ヒトの癌検出のためのデュアルターゲティング磁性ナノ粒子

要約

悪性腫瘍は人命への主要な脅威であり、高いリンパ管密度はしばしば転移性腫瘍と関連しています。リンパ管内皮ヒアルロナン受容体1（LYVE-1）やポドプラニンなどのリンパ系を標的とする分子の発見により、腫瘍転移におけるリンパ管内皮細胞（LEC）の役割を決定するために多くの研究が行われてきました。ただし、非特異性や高コストなどの欠点により、研究および診断アプリケーションが制限されます。この研究では、Fe ₃ O ₄ コアシェルタイプの磁性ナノ粒子である@KCTSは、Fe ₃を活性化することによって調製されました。 O ₄ カルボジイミドを用いて、α-ケトグルタル酸キトサン（KCTS）で架橋します。次に、LYVE-1およびポドプラニン抗体がこれらの磁性ナノ粒子の表面に組み込まれ、その結果、デュアルターゲティング磁性ナノプローブが開発されました。この研究の実験的試験は、腫瘍組織からの高純度LECを備えたデュアルターゲティング磁気ナノプローブの開発に成功し、結腸直腸癌治療およびバイモーダルイメージングを使用した早期臨床診断におけるLECの臨床応用の基礎を提供することを示しました。

はじめに

悪性腫瘍は人間の健康に大きな脅威をもたらします[1]。以前の研究では、腫瘍の微小環境が腫瘍関連の転移などの腫瘍の生物学的特性に影響を与えることが示されています[2、3]。しかし、潜在的なメカニズム、特にリンパ管内皮細胞（LEC）が腫瘍転移を促進するプロセスはまだ明らかではありません[4]。したがって、リンパ管を標的とすることに基づいて腫瘍の診断戦略を設計する必要があります。リンパ管特異的マーカー、特にLECと血管内皮を区別するマーカーの欠如は、LEC機能の研究を制限します。近年、リンパ管内皮ヒアルロン酸受容体1（LYVE-1）[5、6]、ポドプラニン[7]、血管内皮増殖因子受容体3（VEGFR-3）[8]、ProxなどのLEC特異的マーカー-1が確認されています[9]。これにより、特に腫瘍内リンパ管を標的にして腫瘍を診断することにより、腫瘍リンパ管の研究が加速されました。また、免疫磁気ビーズを使用して腫瘍内リンパ内皮細胞を選別することにより、腫瘍転移のメカニズムに関する研究を可能にしました[10]。ただし、分子病理学で使用される他の多くのマーカーと同様に、LECに関連する分子マーカーはいずれもLECに完全に特異的ではありません。核内でのProx-1の一過性発現のため[11]、臨床応用には適していません。 VEGFR-3はLECで発現しますが、血管上皮でも発現するため、癌ではリンパ系の特異性がありません[8]。 LYVE-1は、LECだけでなく、正常な肝類洞、脾臓内皮、高内皮細静脈、および活性化組織マクロファージでも特異的に発現しますが、血管上皮では発現しません[7]。ポドプラニンは血管上皮細胞では発現しませんが、LECの特異的マーカーです[7、12]。

磁性鉄鉄、ナノゴールド、量子ドット、リポソーム、および酸化チタンは、生体適合性が高く、比表面積が大きく、他の生物学的機能分子で修飾しやすいため、癌の診断と治療に広く使用されています[13、14]。上記の特性に加えて、磁性鉄鉄酸化物（Fe ₃ O ₄ ）は、サイズ分布が狭く、分散性が高く、常磁性が高く、サイズを制御できるため、磁気共鳴画像法に適しています[15]。その中で、抗体でコーティングされた超常磁性酸化鉄は、細胞の分離、認識、および腫瘍の早期診断に広く使用されています[16、17]。キトサンの表面は、天然の高分子物質としてヒドロキシル基やアミノ基が豊富で、生体適合性、血液適合性、安全性、微生物分解性などの優れた特性から広く利用されています[18]。したがって、キトサンまたはキトサン誘導体と磁性Fe ₃の組み合わせ O ₄ 磁性ビーズが互いに凝集して磁性流体を形成するのを防ぐことができるため、生物学的用途に適しています。このため、分散性能が向上します。

