トリプルネガティブ乳がん細胞へのロバスタチンとドキソルビシンのプルランナノ粒子を介した同時送達の相乗的に増強された阻害効果

はじめに

トリプルネガティブ乳がん（TNBC）は、エストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PR）、およびヒト上皮成長因子受容体2（HER2）を欠き、他の乳がんサブタイプよりも予後が悪い乳がんの特殊なサブタイプです。 1,2,3]。利用可能な標的療法は、主に腫瘍細胞の表面にある特定の受容体を標的にすることに依存しています。 TNBCには、治療のための積極的なターゲティングのための特定の表面マーカーがないため、他のターゲティングアプローチを検討する価値があります。たとえば、固形腫瘍に対する独自の強化された透過性と保持（EPR）効果を伴うパッシブターゲティング[4]により、特定のサイズ範囲の粒子が腫瘍部位をターゲティングできます[5、6]。ナノ粒子（NP）は、EPR効果を利用して、固形腫瘍部位に富むようになることができる一種の薬物担体です[4]。

最近、高脂血症の治療に使用される親油性スタチンの1つであるロバスタチン（LV）[7]が、癌幹細胞を標的とすることによりTNBCを選択的に阻害することを示しました[8、9]。さらに、NPカプセル化は、乳がん細胞移植のマウスモデルにおいて、TNBCに対するLVの阻害効果を増強できることを実証しました[8]。私たちの研究は、以前の発見[10、11]とともに、親油性スタチン、特にLVは、TNBC治療のための抗がん剤として再利用できることを示唆しています。ただし、LVが化学療法抵抗性を克服できるかどうか、またはTNBCにおける化学療法薬の治療効果を高めることができるかどうかは不明です。

LVと、ドキソルビシン（DXR）、5-フルオロウラシル[12]、シスプラチン[13]、1-β-D-アラビノフラノシルシトシン[14]などのさまざまな種類の化学療法剤との相乗効果がさまざまながん細胞タイプで報告されています。 DXRは、DNAに結合し、核酸合成を阻害するという複雑な機能を備えたアントラサイクリン化合物です。さらに、LVはDXRとの相乗作用で卵巣癌細胞のアポトーシスを誘導しました[15]。また、LVは排出タンパク質P糖タンパク質の直接阻害剤であり[16]、細胞外コンパートメントにDXRを容易に排出できるATP駆動ポンプです[17、18]。したがって、LVは他の治療薬の治療効果を高める可能性があり、LVとこれらの薬剤の組み合わせはTNBCに対する治療効果を高める可能性があります。

現在の併用療法は課題に満ちています。一方では、併用化学療法は、化学療法薬の代謝が速く、水溶性が低く、生物学的利用能が低いため、深刻に制限される可能性があります[19、20]。他方、薬物動態、膜輸送特性、および異なる薬物の非特異的生体内分布が変化するため、個々の細胞において投与された薬物の十分な濃度および特異的比率を達成することは困難である[21、22、23]。これらの要因は、併用療法の治療効果と相乗効果または拮抗作用のレベルに影響を与えます。 2つの治療薬をナノスケールの薬物担体に同時カプセル化することは、担体にロードされた薬物が相乗効果の正しい比率を維持できるようにするため、これらの課題を克服する効率的な方法です[24、25]。

共カプセル化されたナノキャリアには、主にリポソーム、高分子ミセル、およびマイクロスフィアまたはナノスフィアが含まれます[26、27、28、29]。高分子ミセルは、その優れた性能（たとえば、化学的に結合され、物理的にカプセル化された二重薬物負荷、高い薬物負荷、および高い生体適合性）のために、多くの注目を集めています[26、30]。以前の研究では、生体適合性の高い親水性多糖類であるプルランを使用して一連のNPを準備し、それらの薬物放出挙動に対するさまざまな要因の影響を研究しました[31]。この現在の研究では、プルランとLVの異なる飼料要求率を持つ新規PLV高分子ミセルを準備し、サイズとゼータ電位および形態の分布を特徴づけました。 EPR効果を使用することを前提として、細胞によって内在化される可能性が高いため、DXRをロードするために結果として得られる最小のNPを選択しました。さらに、異なるpH値の培地におけるPLV / DXR NPの薬物負荷量、カプセル化効率、および薬物放出量を測定しました。 FITCをロードしたPLV / DXR NPの細胞取り込みを評価して、腫瘍細胞へのNPの侵入、DXRとLVの組み合わせの相乗作用、およびMDA-MB-231（TNBC）とMDA-MBに対するNPの細胞毒性を調べました。 -453（非TNBC）細胞（スキーム1）。

