。透析膜または透析装置（M.W.カットオフサイズ（MWCO）1000 g / molおよび8000g / mol）は、Spectrum / Por Lab。、Inc。（CA、USA）から購入しました。すべての有機溶媒およびその他の化学薬品は、超高純度グレードとして使用されました。 RPMI1640培地やウシ胎児血清（FBS）などの細胞培養用品は、LifeTechから購入しました。 Inc.（米国ニューヨーク州グランドアイランド）。使用した試薬と有機溶媒はすべてHPLCグレードでした。

LEseブロック共重合体の合成

MePEG-セレノシスタミンコンジュゲート

MePEG-NHS（500 mg）を20mLのDMSOに溶解しました。 5当量を超えるセレノシスタミンを15mLの脱イオン水に別々に溶解し、5mLのDMSOと混合しました。その後、セレノシスタミン溶液をゆっくりとMePEG-NHS溶液に滴下し、24時間磁気攪拌しました。これに続いて、反応物を透析チューブ（MWCO 1000 g / mol）に導入し、大量の水に対して2日間透析しました。透析液を2日間凍結乾燥した。凍結乾燥した固体を使用してブロック共重合体を合成しました。

ブロック共重合体合成

PLA（500 mg）を等量のEDACおよびNHSを含む20mLのDMSOに溶解しました。この溶液を12時間磁気的に攪拌した。この溶液に、mPEG-セレノシスタミン固体（530 mg）を加え、さらに2日間撹拌した。これに続いて、反応物を透析チューブ（MWCO：8000 g / mol）に導入し、大量の水に対して2日間透析しました。透析液を2日間凍結乾燥した。凍結乾燥生成物をメタノール中で沈殿させて、未反応のmPEG-セレノシスタミンをもう一度除去した。最終収率は94％より高かった。収量=[（凍結乾燥固体の重量）/（PLAの重量+ mPEG-セレノシスタミンの重量）]×100。

ポリマーの特性評価

ポリマー合成を監視するには、 ¹ H核磁気共鳴（NMR）分光法を採用した。ポリマーをDMSO-dの形に溶解し、 ¹ で測定しました。 H-NMR分光法（500 MHz超伝導FT-NMR分光計、UnityInova 500、Varian Inc. Agilent Tech。、CA、USA）。

ポリマーの分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC、Waters GPCシステム、MA 01757、USA）で測定しました：Waters 1515 HPLC溶媒ポンプ、Waters 2414屈折率検出器、および3つのWaters Styragel高分解能カラム（HR4、HR2、HR1 ）。ポリマーを、溶離液として0.1 NLiBrを含む超高純度THFに溶解しました（流速1.0 mL / min）。ポリスチレンを使用して検量線を作成しました。

PLがロードされ、GIステントにコーティングされたナノファイバーマット

PLを搭載したナノファイバーマット

ボリノスタット（100 mg）を10mLのアセトン溶液に溶解しました。次に、この溶液にLEse（100〜400 mg）とPCL（600〜900 mg）を加え、2時間磁気攪拌しました。この溶液を使用して、ナノファイバーマットを製造し、エレクトロスピニングマシン（EBS ES-Biocoater; Nano NC、ソウル、韓国）を使用してシリコーン膜で覆われたステントにコーティングしました。エレクトロスピニングマシンは、高電圧電源、シリンジポンプ、X-Yロボットシステム、およびドラムロールコレクターで構成されています。シリンジ（NanoNC、24G）内のポリマー/薬剤溶液を、シリコーン膜で覆われた金属ステント（直径1 cm、長さ10 cm、回転速度500 rpm、噴霧速度100μL/分、電圧15 kV）に噴霧しました。ローリングコレクターに配置されます。 PLをロードしたナノファイバーメンブレンをステントにコーティングしました。残っている溶媒を除去するために、PLをロードしたナノファイバーコーティングステントを真空乾燥オーブンで24時間以上乾燥させました。 PLをロードしたナノファイバーコーティングステントは、次の研究まで4℃で保存されました。

PLをロードしたナノファイバーマットは、薬物放出と動物実験のためにステントから注意深く分離されました。空のナノファイバー膜は、同様の手順でPLの非存在下で調製されました。

薬物含有量は次のように測定されました：5mgのPLを組み込んだナノファイバーマットをDMSOに2時間溶解しました。 UV分光光度計（UV-1601、島津製作所、大阪、日本）を使用して、325nmでの薬物濃度を測定しました。空のナノファイバーマットもDMSOに溶解し、ブランクテストに使用しました。