腫瘍研究では、腫瘍内のリンパ管の検出は、抗体による直接標識、またはリンパ管内皮細胞を分類するための磁気ビーズと組み合わせた抗体によるものに基づいています。ここでは、腫瘍内リンパ管をより正確にターゲットにするために、マルチターゲットナノプローブ、つまりリンパ管内皮細胞に対する2つの非常に特異的な抗体、抗Lyve-1抗体と抗ポドプラニン抗体を設計しました。これらの抗体は、キトサンでコーティングされた四酸化鉄ナノ粒子に結合しました。他のナノプローブと比較して、2つの抗体を含むこの研究で設計されたナノプローブは、リンパ管の検出により正確であり、したがって、単離されたリンパ管内皮細胞はより純粋です。

この研究では、ヒト癌細胞からのLECの迅速な濃縮と分離のために、抗LYVE-1抗体と抗ポドプラニン抗体に対して比較的高い特異性を持つリガンドを使用して、キトサンでコーティングされた超常磁性ナノ粒子への結合を促進し、磁性体を調製しました。 LECを選択するためのビーズ。また、プローブが固形腫瘍の二峰性診断が可能であることが確認されました。

材料と方法

細胞株および細胞培養条件

ATCCセルバンクから購入した結腸癌細胞株（HT29）は、10％ウシ胎児血清（Gibco、Grand Island、NY、USA）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で37°Cで培養されました。 Gibco、Grand Island、NY、USA）、100 U / mLペニシリン、および100μg/ mLストレプトマイシン、5％CO ₂ 。

実験動物モデル

40匹のNOD / SCID雌マウス（4〜6週齢）をBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Company（北京、中国）から購入しました。対数増殖期に増殖したHT29細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄した。トリプシンで消化した後、細胞を1000rpmで5分間遠心分離しました。次に細胞をPBSに再懸濁し、細胞濃度を2×10 ⁷ に調整しました。 / mL。各マウスに200μLの細胞懸濁液を注射しました。すべての実験プロトコルは、広西医科大学（広西チワン族自治区、中国）の動物倫理委員会によって承認されました。

Fe ₃の準備と特性評価 O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノプローブ

キトサン（Xi’an Ruixi Biotechnology）をα-ケトグルタル酸でカルボキシル化して、表面にCO基が豊富なα-ケトグルタル酸カルボキシメチルキトサン（KCTS）を得ました[19]。 Fe ₃ O ₄ （Xi’an Ruixi Biotechnology）をコアとして使用し、KCTSを基本的な骨格構造として設定しました。 Fe ₃をアクティブ化した後 O ₄ カルボジイミドを含むナノ粒子、Fe ₃ O ₄ @KCTSは、KCTS-COOHと表面-OHの共有結合を組み合わせて形成されました。選択したLEC抗体は、ヒトLYVE-1 APC結合抗体（R＆DSystems®、カタログ番号FAB20892A）および抗ポドプラニン抗体（FITC）（Abcam、カタログ番号ab205333）に特異的でした。これらの抗体は、カルボキシル化されたFe ₃に共有結合で架橋されました。 O ₄ アクティベートされたEDC / NHSを使用する@KCTS。その結果、LECの二重抗体で修飾された磁性ナノプローブ（Fe ₃と呼ばれる） O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノプローブ（0.1 mg / mL）が得られました。二重抗体結合ナノ粒子は、4°Cの暗所で保存されました。

調製したFe ₃の形態とサイズ分布 O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子は、透過型電子顕微鏡（TEM; H-7650、日本）を使用して評価されました。 Fe ₃の粒子サイズ（サイズ）、ゼータ電位、および粒子分散指数（PDI） O ₄ @ KCTS-二重抗体は動的光散乱法（DLS; PRO3000、日本）を使用して測定し、それらのフォトルミネッセンスは蛍光分光光度計（FL-7000、パーキンエルマー、米国）を使用して測定しました。

免疫組織化学および免疫蛍光

凍結組織切片を調製し、氷アセトンに10分間入れてから、PBS溶液に10分間浸しました。 1％BSAでブロッキングし、PBSで3回洗浄した後、切片をヒトLYVE-1 APC結合抗体および抗ポドプラニン抗体（FITC）と4°Cで30分間インキュベートしました。インキュベーション後、切片をPBS溶液に3回浸漬し、その後、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色溶液を腫瘍組織に添加して組織を完全に覆った。切片を再び室温で5分間インキュベートしました。その後、それらをＰＢＳで３回洗浄し、続いて切片が完全に乾燥したときに抗蛍光消光剤を添加した。最後に、切片をカバーガラスに取り付け、共焦点顕微鏡（Nikon DS-Ri1; Nikon、Tokyo、Japan）で観察しました。