ナノ粒子（NP）とinvitro細胞実験の概略図。プルラン-ロバスタチン（PLV）NPは、水溶液中でプルランとLVによって形成されたポリマーの自己組織化によって形成されました。 NPを形成する過程で、DXRはNPの疎水性コアにロードされました。次に、PLV / DXRを使用して、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）および非TNBC細胞をそれぞれ表すMDA-MB-231およびMDA-MB-453細胞を用いたinvitro細胞実験を行いました

材料と方法

資料

プルラン（200 kDa）は林原（東京）出身。 LVおよびDXR塩酸塩は、J＆K Scientific（北京）から入手しました。 1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDCI）および4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）は、アラジン試薬（上海）から入手しました。溶媒などの他の試薬は、Sinopharm Chemical Reagent Co.（北京）から入手しました。乳がん細胞株MDA-MB-231（TNBC）およびMDA-MB-453（非TNBC）は、上海生物科学研究所の細胞資源センターから購入しました。 CellTiterBlue試薬はPromega（Madison、WI、USA）から入手しました。ダルベッコの改良イーグル培地（DMEM）（Cat＃SH30022.01）はHyClone（USA）からのものであり、ウシ胎児血清（FBS）（Cat＃04-001-1ACS）はBiological Industries（Israel）からのものでした。

LVグラフトプルラン（PLV）の合成

まず、LVコハク酸モノエステル（LV-SA）を以下の手順で合成しました。簡単に説明すると、0.60 gの無水コハク酸（SA、6.0 mmol）と2.0 gのLV（5.0 mmol）を20 mLの無水ピリジンに溶解し、50°Cで48時間撹拌しました。得られた反応液を、絶えず撹拌しながらpH3の1500mL氷河HCl溶液にゆっくりと注ぎ、大量の白色沈殿物を沈殿させ、懸濁液のpHを濃HClでpH 3に調整し、続いて真空濾過した。 。次に、沈殿物をpH-3の氷塩酸溶液で洗浄し、次にddH ₂ で洗浄した。 Oを中性にして粗生成物を得る。最後に、粗生成物をアセトン－水溶媒系から再結晶化して、純粋なＬＶ－ＳＡを得て、収率は７２％であった。 PLVは、LV-SAとプルランのモル比が1 / 2、1 / 3、および1/4の場合に、LV-SAのカルボン酸基をプルランのヒドロキシルと結合させることによって生成されました。簡単に説明すると、0.5 g（1.03 mmol）で調製したLV-SA、0.15 g DMAP（1.23 mmol）、0.24 g EDCI（1.23 mmol）を20 mLのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、50°Cで4時間撹拌しました。プルラン（0.33 g、1/2; 0.50 g、1/3; 0.67 g、1/4）をDMSOに溶解し、2％（w / v）溶液を得た。次に、プルラン溶液を反応溶液にゆっくりと加え、50℃で48時間反応させた。反応混合物を透析バッグ（MWCO =8〜12 kDa）に入れ、25％エタノール/水および水に対して透析しました。次に、サンプルを凍結乾燥しました[32]。プルランに対するLVの供給比が異なるPLVコンジュゲートは、FTIR分光光度計（KBrペレット、Nicolet、TM Nexus 470-ESP、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）を使用したFTIR分析によって特性評価されました。 PLVコンジュゲートは ¹ によっても確認されました H NMR分光法（DMSO-d6溶媒、BRUKER AVANCE-500、Bruker、Billerica、MA、USA）、および各コンジュゲートのLVの置換度（DS）を計算しました。