薬物放出研究は、invitroでリン酸緩衝生理食塩水（PBS、0.01 M、pH 7.4）を使用して実施されました。ナノファイバーマットをディスクにカットし、10mgのディスクを50mLコニカルチューブ内の40mL PBS（0.01 M、pH 7.4）に浸しました。これを100rpm（37°C）の振とうインキュベーターに入れました。特定の時間間隔でナノファイバーマットから放出されたPLの濃度を測定するために、培地全体が採取されました。培地中のPL濃度は、UV分光光度計（325 nm）で測定しました。空のナノファイバーマットもブランクテストとして使用されました。放出研究では、過酸化水素を放出媒体に添加して、薬物放出速度に対するROSの影響を調査しました。

形態学

ナノファイバーマットの形態は、電界放出型走査電子顕微鏡（S-4800;日立、東京、日本）で25kVで観察されました。

細胞培養

SNU478、SNU245、およびSNU 1196 CCA細胞株などのヒトCCA細胞株は、Korean Cell Line Bank（ソウル、韓国）から入手しました。 HuCC-T1ヒトCCA細胞株は、Health Science Research Resources Bank（大阪、日本）から入手しました。すべての細胞は、10％の熱不活化FBSと1％のペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI1640で、37°C​​、5％CO ₂ で培養しました。 インキュベーター。

抗がん活性研究

さまざまなCCAセル（1×10 ⁴ ）96ウェルプレートに播種したものを使用して、PL自体、PLを組み込んだナノファイバーマット、またはナノファイバーマットから放出されたPLの抗がん活性を評価しました。細胞を5％CO ₂ で一晩維持しました 37°Cのインキュベーター。 PL処理では、DMSOに溶解したPL（10 mgPL / mL DMSO）をRPMI1640培地で希釈しました。 DMSOの最終濃度は0.5％未満でした。ナノファイバーマットから放出されたPLを処理するために、PLを組み込んだナノファイバーマットを50mLコニカルチューブ内の40mLPBSに浸しました。 ５日目および１５日目に、ＰＬ濃度を上記のようにＵＶ分光光度計で測定し、細胞を処理するために使用した。空のナノファイバーも、比較のために放出実験に適合させた。細胞は、PL自体またはナノファイバーマットから放出されたPLに2日間曝露されました。 CCA細胞の生存率はMTT増殖アッセイで評価されました。 30マイクロリットルのMTT溶液（5 mg / mL PBS、pH 7.4）をウェルに加え、細胞を5％CO ₂ で4時間インキュベートしました。 37°Cのインキュベーター。培地を廃棄し、100μlのDMSOを加えた。細胞生存率は、570 nmのマイクロプレートリーダー（Infinite M200 Proマイクロプレートリーダー、Tecan、Mannedorf、スイス）を使用して分析しました。細胞生存率は、8つのウェルからの平均±標準偏差として表されました。

ROS測定

CCA細胞におけるROS生成は、DCFH-DA法によってアッセイされました。 CCAセル（1×10 ⁴ 96ウェルプレートに播種された細胞）は、さまざまな濃度のPL自体、またはDCFH-DA（最終濃度20μM）を含むフェノールレッドを含まないRPMI培地でナノファイバーマットから放出されたPLで処理されました。 6時間または12時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、100μLの新鮮なフェノールレッドを含まないRPMI培地と交換しました。細胞内のROS含有量は、Infinite M200 proマイクロプレートリーダー（励起波長485 nm、発光波長535 nm）を使用した蛍光強度の変化によって分析されました。

ウエスタンブロッティング

CCA細胞のウエスタンブロッティングは以前に記載されたように実施された[31]。細胞は、PL自体またはナノファイバーマットから放出されたPLに24時間曝露されました。その後、トリプシン処理により細胞を回収し、冷PBSで洗浄し、遠心分離により回収した。ペレットを、50 mM Tris、150 mM NaCl、1％NP-40、0.5％デオキシコール酸、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）とフェニルメチルスルホニルフルオリド、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostics、バーゼル、スイス）を含む溶解緩衝液で溶解しました。 ）。この溶液を4°C（14,000× g ）で30分間遠心分離しました。 ）;次に、細胞溶解物（上清）を使用して、BCAタンパク質アッセイキット（Pierce、ロックフォード、イリノイ州、米国）を使用してタンパク質濃度を測定しました。タンパク質（50μg）をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にロードし、ポリビニルジフルオリド（PVDF）メンブレンに転写し、TBS-T中の5％スキムミルクでブロックし、適切な一次抗体でプローブして処理しました。二次HRP標識抗体を用いて1時間。免疫ブロットは化学発光によって検出され、ImageJソフトウェアプログラムを使用したデジタル分析で定量化されました。