ホルマリンで保存された結腸癌組織は、この研究のためにパラフィン包埋されました。 HT29癌異種移植片の脱ロウ切片を、3％過酸化水素でブロックし、5％正常血清でブロックし、抗LYVE-1抗体（Abcam、ab10278、UK）と4°Cで一晩インキュベートしました。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合スーパーストレプタビジンの標識試薬中のビオチン標識二次抗体ヤギ抗ウサギIgG H＆L（HRP）（ab205718）を30分間インキュベートしました。 3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）溶液を使用して色を測定しました。

細胞精製

腫瘍の平均体積は約1.5×1×1cm ³ でした。腫瘍を取り除く前に、マウスを75％エタノールに3〜5分間浸して消毒しました。消毒されたマウスの皮膚は、クリーンベンチ上で滅菌はさみと滅菌鉗子で切断された。腫瘍組織を注意深く切除し、PBSを含むペトリ皿に入れました。次に、浸した腫瘍組織を眼科用ハサミで切断し、滅菌プレートに入れた。細断した組織を、低温殺菌したチューブを使用して50mLの遠心分離チューブにピペットで入れました。次に、3倍量のコラゲナーゼIをチューブに加え、10分間ボルテックスして、コラゲナーゼIと腫瘍組織の混合物を得ました。次に、混合物を37°Cのウォーターバスに20分間入れ、これを5回繰り返しました。消化の終わりに、完全な培地を加えることによってコラゲナーゼIを停止し、混合物を2分間静置しました。 300 gで10分間遠心分離した後、腫瘍をPBSで2回洗浄し、10 mL PBSに再懸濁し、孔径75μm（200メッシュ）のふるいでゆっくりとろ過しました。ろ過した細胞をカウントし、平均して2本の15 mL遠心分離管に入れ、PBSに再懸濁し、300 gで10分間遠心分離した後、3回洗浄しました。（1）MACS磁気ビーズソート法：洗浄した細胞を100μLのバッファーに再懸濁しました。 PBS pH 7.2、0.5％BSA、および2 mM EDTAを含む溶液は、MACS BSAストック溶液（カタログ番号130-091-376）を自動MACS™リンス溶液（カタログ番号130）で1:20に希釈することによって調製しました。 -091-222）。次に、10μLのヒトLYVE-1 APC標識抗体を添加し、暗所で4℃で15分間インキュベートしました。最後に、2mLの緩衝液で3回洗浄しました。遠心分離後、80μLの緩衝液を加えて細胞を再懸濁し、20μLの抗APCフルオレセイン磁気ビーズ溶液を加えました。混合物を15分間インキュベートし、3回洗浄した後、遠心分離し、300μLの緩衝液と十分に混合しました。最後に、カラム内の陽性細胞を3mLの緩衝液ですばやくノックダウンしました。得られた細胞を6ウェルプレートで培養した。（2）Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子ソーティング法：洗浄した細胞を200μLのバッファーに再懸濁し、Fe ₃と混合しました。 O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子、暗所で4°Cで20分間インキュベートした後、4 mLバッファーで3回洗浄し、遠心分離し、160μLバッファーに再懸濁しました。最後に、磁石を使用して細胞を溶出し、6ウェルプレートで培養しました。

さまざまな方法で分類された細胞の蛍光抗体法

さまざまな選別方法で選別された細胞は、5×10 ⁴ の細胞濃度に調整されました。 PBSで/ mLにし、12ウェルプレートに均等に広げます。 1ミリリットルの細胞懸濁液を各ウェルに加え、37°Cで24時間5％CO ₂で培養しました。周囲。次に、古い培地を廃棄し、細胞をPBS溶液で3回洗浄した。次に、200μLの4％パラホルムアルデヒドを各ウェルに添加し、細胞を室温で10分間維持しました。次に、細胞をPBS溶液で3回洗浄し、ヒトLYVE-1 APC結合抗体、および抗ポドプラニン抗体（FITC）を添加しました。暗所で4°Cで2時間インキュベートした後、細胞を3回洗浄しました。さらに、50μLのDAPIを各ウェルに添加し、室温で10分間インキュベートして核を青色に染色した後、PBSで3回洗浄しました。最後に、抗蛍光消光剤をスライドの中央に落とし、細胞で覆われた側をスライドガラス上に置き、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して観察しました。

