SOX2がCCAT1/miR-185-3p/FOXP3経路を制御し子宮頸癌幹細胞の増殖と自己再生を調節

概要

長鎖非コードRNA（lncRNA）が子宮頸癌（CC）における役割を果たすことが示されています。本研究では、性決定領域Yボックス2（SOX2）/lncRNA結腸癌関連転写産物-1（CCAT1）/マイクロRNA-185-3p（miR-185-3p）/フォークヘッドボックス蛋白質3（FOXP3）軸がCC幹細胞の増殖と自己再生能に及ぼす影響を議論することを目的としました。CC組織と細胞でのmiR-185-3p、SOX2、CCAT1、FOXP3発現を検定。CC患者におけるSOX2/CCAT1発現と臨床病理学的特徴の関係を検証。CD44⁺HeLa細胞で機能喪失・獲得実験を行い、生物学的機能と自己再生能を検討。最後に、SOX2、CCAT1、FOXP3、miR-185-3p間の関係を検証しました。CC組織と細胞でmiR-185-3p発現が低下、SOX2、CCAT1、FOXP3発現が上昇。SOX2とCCAT1発現はCCの腫瘍サイズ、リンパ節転移（LNM）、国際婦人科連合（FIGO）ステージと関連。SOX2またはCCAT1ダウンレギュレーションとmiR-185-3pアップレギュレーションにより、CD44⁺HeLa細胞の増殖、侵襲、移動、球形成数が抑制されアポトーシスが促進。SOX2がCCAT1に結合しmiR-185-3p発現に影響、FOXP3がmiR-185-3pによって標的とされることが判明しました。

はじめに

子宮頸癌（CC）は女性の死亡原因第4位で、2018年に世界で推定570,000例の新規症例と311,000人の死亡がありました。この複雑な疾患は遺伝的影響やウイルス感染など多様な因子が関与します。ヒトパピローマウイルス（HPV）併用検査とHPVワクチンの発展により、子宮頸部異形成と癌の早期診断手順がCCの発生率、罹患率、死亡率の減少につながっています。早期CC患者には、温存手術、円錐切除、広汎頸部切除、骨盤リンパ節郭清、骨盤放射線療法、小線源療法などの手術が推奨されます。しかし、進行CC患者では転移や再発により予後が依然として不良です。したがって、CC治療改善のために新規かつ効果的な予後マーカーと治療戦略を同定することが依然として喫緊の課題です。

性決定領域Yボックス2（SOX2）は転写因子SOXファミリーの重要な一員で、主に胚性および成体幹細胞に発現し、癌幹細胞でも発現します。SOX2がヘッジホッグシグナル経路を介してCCの放射線抵抗性を調節することが明らかにされています。別の研究では、SOX2がCC細胞株の癌幹細胞サブポピュレーション維持に不可欠であることが実証されています。長鎖非コードRNA（lncRNA）は200ヌクレオチド長のRNA分子群です。lncRNA結腸癌関連転写産物-1（CCAT1）はヒト染色体8q24.21に位置し、結腸癌で遺伝子変異をもたらす「ホットスポット」と見なされています。CCAT1がCC細胞増殖と侵襲を加速することが報告されています。Jiaらによれば、CCAT1がCC細胞の増殖、移動、侵襲を劇的に増強します。さらに、別の研究ではCCAT1がマイクロRNA-185-3p（miR-185-3p）を減少させることで腸バリアを破壊し、炎症性腸疾患の悪性度を高めることが明らかにされています。miRNAはmRNAを減少させ翻訳を抑制することで遺伝子発現を逆調節します。以前の研究のin vitro実験で、miR-185-3pが鼻咽頭癌放射線抵抗性を調節することが明らかに。別の研究では、miR-185が卵巣癌シスプラチン耐性にin vivoおよびin vitroで関与することが示唆されています。フォークヘッドボックス蛋白質3（FOXP3）はFOX蛋白質ファミリーに属する転写因子で、最初に制御性T（Treg）細胞で発見され、Treg細胞の維持と過程で重要な役割を果たします。FOXP3がCCのリンパ管新生に関連することが報告されています。別の研究では、FOXP3レベルがFIGOステージとCC腫瘍サイズと劇的に関連することが明らかにされています。本研究では、SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3軸がCC幹細胞の増殖と自己再生能に及ぼす影響を検討しました。