腫瘍異種移植モデルを使用したinvivo研究

HuCC-T1保有マウス（BALB / cヌードマウス、5週齢、雄、体重18〜23 g、Orient、城南、韓国）を使用して、PLを組み込んだナノファイバーステントのinvivo抗腫瘍活性を評価しました。 1×10 ⁶ 100μLのPBS中のHuCC-T1細胞を、ヌードマウスの背中に皮下（s.c.）投与しました。固形腫瘍の直径が約4〜5mmになったときに、PLを組み込んだナノファイバーと空のナノファイバーのディスクを固形腫瘍の下に移植しました。 PLの投与量は10mgPL / kgでした。比較のために、PLをCremophorEL®/エタノール混合溶液（0.5％ v ）に溶解しました。 / v CremophorEL®および0.5％ v / v PBS中のエタノール（pH 7.4、0.01 M））。対照群には、腫瘍組織の横にPBSを皮下注射した。 PLを組み込んだナノファイバーと空のナノファイバーグループの場合、ナノファイバーディスクは次のように準備されました。同じ重さのナノファイバーウエハースを丸い円盤に切り、マウスの皮膚の裏側を注意深く切除しました（長さ0.5cm）。これに続いて、ナノファイバーウェーハが固形腫瘍組織の下に注意深く埋め込まれた。同等の状態にするために、対照治療とPL注射を行ったマウスは、腫瘍の横の皮膚（長さ0.5 cm）も切除しました。各グループは5匹のマウスで構成されていました。腫瘍体積は5日間隔で測定され、ナノファイバー移植の初日は0日目として設定されました。腫瘍体積は次の式で計算されました： V =（ a ×[ b ] ² ）/ 2。 a ：最大直径; b ：最小直径。

すべての動物実験は、釜山国立大学の動物実験委員会（PNUIACUC）のガイドラインに基づいて慎重に実施されました。この研究で使用された動物プロトコルは、PNUIACUCによって倫理的手順と科学的ケアに関して厳密にレビューされ、承認されました（承認番号：PNU-2017-1608）。

免疫組織化学

腫瘍組織は30日後に分離されました。次に、腫瘍組織を4％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色のためにスライスしました。免疫組織化学的染色は、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-9抗体などのアポトーシス関連タンパク質を使用して実施しました。抗体を1：100または1：200の希釈率で使用し、Envisionキット（Life Technologies、米国カリフォルニア州カールズバッド）を製造元のプロトコルに従って使用して染色を行いました。

統計分析

処理済みおよび未処理の細胞からのデータの統計分析は、学生の t を使用して実行されました。 テスト。 p 値<0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果

ポリマーの特性評価

PL溶出GIステントを作製するために、図1に示すようにLEseブロック共重合体を合成しました。MePEG-NHSをセレノシスタミンと反応させた後、末端アミン基をPLAのカルボキシル末端基と結合させました。 MePEG-セレノシスタミンコンジュゲートからの未反応のセレノシスタミンは、透析手順によって除去された。さらに、合成されたブロックコポリマーからの未反応のMePEG-セレノシスタミンコンジュゲートも、透析手順およびメタノール中での沈殿によって除去された。セレノシスタミンの特異的ピークはそれぞれ1.7ppmと2.9ppmで確認され、MePEGの特異的ピークも3.5〜3.7ppmで確認されました。 PLAを結合させた場合、PLAのメチル基は1.4ppmで確認されました。 PCLホモポリマーとLEseブロックコポリマーブレンドをブレンドして、ナノファイバーマットを製造しました。 LEseブロック共重合体とPCLホモポリマーのM.W.と組成を ¹ で測定しました。 H-NMR分光法とGPC。 M.W.推定の結果を表1に示しました。表1に示すように、LEseブロックコポリマーのM.W.は、 ¹ を使用してPEGのM.W.に基づいて推定されました。 H-NMR分光法（9760 g / mol）。 GPC測定では、LEseブロック共重合体のMnは8210 g / mol、Mwは9530 g / mol、1.16であることが示されました。