さまざまな方法でソートされた細胞のフローサイトメトリー

さまざまな方法で選別された細胞を、200μLの結合バッファー（10 mM HEPES / NaOH pH 7.4、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl）中のヒトLYVE-1 APC結合抗体および抗ポドプラニン抗体（FITC）抗体で再懸濁しました。、暗所で4°Cで1時間インキュベートした後、PBSで3回洗浄しました。細胞はフローサイトメトリー（BD Accury6; Becton Dickinson、San Jose、CA、USA）で検出および分析され、次にFlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.、Ashland、OR、USA）で分析されました。

LECアクティビティの検出

さまざまな方法で選別された対数増殖期細胞を収集し、消化し、カウントしました。細胞濃度を2×10 ⁵ に調整しました細胞/ mLおよびこれらの細胞の50μLをマトリゲルコーティングされたμスライドプレートの各ウェルに添加し、5％CO ₂でインキュベートしました。 37°Cで6時間のインキュベーター。培地を分離し、低温殺菌したスポイトで廃棄した後、1μg/ mLのカルセインAM（Invitrogen、カタログ番号c3099）を含むPBS溶液を添加しました。次に、細胞を室温で1時間暗所でインキュベートし、PBSで洗浄し、顕微鏡（Nikon、日本）で写真を撮りました。その後、1×10 ⁵ 細胞を20μg/ mLのDiI-ac-LDL（Molecular Probes、Invitrogen）を含む500μLの完全培地と混合し、24ウェルプレートに37°Cで4時間接種しました。古い培養液を除去し、細胞をPBSで3回洗浄した。次に、50μLのDAPI溶液を各ウェルに加え、室温で10分間インキュベートして、核を青色に染色しました。 PBSで3回洗浄した後、最終的に顕微鏡で画像化されました。

MR and Fluorescence Imaging In Vivo

次の手順に従って、腫瘍がFe ₃の標的になっているかどうかを判断しました。 O ₄ @ KCTS-LECs-動物における二重抗体磁性ナノ粒子。結腸癌のNOD / SCIDマウス皮下異種移植モデルを、磁気共鳴または蛍光スキャンに使用した。 T2強調画像は、3.0T MRIスキャナー（Discovery 750、gE、ドイツ）を使用して、視野（80×80 mm）、エコー時間（69 ms）、層の厚さ（2.0 mm）を含む特定の条件で実施されました。、直径40mmのマウスボリュームコイルを備えています。 NOD / SCIDマウスは2つのグループに分けられました（ n =3）;実験群と受容体遮断群。すべてのマウスにFe ₃を注射しました O ₄ @ KCTS-LECs-尾静脈を介した二重抗体（0.5 mmol / kg）磁性ナノ粒子。各マウスは、注射前、注射後0.5時間、12時間、24時間の4つの特定の時点でスキャンされました。受容体遮断群では、Fe ₃を注射する前に、各マウスに抗LYVE-1抗体（Abeam、ab10278、英国）と抗ポドプラニン抗体（Abcam、ab10288、英国）を注射しました。 O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体。 MRIスキャンは同じ4つの時点で実行されました。小動物のインビボイメージングシステム（Bruker、USA）を使用して蛍光画像を撮影した。グループ化、薬物注射、スキャンの時点は上記のとおりです。

Fe ₃の毒性 O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁気ナノプローブ

Fe ₃の毒性 O ₄ @ KCTS-LECs-LECに対する二重抗体磁性ナノプローブをCCK-8アッセイで評価しました。細胞（100μL培地、2×10 ⁵ / mL）は、96ウェルプレートで37°C、5％CO ₂を含むヒト化雰囲気で一晩培養しました。、次にFe ₃で処理 O ₄ @ KCTS-LECs-同じ条件下で24時間または48時間の二重抗体磁性ナノプローブ（0.1、0.5、1.0、2.0 mg / mL）。インキュベーション後、10μLのCCK-8溶液を各ウェルに加え、さらに2時間インキュベートしました。光学密度（OD）は、ELISAマイクロプレートリーダー（Thermo Scientific、USA）によって450nmで測定されました。