NPの準備と特性評価

50mg量のPLVコンジュゲートを12.5mLのDMSOに溶解し、37°C​​で穏やかに振とうしながら（コンジュゲートを完全に膨潤させるため）、4 mg / mLのコンジュゲート溶液を得ました。 5mLのコンジュゲート溶液をDMSOで2mg / mLに希釈し、1000 mLの蒸留水に対して8時間、透析バッグ（8〜14 kDa）を使用して10回交換しました。次に、プローブ型ソニフィケーション（GA92-IIDA超音波セル粉砕機、蘇州江東精密機器）を使用して、氷水浴中で2分間パルス（パルスオン2.0秒、オフ2.0秒）しながら100Wで溶液を超音波処理しました。 。自己組織化PLVNPを取得し、サンプルを4°Cで保存しました。 PLV / DXR NPを調製するには、2mgのDXRを5mLのDMSOに溶解し、5mLのコンジュゲート溶液に滴下してから、同じ方法でPLV / DXRNPを調製しました。 FITCをロードしたPLV / DXR NPを調製するための一般的な手順では、1mgのDXRを2mLのDMSOに溶解し、2.5mLのコンジュゲート溶液に滴下しました。次に、DMSO中の1 mLのFITC溶液（0.6 mg / mL）を滴下し、FITCをロードしたPLV / DXRNPを同じ方法で調製しました。

PLV NP、PLV / DXR NP、およびFITCをロードしたPLV / DXR NPを0.45μmの膜でろ過し、動的光散乱（DLS、Zetasizer 3000 HS、 Malvern Instruments、Malvern、UK）。 PLV NPの形態的特徴は、透過型電子顕微鏡（TEM; Tecnai G2 20 S-Twin、FEI Hong Kong）によって加速電圧80kVで観察されました。

積載量と捕捉効率の決定

PLV / DXR NP溶液（5 mL）を5分間超音波処理して（パルスオン2.0秒、オフ2.0秒）、NPから薬物を放出しました。溶液中のDXR吸光度は、紫外可視分光光度計（島津UV-2550、京都、日本）を使用して480 nmで測定し、薬物濃度を計算しました。 DXRカプセル化効率（EE）と負荷容量（LC）は、次のように計算されました。

インビトロ薬物放出

PLV / DXR NPからのDXRの放出プロファイルは、0.1 Mリン酸緩衝液中、37°C​​で、記載されている透析法によって測定されました[33]。通常、6 mLのPLV / DXR NP（139.4 mgDXRに等しい）を透析バッグ（MWCO =3500 Da）に移し、15 mLのPBS（pH 7.4および5.4）中で37°Cでインキュベートしました。所定の時間に、3 mLの外部緩衝液を抜き取り、3 mLの新鮮なPBS（pH 7.4または5.4）と交換しました。放出されたDXRの量を蛍光分光光度法で測定した。薬物放出の割合（ Q ％）は次のように計算されました：

ここで W はNPの重み、 C _n は Tn でのサンプル濃度です 、 V は放出媒体の総量、 V _n はサンプル量（2 mL）、 C _i は T でのサンプル濃度です _i （ i =0、0.5、1、… n 時間、両方の V ₀ および C ₀ ゼロに等しい）。

細胞培養

ヒト乳がん細胞株MDA-MB-231およびMDA-MB-453は、37°C​​、5％CO ₂ の湿度条件下で10％FBSを含むDMEM完全培地で培養されました。 、および正常酸素（21％O ₂ ）。実験細胞はすべて対数増殖期細胞に由来しました。

インビトロ細胞毒性

96ウェルプレートに播種されたMDA-MB-231およびMDA-MB-453細胞（4×10 ³ 100μL容量の細胞/ウェル）を通常の培養条件下で24時間培養しました。次に、さまざまな薬物濃度（DXRとLVの質量比は8.13）のPLV / DXR NPを追加し、48時間インキュベートしました。最後に、細胞増殖の測定に使用する20μLのCellTiter Blue試薬（Promega）を添加し、37°C​​で1〜4時間インキュベートしました。自動マイクロプレートリーダーを使用して、530 / 590nmでの吸光度を測定しました。細胞生存率は、処理なしの対照群の吸光度に対する吸光度のパーセンテージとして表されました。