LEseブロック共重合体の合成スキーム

Piperlongumineを組み込んだナノファイバーコーティングGIステントの特性評価

図2と表2に示すように、PCLとLEseブロックコポリマーのさまざまな比率を使用して、ナノファイバーを製造し、GIステントにコーティングしました。 PCLホモポリマーは、凝集形態が最小限に抑えられた細くて薄いナノファイバーマットをもたらしました。 LEseブロック共重合体を添加すると、図2に示すように、顆粒や粒子などの凝集形態の一部が観察されました。LEse比が高くなると（75/25および60/40）、ナノファイバーマットはより厚く不規則な形態の繊維を示しました。構造。内容物中のLEseの比率が50％を超える場合、ポリマーは著しく凝集し、マットは深刻な不規則性を示しました（データは示していません）。 LEseブロック共重合体だけではナノファイバー構造はほとんど得られませんでした。したがって、ナノファイバー構造は、PCLホモポリマーとブレンドすることによって達成することができます。調製したPLを組み込んだナノファイバーマットの薬物含有量は、表2に示すように、理論値とほぼ同じでした。これらの結果は、PLを組み込んだナノファイバーマットがPCLホモポリマーとLEseブロックコポリマーの混合物から正常に製造され、GIステントにコーティングされたことを示しています。

a PLを組み込んだナノファイバーで覆われたGIステント。 b PLを組み込んだナノファイバーのFE-SEM写真

図3は、ナノファイバーマットからの薬物放出動態を示しています。図3aに示すように、PLは25日間にわたってナノファイバーマットから継続的に放出されました。ナノファイバーマットからのPLのバースト放出は、4日まで観察され、その後、PLはナノファイバーマットから25日目まで継続的に放出されました。ナノファイバーマット中のLEseブロックコポリマーの含有量が多いほど、ナノファイバーマットからのPLの放出が速くなりました。 LEseブロックコポリマーはPCLホモポリマーよりも疎水性が低いため、LEseブロックコポリマーの含有量が多いPCL / LEseナノファイバーマットは、PCLホモポリマーよりも膨潤させる必要があります。次に、LEseブロック共重合体の含有量が多いナノファイバーマットは、より速い薬物放出をもたらしました。さらに、LEseブロック共重合体のジセレニド結合はH ₂ などのROSによって崩壊する可能性があるため、ROSの存在下でPL放出速度を加速することができます。 O ₂ 、そしてこれらの要因は、ナノファイバーマットのレドックス応答性崩壊を誘発します（図3c〜e）。 PCLホモポリマーのナノファイバーマットは、H ₂ の添加に有意に反応しませんでした O ₂ つまり、PCLはH ₂ の影響をほとんど受けません。 O ₂ 添加;一方、LEseブロック共重合体をブレンドすると、ナノファイバーマットからのPL放出がH ₂ として大幅に加速されました。 O ₂ 追加されました。特に、図3c、d、およびeに示すように、ナノファイバーマットのLEseブロック共重合体比が高いほど、薬物放出速度が速くなります。これらの結果は、PLを組み込んだナノファイバーマットが生物学的環境においてレドックス応答性の薬物放出の可能性を持っていることを示しています。 PCL / LEseブロックコポリマー（60/40）で調製されたPLを組み込んだナノファイバーマットは、invitro細胞培養およびinvivo動物研究の後に使用されました。

a さまざまな組成のナノファイバーからのPL放出。 PCL / Leseの重量比はそれぞれ100 / 0、90 / 10、75 / 25、60 / 40でした。 b ナノファイバーマットからのPL放出に対する過酸化水素の影響（PCL /リース重量比は100/0でした）。 c ナノファイバーマットからのPL放出に対する過酸化水素の影響（PCL /リース重量比は90/10でした）。 d ナノファイバーマットからのPL放出に対する過酸化水素の影響（PCL /リース重量比は75/25でした）。 e ナノファイバーマットからのPL放出に対する過酸化水素の影響（PCL /リース重量比は60/40でした）