Fe ₃の毒性を評価するには O ₄ @ KCTS-LECs-invivoでの二重抗体磁気ナノプローブ、NOD / SCID雌マウスに200μLPBS（対照群）またはFe ₃の単尾静脈注射を行いました O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁気ナノプローブ（2 mg / mL）（ n =グループあたり3匹の動物）。 1週間後、マウスを犠牲にし、主要組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓）の切片を採取し、10％ホルムアルデヒド溶液に浸し、脱水し、パラフィン包埋しました。パラフィン処理した切片（厚さ4μm）を切り取り、ヘマトキシリン-エオジンで染色しました。

日付分析

データ分析にはSPSS16.0統計ソフトウェアを使用しました。測定データはx±sで表され、グループ間の比較は分散分析によって行われ、カウントデータの比較はカイ二乗検定によって行われました。 P <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果

ヒトの癌を検出するためのデュアルターゲティング磁性ナノ粒子の原理

この研究では、スキーム1に示すように、Fe ₃ O ₄ コアシェルタイプの磁性ナノ粒子である@KCTSは、Fe ₃を活性化することによって調製されました。 O ₄ カルボジイミドを用いて、α-ケトグルタル酸キトサン（KCTS）で架橋します。次に、LYVE-1およびポドプラニン抗体をこれらの磁性ナノ粒子の表面に添加し、それによってデュアルターゲティング磁性ナノプローブを形成しました。これらのプローブを尾静脈からマウスモデルに注入し、T2強調MRイメージングと蛍光イメージングによって腫瘍を診断しました。切除後、腫瘍を粉砕して単一の細胞にし、プローブとインキュベートして磁石でより純度の高いリンパ球内皮細胞を同定し、腫瘍転移のメカニズムを調べました。結果は、腫瘍組織から高純度のLECを提供するデュアルターゲティング磁気ナノプローブの開発に成功し、結腸直腸癌および結腸直腸癌のデュアルモードイメージングによる早期臨床診断におけるLECの臨床応用の基礎を提供することを示しました。

Fe ₃の特性評価 O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子

TEM画像（図1a）は、裸のFe ₃ O ₄ 球形で不規則であり、粒子間に凝集物があります。 Fe ₃の場合 O ₄ KCTSによって変更され（図1b）、粒子は規則的な球形または楕円形であり、粒子は均一に分散していました。図1cに示すように、Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子はFe ₃の表面に負に帯電した抗体で修飾されました O ₄ 負電荷を与える@KCTSにより、ナノ粒子間の静電反発力が増加します。 Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子は球状で均一であり、粒子の凝集がなく、損傷を受けていませんでした。平均直径は91.28±2.31nm、PDIは0.207±0.015でした（図1d）。この図は、ナノ粒子のサイズ分布が狭く、水中での分散が良好であることを示しています。負に帯電した表面のゼータ電位は-32.8±1.51mVで、絶対値は-30を超えており、材料の安定性が良好であることを示しています（図1e）。

蛍光分光計の結果を図1fに示します。明確な発光ピークは、488励起光下の抗ポドプラニン抗体（FITC）、および545励起光下の抗LYVE-1抗体（APC）で観察されました。 Fe ₃の発光ピークの存在 O ₄ @ KCTS-LECs-488および545励起下の二重抗体複合体は、材料が正常に結合されたことを示します。

免疫組織化学および免疫蛍光

図2a、bに示すように、結腸癌組織でのLYVE-1の発現と、凍結腫瘍組織でのLYVE-1およびポドプラニン抗体の発現が観察されました。これは、少量のリンパ管内皮細胞が結腸癌組織に存在することを示しました。

LECの分離と強化

免疫蛍光染色は、2つの異なる選別方法によって得られた細胞で実行されました。 LYVE-1 MicroBeads磁気ビーズによって選別された細胞はタンパク質LYVE-1を発現しましたが、ポドプラニンは発現していませんでしたが、Fe ₃によって得られた細胞は O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子は、タンパク質LYVE-1とタンパク質ポドプラニンを発現しました（図3a）。さらに、さまざまな方法で選別された細胞のフローサイトメトリーの結果を分析しました。図3bに示すように、LYVE-1 MicroBeads磁気ビーズによるタンパク質LYVE-1とタンパク質ポドプラニンの共発現率は71.2％でしたが、Fe _{3で選別して得られた2つのマーカーの共発現率は} O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子は88.9％でした。 2つの独立したサンプル t テストでは、2つのグループ間に統計的に有意な差があることが示されました（ P <0.05）（図3c）。