インビトロ相乗効果分析

アイソボール分析を使用して、ペアの薬剤によって生成される相乗作用と拮抗作用を定量的に評価しました。 Tallaridaの線量当量原理とLoewe加法モデルに従って、アイソボールが生成されます。これは、ペアの薬剤の加法効果を定義する線です[34、35]。実際には、以前に説明したように[8]、最初に遊離DXRと遊離LVの用量効果曲線を取得し、薬物の用量と効果を変換した後、線形回帰を使用して線形回帰方程式を取得し、ペアの合計用量を計算しました。特定の効果を与える薬。アイソボールをプロットするためのデータを表1に示します。アイソボール上のポイントは、DXR / LVをさまざまな比率に設定して、50％の最大効果を生み出します。 IC ₅₀ アイソボールの下にある対の薬剤投与量の割合は相乗効果を示していますが、IC ₅₀ アイソボールの上は拮抗作用を示します。

インビトロ細胞取り込み

PLV / DXR FITCNPは透析によって得られました。 PLV / DXR FITC NPの細胞取り込みは、蛍光マイクロプレートリーダーを使用してテストされました。 MDA-MB-231およびMDA-MB-453細胞を播種しました（2×10 ⁵ / well）2.5 cmディッシュで、37°C​​で24時間インキュベートします。次に、細胞を濃度のPLV-DXR FITC NPとともに37°Cで1、2、および4時間インキュベートしました。次に、培地を除去し、冷PBSで2回洗浄した。細胞を4％パラホルムアルデヒドで5分間固定し、DAPIを含む封入剤を使用してスライドに封入しました。次に、NPの細胞取り込みを蛍光顕微鏡で視覚化しました。

統計分析

データは平均±SDとして表され、学生の t によって分析されました。 テスト。 P では、差異は統計的に有意であると見なされました。 <0.05。

結果

DXRとLVのinvitro細胞毒性と相乗効果

TNBCおよび非TNBC細胞増殖に対するLVおよびDXRの阻害効果を評価するために、細胞生存率をアラマーブルーアッセイによって評価しました。最初に、2つのTNBC細胞株に対するLVおよびDXRの阻害効果を無料の薬物検査によって決定しました。一連のLV / DXR濃度比は、一方の薬物の濃度を一定に設定し、もう一方の薬物の濃度を変更することによって得られました。 MDA-MB-231細胞株では、LVとDXRの両方が濃度依存性の阻害をもたらしましたが、LVは3.0μMまでの濃度で有意な阻害効果を示しました（図1）。

乳がん細胞における遊離ドキソルビシン（DXR）および遊離ロバスタチン（LV）の細胞毒性。 MDA-MB-231（ a ）に対する遊離DXR、LV、およびDXRとLVの組み合わせのinvitro細胞毒性 、 b ）およびMDA-MB-453（ c 、 d ）がん細胞

IC ₅₀ さまざまなDXR処理でのLVとさまざまなLV処理でのDXRの値を表2に示します。また、これらのIC ₅₀ もプロットしました。 DXR / LVの複合効果を視覚的に反映する値（図2a）。 IC ₅₀ 無料のDXRのみの場合は0.865μM、無料のLVのみの場合は10.07μMでした。 DXRの濃度が0.125から0.625μMに増加すると（5倍の増加）、IC ₅₀ LVの場合は10.92から0.28μM（39分の1に減少）に減少し、DXR濃度が0.625から3.125μM（5倍に増加）に増加すると、IC ₅₀ LVの値は0.28から0.0004085μMに減少しました（685分の1の減少）。同様に、LV濃度が1.0から3.0μMに増加した場合（3倍の増加）、IC ₅₀ DXRの値は1.005から0.3033μM（3.3倍の減少）に減少し、LV濃度が3.0から10μM（3.3倍の増加）に増加すると、IC ₅₀ DXRの値は0.3033から0.007196μMに減少しました（42分の1の減少）。したがって、MDA-MD-231細胞増殖の同じ阻害率に対して、DXRは必要なLVの量を大幅に減らすことができ、LVは必要なDXRの量も大幅に減らすことができます。 DXRは望ましくない有害な副作用を伴う非常に強力な化学療法薬であり、低濃度に保つ必要があり、LVは最小限の有害な副作用しか持たないため、この発見は腫瘍化学療法に不可欠です[36]。 MDA-MB-453細胞の場合、DXRは濃度依存性の阻害を示しましたが、LVは調べた濃度で有意な阻害を示しませんでした。さらに、DXRは、3.0μMまでの濃度でMDA-MB-453細胞に対して有意な阻害効果を示しましたが、これはMDA-MB-231細胞よりもはるかに効果が低かった（図1）。最近、LVが非TNBC細胞株と比較してTNBC細胞株のパネルを選択的に阻害することを発見しました[8]。したがって、LVとDXRの組み合わせは、TNBCの治療には適している可能性がありますが、非TNBC細胞の治療には適していません。