材料と方法

倫理承認と参加同意

ヒトを対象とした実験はヘルシンキ宣言の原則に従って実施。本研究は吉林大学第一病院機関審査委員会の承認を受けました。全参加者がインフォームドコンセント文書に署名しました。

研究対象

2016年12月から2018年12月に、39例のCC組織と対応する隣接正常組織をCC患者から採取し液体窒素で保存。選択基準：(1) 経頸部および頸管生検病理、頸部塗抹細胞診、頸部ヨウ素試験、腟鏡検査、頸椎切除により病理的にCCと確定。(2) 手術2週間前から放射線化学療法を受けていない。除外基準：(1) いかなる放射線化学療法を受けている患者、(2) 検体採取に不同意の患者、(3) 免疫系障害患者。

細胞選択と培養

CC細胞株（SiHa、HeLa、CaSki、HCC94、C33A）とヒト子宮頸上皮不死化細胞株H8を上海バイオリーフバイオテック（上海、中国）から購入。CC細胞SiHa、HeLa、HCC94を10%胎仔牛血清（FBS）含有高糖Dulbecco改変Eagle培地（DMEM）で、CaSki、C33A、H8細胞を10%FBS含有Roswell Park Memorial Institute（RPMI）-1640培地で培養（37℃、5% CO₂）。2日ごとに継代。

CC幹細胞分離（CD44⁺HeLa細胞）

CC幹細胞をCC細胞株HeLaから細胞懸濁培養で分離。HeLa細胞を血清フリーIscove改変Dulbecco培地（IMDM）で超低吸着シャーレで21日間培養、培地を3-5日ごとに半量交換。一部の細胞が球体形成し、HeLa球体形成細胞（SFC）を取得。球状細胞の特性を同定・解析。トリプシンで細胞を剥離し1×10⁶ cells/mLに調整。CD44抗体を添加しフローサイトメトリーで分別。表面CD44陽性HeLa細胞をHeLa腫瘍幹細胞、陰性をHeLa非幹細胞としました。CC幹細胞をDMEM/F12で培養し、20 ng/mL基本線維芽細胞増殖因子（bFGF）、20 ng/mL上皮増殖因子（EGF）、B27を添加。培地に1%ペニシリンとストレプトマイシンを含有。

細胞処理

CD44⁺HeLa細胞をsh-SOX2、sh-SOX2陰性対照（NC）、sh-CCAT1、sh-CCAT1 NC、miR-185-3pミミック、ミミックNC、sh-CCAT1とmiR-185-3pインヒビター、sh-CCAT1とインヒビターNCでトランスフェクション。全オリゴヌクレオチド配列はGenePharma（上海、中国）から供給。トリプシンで剥離した細胞を6ウェルプレートに3×10⁶ cells/wellで播種。60%コンフルエンスに達したら血清フリー培地に変更し1時間インキュベート。リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬（Invitrogen、Carlsbad、California、USA）でトランスフェクション促進。

逆転写定量PCR（RT-qPCR）

組織と細胞のRNAをTrizol（Invitrogen）で抽出。RNA（1 μg）をモロニーマウス白血病ウイルスRTaseキット（Invitrogen）でcDNAに逆転写。cDNAをリアルタイムPCRシステムに添加。プライマーを上海桑根生物技術（上海、中国）で設計（表1）。U6をmiR-185-3pのローディングコントロール、グリセラールデヒドリン酸脱水素酵素（GAPDH）をSOX2、CCAT1、FOXP3の内部基準として使用。結果を2^−ΔΔCt法で解析。

ウェスタンブロットアッセイ

細胞と組織の総タンパク質を抽出。タンパク質濃度をビシンコニン酸キット（AmyJet Scientific、武漢、湖北、中国）で測定。タンパク質をローディングバッファーと混合し5分沸騰、アイスバス後遠心。10% SDS-PAGEで電気泳動後メンブレン転写。5%脱脂乳で1時間ブロッキング、一次抗体SOX2（1:1000、江蘇瑞思坦生物技術、江蘇、中国）、FOXP3（1:1000、Abcam Inc.、Cambridge、MA、USA）、GAPDH（1:1000、Cell Signaling Technology、Beverly、MA、USA）で反応、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体で再反応、保存フィルムで覆い露光。Bio-rad Gel Doc EZイメージャー（Bio-rad、California、USA）で現像。タンパク質画像をImageJ2xソフトウェアで解析。