2つの異なる並べ替え方法で取得されたLECの生物学的機能の比較

さらに、2つの異なる選別方法で得られたリンパ管内皮細胞の生物学的特性を比較しました。マトリゲル接着剤チューブのテスト結果を図4aに示します。 Fe ₃で選別して得られた細胞 O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子はより強い管形成能力を持っていました。図4bに示すDil-ac-LDL内皮細胞取り込みアッセイの結果は、LYVE-1 MicroBeads磁気ビーズで選別された細胞では赤色蛍光が観察されたが、Fe 3 O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子。これらの結果は、Fe ₃によって得られた細胞が O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子は、純度が高く、管形成能が高く、内皮細胞の食作用があり、腫瘍のリンパ管内皮細胞の研究に適していることを示しています。

InVivoでのバイモーダル画像解析

インビボイメージングの結果を図5aに示します。 Fe ₃を注入する前は、腫瘍からの蛍光がないことがわかりました。 O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子。注射後、腫瘍からの蛍光が増加し、12時間でピークに達しました。その後、蛍光は時間とともに徐々に減少した。対照の閉鎖群では、実験を通して腫瘍からの蛍光はほとんどなかった。 24時間後、両方のグループのマウスの体から物質が完全に代謝されたことが観察されました。同様に、図5bに示す磁気共鳴画像法では、腫瘍画像法が徐々に弱まり、12時間後に最も弱いレベルに達し、その後徐々に回復することが明らかになりました。ただし、コントロールの閉じたグループの腫瘍のイメージングパワーはほとんど変化していませんでした。 Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子はinvivoで高い腫瘍標的特性を示しました。

磁性ナノ粒子のinvitroおよびinvivo毒性

磁性ナノプローブのinvitro細胞毒性は、Fe ₃によって分類されたLECで評価されました。 O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子。 CCK-8アッセイの結果は、さまざまな濃度の磁性ナノプローブとのインキュベーション後、細胞の生存率が高いことを示しました（図6a）。これは、Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子の細胞毒性は最小限です。さらに、invivoでの磁性ナノ粒子の毒性を評価しました。雌のNOD / SCIDマウスを磁性ナノプローブで処理し、ヘマトキシリン-エオジンで染色した後の主要臓器の組織切片を調べました。図6bに示すように、壊死や炎症の明らかな兆候は観察されませんでした。これらの結果は、磁性ナノプローブがインビボで毒性作用を生じなかったことを示唆した。これらの発見は、この研究で設計された磁性ナノプローブが、動物および人間の調査における検出プローブとしての適用に適していることを示しています。

ディスカッション

リンパ系を介した輸送が腫瘍細胞増殖の重要な経路であることは長い間知られていました。ただし、血管内の血管内皮細胞（BEC）と比較して、リンパ管の主要なコンポーネントとしてのLECは十分に研究されていません。 LECマーカーを特定すると、LECの調査が容易になり、BECとの区別が容易になります。 LYVE-1は、322個のアミノ酸残基で構成されるI型無傷の膜貫通型糖タンパク質受容体であり[20、21]、現在、最も特異的なリンパ管内皮細胞マーカーであると考えられています[22、23]。ポドプラニンは、分子量38kDaのI型膜貫通型唾液ムチン様糖タンパク質です。現在の研究では、ポドプラニンはリンパ管と血管を非常によく区別できることが示されています[24、25]。したがって、LECを識別するために他のリンパマーカーと組み合わせることができます。この研究では、2つの抗体を使用してLECを分類し、分類された細胞の純度は、蛍光抗体法の共局在、フロー二重染色、および共発現によって検証されました。 Fe ₃でソートされたセル O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子は、LECと同様の生物学的特性を示し、より強力な管形成能力とより優れた食作用能力を示しました。

最近、免疫磁気ベースの精製方法が混合培養から異なる細胞を分離するために使用され、LYVE-1またはポドプラニン抗体でコーティングされた磁気ビーズが粗細胞集団から特定の亜集団を分離するために使用されました[10、26]。これらの方法は、混合培養からターゲットサブグループのみを精製します。これは、LECの不完全な分離につながるだけでなく、血管内皮細胞などの異種細胞の汚染を引き起こす可能性があります。さらに、これらの方法は時間と費用がかかります。以前に、いくつかの特定のリンパ系マーカーが報告されました。たとえば、LECは、主にコラゲナーゼ処理によってさまざまな組織から分離されました。ただし、初代培養中に、コラゲナーゼ処理により、血管内皮細胞や間質細胞などの細胞の混合物が生成される場合があります。