DXRとLVの相乗効果。 IC ₅₀ GraphPad Prism 7（ a ）によって計算されたLVおよびDXR濃度が異なるDXRおよびLVの値 ）およびアイソボール法（ b ）

DXRとLVの相乗効果をさらに定量的に評価するために、アイソボール法を使用しました。最大効果を50％にするためにさまざまなDXR / LV比を使用して（表1）、DXR / LV比の相加効果を示すアイソボールをプロットしました（図2b）。 IC ₅₀ 0.025 / 7.09、0.3033 / 3.0、および0.625 / 0.28（μM/μM）でのDXR / LVの線量はアイソボールを下回りました。これは、これらの比率でのDXR / LVが相乗効果を生み出すことを示唆しています。したがって、この相乗効果（1 + 1> 2）は、最大の薬効で薬理学的に統計的に最小化された薬物投与量をさらに達成します[37]。これらの3つの相乗効果の比率は、これらの結果を表すように見えました。（1）低用量のDXR（0.025μM）は、LVの治療効果をよりよく高めることができます。 。2b）; （2）DXR濃度が高い場合、少量のLVを追加すると、IC ₅₀ であるため、MDA-MB-231細胞に対するDXR効果を大幅に高めることができます。 DXRのみの場合は0.865μMでしたが、0.28μMのLVを追加するだけでIC ₅₀ が減少しました。 DXRを0.625μMに変更しました。つまり、0.28μMLVが0.24μMDXRの有効性を完全に置き換えました（表2）。 （3）LVの線量がDXRの約10倍の場合、点（0.3033、3.0）がアイソボールから最も遠いため、DXR / LV比が最も相乗効果を発揮するはずです（図2b）。

PLVコンジュゲートの合成と構造の特性評価

両親媒性PLVコンジュゲートは、スキーム2に示すように合成されました。PLVは、プルランとLVのエステル化によって得られました。 PLVコンジュゲートの構造はFTIRと ¹ によって確認されました H NMRスペクトル（図3）。 FTIR分析（図3a）によると、PLVコンジュゲートは正常に生成されました。 PLVコンジュゲートのスペクトルについては、プルランの特徴的なピーク（1644、1642、および1648 cm ^-1 ）を維持することに加えて ）、1459 cm ^-1 での増強されたピーク および1360cm ^-1 –CH ₃ の曲げ振動ピークも示しました および–CH ₂ –それぞれ、LVの場合。さらに、1725 cm ^-1 で–C =O伸縮吸収ピーク（LVでのエステル結合）の高い波数シフトが観察されました。 新たに生成されたエステル結合のためにPLVコンジュゲートから生成され、これらのピークは、プルランに対するLVのモル比の増加に伴って増強されました（図3a）。

両親媒性PLVコンジュゲートの化学合成。 LVと無水コハク酸（SA）は、ピリジンの触媒作用下で反応し、50°LでLV-SAを形成しました。次に、LV-SAはEDCとDMAPの触媒作用下でエステル結合によってプルランに結合し、PLVポリマーを形成しました

プルラン-ロバスタチン（PLV）コンジュゲートの構造特性。 a プルラン、LV、PLV（1/2）、PLV（1/3）、およびPLV（1/4）のFTIRスペクトル、1644、1642、および1648 cm ^-1 でピーク プルランの特徴的なピークとして。 1360、1459、および1725 cm ^-1 の点線 –CH ₃ の曲げ振動ピークを表示します –および–CH ₂ –LVの場合。 b ¹ プルラン、LV、PLV（1/2）、PLV（1/3）、およびPLV（1/4）のHNMRスペクトル