インビトロ抗癌活性

PLを組み込んだナノファイバーマットコーティングステントの抗癌特性を、さまざまなCCA細胞で評価しました。比較のために、ナノファイバーマットから放出されたPLを、放出実験中の5日目と15日目に抽出し、無傷のPLと比較しました。図4に示すように、5日目と15日目から放出されたPLの抗がん活性は、HuCC-T1細胞（図4a）、SNU1196細胞（図4b）、SNU478細胞（図4b）のすべてでPL自体と比較して有意に変化しませんでした。図4c）、およびSNU245セル（図4d）。 PL自体が10μg/ mLより高い濃度でより高い抗癌活性をもたらしたとしても、それらは細胞生存率においてほぼ同様の阻害能力を持っています。表3に、IC ₅₀ を示します。 PL自体の価値とナノファイバーマットから放出されたPL。 PL自体と同様に、5日目と15日目から放出されたPLは、薬物放出実験の15日まで抗癌活性を維持し、妥当なIC ₅₀ を示しました。 これらの値は、PL自体と比較して5日目および15日目からPLで徐々に増加したが、すべてのCCA細胞株での値。 H ₂ の存在下で、4日目と15日目からPLをリリースしました O ₂ PL自体と同様に抗癌活性も維持しました。これらの結果は、PLの抗癌活性が、生物学的環境におけるナノファイバー製造プロセスおよび薬物放出期間中に維持されたことを示した。さらに、ナノファイバーマットから放出されたPLは、PL自体と同様に、薬物放出期間の15日までROS生成能力を生み出しました（図5）。図5aおよびbに示すように、PL自体は5μg/ mLよりも高い速度でROSを大幅に多く生成しました。 5日目と15日目から放出されたPLもROSを生成しましたが、15日目から放出されたPLによってROS生成はわずかに減少しました。これは、PLを組み込んだナノファイバーマットが薬物放出期間中にPLの固有の抗癌特性を維持したことを示しています。

さまざまなCCA細胞の生存率に対するPLおよびナノファイバーマットから放出されたPLの影響。 a HuCC-T1、 b SNU1196、 c SNU478、および d SNU245胆管癌細胞。 2×10 ⁴ 96ウェルプレートの細胞をPLに曝露するか、ナノファイバーからPLを2日間放出しました。放出されたPLの処理では、PLを組み込んだナノファイバーディスクをPBSに浸漬し、10 mM H ₂ の有無にかかわらず、放出実験を5日間および15日間実施しました。 O ₂ 。薬物放出研究と同様に、培地は3日まで交換された。その後、放出実験の5日から15日の間に培地を収穫しました。このソリューションは、PL自体と放出されたPLの抗がん活性の比較を調査するために使用されました

HuCC-T1細胞のROS生成に対するPLおよびナノファイバーマットから放出されたPLの影響（ a ）およびSNU245セル（ b ）。 PL自体とリリースされたPLは、図3のように扱われました

図6は、HuCC-T1CCA細胞におけるアポトーシスタンパク質の発現を示しています。放出されたPL（5日）は、PL自体と比較してHuCC-T1細胞のアポトーシスの誘導において同様の活性を示します。つまり、BAX、カスパーゼ-3、7、および9の発現であり、切断されたPARP切断はPL（5日）とPL自体をリリースしました。これらの結果は、放出されたPLが、PL自体だけでなくCCA細胞に対しても妥当な抗癌活性を持っていることも示しています。

HuCC-T1細胞のアポトーシスのウエスタンブロット分析。細胞をPL自体で処理するか、ナノファイバーからPLを1日間放出した後、ウエスタンブロット分析を行いました

HuCC-T1腫瘍異種移植モデルに対するinvivo抗癌活性

HuCC-T1を有するヌードマウスは、図1および2に示すように、PLを組み込んだナノファイバーコーティングステントのinvivo抗癌活性を評価するために準備されました。 7 and 8. As shown in Fig. 7, the volume of HuCC-T1 tumor was gradually increased over 1 month. Growth of tumor volume in the treatment of empty nanofiber was almost similar with control treatment. PL injection properly inhibited tumor growth, compared to control treatment or empty nanofiber treatment. Especially, tumor growth was significantly inhibited by the treatment of PL-incorporated nanofiber, i.e., tumor mass in the treatment of PL-incorporated nanofiber was one third of control treatment. These results indicate that PL-incorporated nanofiber mats have superior potential in inhibition of tumor growth of CCA cells. Furthermore, the expression of caspase-3 and 9 was also increased in tumor tissues as shown in Fig. 8, indicating that released PL from nanofiber mats properly inhibited the growth of the tumor and induced apoptosis of tumor cells. Also, PL-incorporated nanofiber-coated stent has potential to inhibit CCA cells in vitro and in vivo.