この研究では、Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-ダイアボディ磁性ナノダブルターゲティングプローブは、リンパ管内皮細胞に発現する特異性の高い標的分子LYVE-1およびポドプラニンに結合するキトサン被覆酸化鉄を使用して構築されました。電子顕微鏡分析は、プローブが均一な外観と良好な分散性を有することを示した。ゼータ電位は、分子プローブの安定性を反映しています。非常に正または負のゼータ電位値は、高い安定性と低い凝集能力を反映しています。一般に、ゼータ電位が+ 30mVを超えるか-30mV未満の分子は良好な安定性を持っていると考えられています。この実験では、プローブのゼータ電位は−32.8±1.51mVでした。これは、プローブの安定性が良好であることを示しています。

Fe ₃ O ₄ は磁性ナノ粒子酸化物であり、その独特の物理的特性により、現代医学や生物学で広く使用されています。特に、磁気共鳴画像法や磁気温熱療法に基づく診断システムや、細胞分離アプリケーションで使用されます。 MRイメージングで使用される造影剤は、常磁性酸化鉄ナノ粒子（T2陰性造影剤）とGd化合物（T1陽性造影剤）に分けることができます。 Fe ₃ O ₄ ナノ粒子共鳴造影剤はR2強調と見なされ、その性能は、（a）組成、（b）NPサイズ、（c）表面コーティング、および（d）生成される相乗的磁気効果などのいくつかの要因によって影響を受けることがよくあります。複数の超常磁性Fe ₃ O ₄ NPは少量で集中します[27]。また、磁場効果による標的細胞の選別にも使用できます。つまり、標的細胞を特定のプローブと組み合わせた後、磁石吸着により標的細胞を選別します。たとえば、この研究で設計されたプローブを使用して選別されたリンパ管内皮細胞は、より優れた管形成能力および内皮細胞食作用を有していた。緩和パラメータR1またはR2は、通常、MRI造影剤の品質を測定するために使用されます。これは、造影剤T1またはT2の緩和時間の能力を表します[28]。現在のNPベースのT1造影剤は細胞毒性に関連しており、より優れた代替品の必要性を生み出しています。 Fe ₃ O ₄ 上記のセリウムベースの材料と比較して、優れた生体適合性を提供します[29]。この研究では、Fe ₃の表面でキトサンによって修飾されたナノプローブのinvitroおよびinvivo毒性を研究しました。 O ₄ 。我々の結果は、プローブが特定の細胞の選別に適しており、毒性が低いことを示した。したがって、選別された細胞の培養やリンパ管を介した腫瘍転移のさらなる研究に使用できる理想的な材料です。

ここでは、ペプチド、抗体、アプタマーなどの特定の標的分子が磁性ナノ材料の表面に付着し、それによって腫瘍の診断と治療が容易になりました[30、31]。この研究により、Fe ₃の構築に成功しました。 O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁気ナノ-二重ターゲティングプローブ。このプローブは特定の標的分子に結合する可能性があるため、リンパ管内皮細胞の分離やMR /蛍光イメージングに使用できます。

結論

要約すると、人間の癌を検出することができるデュアルターゲティング磁性ナノ粒子は、この研究で提示されます。磁性ナノ粒子プローブは、高いバイオセーフティと安定性を示します。プローブは特定の標的分子に結合する可能性があり、それによってリンパ管内皮細胞の選別が可能になります。自作の磁気ビーズを組み込むことによってカスタマイズされた二重抗体コーティングにより、純粋なLECの分離が可能になり、選別時間が短縮され、細胞活性が向上し、コストが削減されました。これらの発見は、この研究で設計された磁性ナノプローブが、動物および人間の調査における検出プローブとしての適用に適していることを示しています。この研究は、リンパ節転移のメカニズムと腫瘍におけるリンパ管内皮細胞の役割を研究するためのプラットフォームを提供します。さらに、Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-二重抗体磁性ナノ粒子は、invivoでの蛍光/ MR分子イメージングに適用でき、癌の臨床診断を可能にします。