¹ により、PLVコンジュゲートの合成が成功したことを確認しました。 H NMRスペクトル（図3b）。 ¹ H-NMRスペクトルは、プルランの特徴的なピークとCH ₃ に割り当てられた新しいピークを示しました。 、CH ₂ 、および0.5〜2.7 ppmのLV部分のCHプロトン（赤枠）。これは、LVのプルランへの結合が成功したことを示しています。 C ₁ のα-1,6およびα-1,4グリコシド結合プロトンに対応する4.94〜5.14 ppm（a）のプルランの特徴的なピークを使用しました。 プルランのグルコース単位を定義する[38]。 4.12 ppm（b）の信号は、C ₁₃ のプロトンに対応していました。 LVで。したがって、プルランの100グルコース単位あたりのLV残基のDSは、C ₁₃ の比率によって計算されました。 LVのプロトン（4.05〜4.15 ppm）から糖プロトン（4.94〜5.14 ppm）への次の式：DS = I _4.05〜4.15 / 私 _4.94〜5.14 ×100％。 LVのDSデータを表3に示します。

PLVNPの特性評価

合成されたPLVコンジュゲートは、水溶液中で自己集合してミセルになる可能性があります。 PLV（1/2）NPの平均サイズと多分散度指数（PDI）は、それぞれ177.2nmと0.138でした。 PLV（1/3）NPの場合は189.7nmおよび0.160。 PLV（1/4）NPの場合は219.8 nmおよび0.050（表3、図4a、b）。さらに、PLV（1/2）、PLV（1/3）、およびPLV（1/4）NPのゼータ電位はそれぞれ-11.66、-10.51、および-8.30mVでした。 PLV NPのサイズは、LV​​のDSの増加とともに減少し、ゼータ電位に有意な変化はありませんでした。サイズの変化は、主にLVグループ間の疎水性相互作用の強化に起因し、その結果、よりコンパクトな疎水性コアが形成されます[39]。以前、コレステロールのDS値が異なるプルランNPを研究し、両親媒性ポリマーの疎水性DSが大きいほど、形成されるNPのサイズが小さくなることを発見しました[33]。この研究では、疎水性基LVのDSが大きいため、NPのサイズも小さくなりました。また、TEM画像（図4c）は、NPが一般的に球形であり、単分散性が良好であることを示しています。以下の実験では、DSが最も高くLV負荷が最も高く、サイズが最小のPLV（1/2）NPが選択されました。

ナノ粒子（NP）の特性評価。 a PLVの粒子サイズと分布。 b PLVのゼータ電位。 c PLVの透過型電子顕微鏡画像（1/2）。 d PLV / DXRおよびFITCをロードしたPLV / DXRの粒子サイズと分布。 e PLV / DXRおよびFITCをロードしたPLV / DXRのゼータ電位。 f PLV、PLV / DXR、およびFITCをロードしたPLV / DXRの写真

PLV / DXR NPはまた、球状の形態と、空のPLVNPよりも大きいサイズ（225.6 nm）を示しました。 PLV / DXR NPのカプセル化効率と負荷容量はそれぞれ20.92％と1.93％でした。 NPの疎水性コアと薬物の疎水性基の間の疎水性相互作用が、NPへの薬物負荷量を決定します。この実験で使用したDXR塩酸塩の水溶性がわずかに大きかったことを考慮すると、DXRとNPの疎水性コアとの間の疎水性相互作用は弱く、NPに実際にカプセル化されたDXRの量が少なくなりました。腫瘍細胞によるNPの取り込みをさらに明確にするために、FITCをPLV / DXRNPにロードしました。 FITCをロードした場合、FITCをロードしたPLV / DXRNPの平均サイズは253.8nm、平均ゼータ電位は-15.09 mVでした（図4d、e）。

インビトロ薬物放出

PLV / DXR NPからのDXRの放出挙動を明らかにするために、in vitro DXR放出プロファイルをpH 7.4および5.4のPBSで評価し、それぞれ正常な生理学的組織および細胞内微小環境の状態を模倣しました。 PLV / DXR NPは、DXR放出の2つのフェーズを示しました。最初の8時間での急速放出と、その後の持続放出です（図5）。これは、一般的なNPの放出プロファイルと一致しています。さらに、pHが7.4から5.4に低下すると、累積DXR放出は72時間でそれぞれ76.15％と97.90％まで大幅に加速されました。したがって、PLV / DXR NPからのDXRの放出は、ある程度pHに敏感であり、これは、治療効果を高め、invivoでの副作用を減らすのに特に有用です[40]。