The effect of PL solution, empty nanofiber mats or PL-incorporated nanofiber mats on the growth of HuCC-T1 tumor (a ) and the body weight changes (b ）。 HuCC-T1 (1 × 10 ⁶ cells) cells were implanted to the back of mice. PL dose was adjusted to 10 mg/kg. One hundred microliters of PBS or PL solution was s.c. injected beside the tumor tissue for control treatment and PL solution treatment, respectively. For empty nanofiber and vorinostat nanofiber implantation, wafers of the same weight were cut and then implanted under the tumor tissue. *p <0.001; **p  < 0.01

Immunohistochemical staining (× 400) of HuCC-T1 tumor tissues. Each tumor tissues were stained with BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP-1

Discussion

Abnormal accumulation of ROS in tumor epithelial cells induces carcinogenesis and affects surrounding cells or tissues which constitute tumor microenvironment [39]. Then, abnormal tumor microenvironment is the key player in proliferation, migration, angiogenesis, and metastasis of cancer cells [39,40,41]. An elevated level of ROS in tumor microenvironment induces oxidative stress and causes DNA damage [39]. Also, ROS is also correlated with cholangiocellular proliferation and oncogenic transformation [42]. Paradoxically, increased accumulation of intracellular ROS over toxic level induces apoptosis of cancer cells and tumor suppression [39,40,41,42]. For example, Thanee et al. reported that sulfasalazine as a cystine-glutamate transporter-target drug increased intracellular ROS level and then induced cell death [43]. They also argued that therapeutic efficacy of anticancer drug can be improved by blocking the mechanism of the cell’s ROS defensive system. Also, many research groups investigated ROS-producing small molecules such as melatonin, luteolin, chloroqine, and PL to suppress CCA growth rate by increasing intracellular ROS [44,45,46,47]. Thongsom et al. reported that PL stimulates ROS accumulation in CCA cells and induces cell death by activation of caspase-3 and PARP [47]. We also observed that PL increases the accumulation of intracellular ROS in various CCA cells as shown in Fig. 5. Increased ROS level induced apoptosis signals such as BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP (Fig. 6). The ROS-producing capability of piperlongumine was slightly decreased on day 5 and 15 as shown in Fig. 5. These results might be due to that piperlongumine is unstable in physiological solution, and then ROS-producing capability might have been slightly decreased. Additionally, physicochemical properties of piperlongumine may be affected during the fabrication process of the nanofiber. However, our results showed that ROS-producing capacity of piperlongumine was still maintained during the 15 days of drug release experiment.

Local treatment can be applied for patients with an advanced stage or unresectable stage of CCA [48]. Among various treatment options, DES is a promising candidate for unresectable CCA patients. However, conventional DES for GI tract has no tumor-targetable drug release function, and cytotoxic agent can be eluted in all areas of polymer membrane on the stent. Chemical, physical, or biological stimuli have been applied to induce altered drug delivery in the local region [49,50,51,52]. For example, Wang et al. used a magnitude of applied tensile strain to control drug release rate on the esophageal stent, i.e., increased drug release in a specific region was observed by propagating patterned crack of multilayered coating on the stent [49]. Thin film or nanoporous devices having stimuli-responsiveness such as pH and ionic strength were also investigated for application in DES [50, 51]. Chen and Huang reported that chitosan/poly(vinyl alcohol) hybrid nanofiber membrane was crosslinked with ally disulfide to endow reductant-responsiveness, and then hybrid nanofiber membrane showed favorable biological/material features [52]. We synthesized LEse deblock copolymer and fabricate redox-responsive nanofiber mats for local application in CCA tumors. PCL/LEse-blended nanofiber mats showed increased drug release behavior with responsiveness against H₂ O ₂ , indicating that drug release kinetics can be controlled by ROS level in cancer cells or tumor tissues. Furthermore, ROS-dependent drug release from nanofiber mats can be accelerated in tumor since PL is a ROS-producing agent. PL in the tumor may synergistically increase ROS level and then accelerate drug release from nanofiber mats. After all, ROS-dependent release of PL from nanofiber-coated stent synergistically inhibits CCA cells in vitro and in vivo.

Conclusion

We fabricated ROS-sensitive nanofiber mats-coated GI stent using PCL/LEse block copolymer blend. PL was incorporated in nanofiber mats by electrospinning technique. PL release from nanofiber mats was accelerated by addition of H₂ O ₂ , indicating that PL-incorporated nanofiber membranes have ROS-responsiveness. PL released from nanofiber mats at 5 days and 15 days showed appropriate anticancer activity even though its anticancer activity was slightly decreased compared to PL itself. As well as PL itself, PL released from nanofiber mats induced ROS generation and apoptosis of CCA cells. Furthermore, PL-incorporated nanofiber mats properly inhibited the growth of HuCC-T1 tumor in mice. We suggest PL-incorporated nanofiber mats prepared by PCL/LEse block copolymer blend as a promising candidate for local treatment of CCA cells.