透析後のさまざまな時点でのpH7.4対5.4のリン酸緩衝生理食塩水中のPLV / DXRからのDXRのinvitro放出プロファイル

FITCをロードしたPLV / DXRNPの細胞取り込み

MDA-MB-231（図6a）およびMDA-MB-453（図6b）細胞の蛍光顕微鏡画像を、FITCをロードしたPLV / DXR NPおよびNP処理後0.5時間から4時間まで、赤と緑の両方の蛍光の強度が時間依存的に増加することを発見しました（図6）。これは、それぞれDXRとFITCをロードしたNPの時間依存的な細胞取り込みを示しています。また、MDA-MB-231細胞に入るFITCの量は、MDA-MB-453細胞に入る量よりも多かった。蛍光強度をさらに定量化すると、NP処理の1時間後のMDA-MB-231細胞とMDA-MB-453細胞の間でDXRの取り込みに有意差があることが明らかになりました（図6c）。

PLV / DXRNPにロードされた薬物の乳がん細胞への取り込み。 MDA-MB-231（ a ）によって撮影されたFITCをロードしたPLV / DXRの蛍光顕微鏡画像 ）およびMDA-MB-453（ b ）0.5、1、および4 hのセル（DAPIの場合は青、DXRの場合は赤、FITCの場合は緑）。 c PLV / DXR処理後のMDA-MB-231およびMDA-MB-453細胞におけるDXRの細胞取り込みの定量分析

PLV / DXRNPのinvitro細胞毒性

MDA-MB-231およびMDA-MB-453細胞の生存率に対するDXRおよびLVの阻害効果を確認し、DXRおよびLVの相乗効果を実証した後、これら2つの細胞に対するPLV / DXRNPのinvitro細胞毒性を測定しました。行。 MDA-MB-231およびMDA-MB-453細胞は、遊離DXRと同等の濃度のPLV / DXRNPとともにインキュベートされました。 PLV / DXR NPの細胞毒性は、DXR濃度の増加とともに増加し、MDA-MB-453細胞よりもMDA-MB-231の方が大きかった（図7a）。この発見は、遊離薬物の細胞毒性の傾向と一致しており（図7b）、NPに遊離薬物をロードしても薬物の阻害挙動に影響を与えなかったことを示しています。 PLV / DXR NPは、MDA-MB-453細胞よりもMDA-MB-231の増殖に対して高い阻害効果を示しました。これは、TNBCに対するLVの優先的な阻害効果と一致していました。 MDA-MB-231細胞の増殖阻害は、遊離DXRよりもPLV / DXR NPの方が大きかった（IC ₅₀ 0.6012vs0.865μM）。これは、NPが細胞内への負荷された薬物の取り込みと保持を促進し、遊離薬物と比較して細胞毒性を高める可能性があることを示唆しています。

NP送達薬物対遊離薬物のinvitro細胞毒性。 PLV / DXRの細胞毒性（ a ）および無料のDXR（ b ）MDA-MB-231およびMDA-MB-453セルに対して

ディスカッション

この研究では、invitroでの薬物放出プロファイリング用に準備されたPLV / DXR NPは、72時間以内に持続的に放出されたDXRを放出しました。これは、pH 5.4（97.9％）で堅牢でした。 PLV / DXR NPは、非TNBCMDA-MB-453細胞よりもTNBCMDA-MB-231の増殖をより強く阻害しました。両方の細胞株はNPの時間依存的な取り込みを示しましたが、MDA-MB-231細胞はMDA-MB-453細胞よりも多くのNPを取り込みました。したがって、プルランベースのLVとDXRのNP同時送達は、TNBC乳がん細胞の増殖を効率的に阻害する可能性があり、TNBCを治療するための強力な薬物送達システムを示唆している可能性があります。

最近、TNBCの予防と治療におけるLVの使用が認識され、研究により、LVがTNBC細胞の増殖を優先的に阻害し、アポトーシスを誘導することがさらに示されています[10、41]。ただし、臨床的には、LVは主に経口製剤に含まれていますが、DXRを含む化学療法用の他の抗腫瘍薬は主に注射剤です。この状況は、予想される用量および時間で腫瘍組織に到達することを困難にするために、ＬＶおよび他の薬物を組み合わせるための望ましくない化学療法効果をもたらす。注射剤としてのLVの処方は、その水不溶性のために達成するのが困難です。したがって、LVを抗腫瘍効果に使用し、複数の薬剤を同時にカプセル化して併用化学療法を容易にするためには、ナノデリバリーシステムが必要です。

私たちのグループは最近、LVをカプセル化するためのセラソームベースのナノコンポジットを準備しました。これにより、LVの水溶性の問題はある程度解決されましたが、薬物の充填効率は一般に高くありませんでした（5〜6％）[8]。張ら。 LVをロードするためのカンプトテシン-フロクスウリジンコンジュゲートナノカプセルを開発しました。米国食品医薬品局が承認した2つの化学療法薬で構成されるこれらのナノカプセルは、カンプトテシン-フロクスウリジンの超高薬物負荷容量（68.3％）を達成しましたが、LVの負荷効率は依然として低かった（2.8％）[29]。本研究では、プルランの疎水性修飾にLVを使用して両親媒性PLVコンジュゲートを取得し、PLV / DXR NPを調製しました。これにより、LVの水溶性の問題が解決されるだけでなく、高い薬物負荷容量（15.69％）が得られました。 LVの場合は1.93％、DXRの場合は1.93％）。

2つ以上の抗腫瘍薬をナノキャリアにカプセル化する戦略は、効率的な薬物送達のために広く受け入れられています[42]。スイらネズミ乳がんに対する相乗的化学療法を達成するために、ソラフェニブをロードするDXRグラフトプルランNPを使用しました[30]。私たちの研究では、PLV / DXR NPに対して同様の方法を使用し、DXR単独と比較してMDA-MB-231細胞に対してより高い阻害効果を示しました。ただし、PLV / DXR NPは相乗効果を示さず、これはNPエンドサイトーシスとLV放出の遅れに関連している可能性があり、さらなる研究に値します。

組み合わせ指数は、2つの薬剤の相乗効果を定量化するために広く使用されています[43、44、45]。相乗効果の定量的評価に使用されるアイソボログラム分析法は、偽陽性の結果を効果的に回避することができます[35]。この研究では、アイソボログラム分析に基づいて、DXR / LV比の範囲から最適な相乗効果比をスクリーニングしました。

私たちの研究は、TNBCに対する相乗的に強化された抑制効果を引き出すためのより効率的な同時送達システムの設計の理論的根拠を提供します。私たちの研究は予備的なものであり、EPR効果が実現可能であるという前提に基づいているため、同所性乳房腫瘍増殖モデルと患者由来の異種移植モデルを使用して、TNBCに対するこの新しい同時送達システムのinvivoでの有効性をさらに調査する必要があります。

結論

この研究では、プルランにLVを化学的にグラフトし、優れた単分散性、高い薬物負荷容量、および優れた薬物放出挙動を備えたDXRを物理的にカプセル化することにより、新しい二重薬物負荷NPを開発しました。 PLV / DXR NPは、DXRの持続可能なpH感受性放出挙動を示しました。 PLV / DXR NPは、非TNBC MDA-MB-453細胞よりも効果的に内在化され、TNBCMDA-MB-231の増殖を抑制しました。さらに、TNBCの将来の臨床治療の可能性のための併用化学療法レジメンを提供する無料のDXR / LV混合物の相乗効果を実証しました。

データと資料の可用性

この原稿でなされた結論は、この論文で提示され示されているすべてのデータに基づいています。

略語

¹ H NMR：

プロトン核磁気共鳴

DLS：

動的光散乱

DMAP：

4-ジメチルアミノプリジン

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

DMSO：

ジメチルスルホキシド

DS：

置換度

DXR：

ドキソルビシン

EDCI：

1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩

EE：

カプセル化の効率

EPR：

強化された透過性と保持力

ER：

エストロゲン受容体

FBS：

ウシ胎児血清

FTIR：

フーリエ変換赤外

HER2：

ヒト上皮成長因子受容体2

LC：

積載量

LV：

ロバスタチン

LV-SA：

ロバスタチンコハク酸モノエステル

NP：

ナノ粒子

PDI：

多分散度指数

PLV：

プルランでカプセル化されたロバスタチン

PLV / DXR NP：

ドキソルビシンをロードしたPLVナノ粒子

PR：

プロゲステロン受容体

SA：

無水コハク酸

TNBC：

トリプルネガティブ乳がん