細胞計数キット（CCK）-8アッセイ

CCK-8アッセイをキット（Beyotime、上海、中国）で実施。細胞（1×10⁴）を96ウェルプレートに播種しインキュベート。0、24、48、72時間培養後、各ウェルに10 μL CCK-8溶液添加し1時間インキュベート。マルチスカンスペクトラム全波長マイクロプレートリーダーで450 nm光学密度値測定。6ウェル平均値を算出。時間を横軸、相対細胞生存率を縦軸として細胞増殖曲線を作成。光学密度値が細胞増殖を表す。

フローサイトメトリー

細胞（1×10⁶）を1500 r/minで遠心、200 μL結合バッファーで懸濁、5 μLヨウ化プロピジウム（PI）と5 μLアネキシンV-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を順次添加、400 μLバッファー添加。フローサイトメーター（BD Biosciences、NJ、USA）で細胞アポトーシス率検証。

スクラッチテスト

トランスフェクション細胞を剥離し細胞懸濁液調製。細胞懸濁液（1×10⁶ cells/mL）を6ウェルプレートに播種し80-90%コンフルエンスまで培養。10 μL無菌ピペットチップで定規に沿って横縦に均等なスクラッチ作成。元の培地を完全培地に置換し継続培養。0時間と72時間で顕微鏡下で細胞移動観察、同一箇所を撮影。

トランスウェルアッセイ

トランスフェクション細胞をトリプシン化、1000 g遠心、DMEMで洗浄。完全水和トランスウェルチャンバーを10% FBS-DMEM（600 mL/well）含有24ウェルプレートに配置。細胞懸濁液（5×10⁵ cells/mL、200 μL）をマトリゲルコート（1:8 Matrigel 80 μL）上室に、20% FBS-DMEM 500 μLを下室に添加。24時間継続培養、500 μL 4%パラホルムアルデヒド（PFA）で固定、0.1%クリスタルバイオレット染色液で染色。上室表面と縁の細胞を綿棒で拭き取り。5視野をランダム選択し、顕微鏡（Nikon Eclipse TE2000-S、Nikon、日本）で計数。

球形成アッセイ

低吸着6ウェルプレートに血清フリー懸濁培地（200 cells/well）で細胞播種。2週後、顕微鏡（Nikon Eclipse TE2000-S、Nikon）で球形成率観察。球形成率 = 平均球数/播種細胞数 × 100%で算出。

クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイ

ChIPアッセイをChIPキット（Upstate、NY、USA）で実施。SOX2（1:1000、Re-stem Biotech、江蘇、中国）と正常ウサギIgG（12-370、Millipore、USA）抗体でタンパク質-DNA架橋複合体を免疫沈降。CD44⁺HeLa細胞を1% PFAで固定しDNA-蛋白質架橋生成。超音波でDNAを200-300 bpクロマチン断片に切断。沈降クロマチンDNAを回収しRT-qPCRで解析。

RNAプルダウンアッセイ

ビオチン標識miR-185-3p野生型（WT）と変異型（MUT）プラスミド（50 nM）をCD44⁺HeLa細胞にそれぞれトランスフェクション。48時間トランスフェクション後、特定細胞溶解液（Ambion、Austin、Texas、USA）で細胞溶解。細胞溶解液（50 mL）を分包。残留溶解液をRNaseフリーと酵母tRNA（Sigma）でプレコートしたM-280ストレプトアビジンビーズ（Sigma、St. Louis、MO、USA）とインキュベート。拮抗miR-185-3pプローブをNCとして設定。Trizolで総RNA抽出し、RT-qPCRでCCAT1レベル測定。

デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ

SOX2のCCAT1プロモーター領域潜在的結合部位E1とE2をhttps://jaspar.genereg.net/で予測。SOX2とCCAT1結合部位E1を含むCCAT1プロモーター配列を合成し、CCAT1 3'UTR WT（E1-WT）とCCAT1 3'UTR MUT（E1-MUT）ベクター作製。ベクターをpmirGLO（Beyotime）にクローニング。CCAT1-WT/pmirGLOまたはCCAT1-MUT/pmirGLOをsh-SOX2またはsh-SOX2 NCと共にCD44⁺HeLa細胞にそれぞれコトランスフェクション、2日後溶解、ルシフェラーゼ検出システム（タカラ、大連、中国）でルシフェラーゼ活性測定。

バイオインフォマティクスウェブサイトでCCAT1とmiR-185-3pの結合部位予測・解析。デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイでCCAT1とmiR-185-3p結合部位検証。miR-185-3p結合部位含むCCAT1 3'UTRを構成。CCAT1 3'UTR WTとCCAT1 3'UTR MUTを作製し、ミミックNCとmiR-185-3pミミックと共にCD44⁺HeLa細胞に2日間コトランスフェクション。溶解後ルシフェラーゼ検出システム（タカラ）でルシフェラーゼ活性測定。同様の方法でmiR-185-3pとFOXP3の標的関係検証。

統計解析

全データをSPSS 21.0ソフトウェア（IBM Corp.、Armonk、NY、USA）で評価。測定データを平均±標準偏差で表示。2群間差にt検定、多群間差に一元配置分散分析（ANOVA）とTukeyの多重比較検定適用。分類変数はFisherの正確確率検定で評価。p < 0.05を有意と判定。

結果

CC組織でmiR-185-3p発現低下、SOX2/CCAT1/FOXP3発現上昇。SOX2とCCAT1発現は腫瘍サイズ、LNM、FIGOステージと関連

SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3軸がCC幹細胞の増殖と自己再生能に及ぼす役割を検証する際、CC組織と隣接正常組織でのmiR-185-3p、SOX2、CCAT1、FOXP3発現をRT-qPCRとウェスタンブロットで測定。その結果（図1a-c）、CC組織でmiR-185-3p発現低下、SOX2、CCAT1、FOXP3発現上昇が明らかになりました。

SOX2/CCAT1発現とCC臨床病理学的特徴の関係を解析（表2）。CCで過剰発現したSOX2とCCAT1は腫瘍サイズ、LNM、FIGOステージと関連し、より大きな腫瘍サイズ、LNMあり、進行FIGOステージのCC患者でSOX2とCCAT1発現が高いことを示しました。

CD44⁺HeLa細胞でmiR-185-3p発現低下、SOX2/CCAT1/FOXP3発現上昇

ヒト子宮頸上皮不死化細胞H8とCC細胞株SiHa、CaSki、HeLa、HCC94、C33AでのmiR-185-3p、SOX2、CCAT1、FOXP3発現を検定。CC細胞株でmiR-185-3p発現低下、SOX2、CCAT1、FOXP3上昇が示唆されました（図2a-c）。その中で、HeLa細胞のSOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3がH8細胞と最も発現差が大きかったため、HeLa細胞をスクリーニング・分離。HeLa-SFCを細胞懸濁培養で取得し、分離前後の細胞表面CD44発現をフローサイトメトリーで同定。HeLa-SFCのCD44陽性率が分離前より顕著に高く、CC幹細胞分離成功を示唆（図2d）。分離幹細胞をCD44⁺HeLa細胞と命名。その後、HeLaとCD44⁺HeLa細胞でmiR-185-3p、SOX2、CCAT1、FOXP3発現を測定（図2e-g）。CD44⁺HeLa細胞でSOX2、CCAT1、FOXP3発現上昇、miR-185-3p低下が明らかになりました。

SOX2ダウンレギュレーションとCCAT1ダウンレギュレーションでCD44⁺HeLa細胞の増殖、移動、侵襲、球形成率低下、アポトーシス増加

その後、CD44⁺HeLa細胞でSOX2とCCAT1を沈黙化し、CC幹細胞の増殖と自己再生への影響を探索。CCK-8アッセイ、フローサイトメトリー、スクラッチテスト、トランスウェルアッセイ、球形成実験で検出。SOX2とCCAT1阻害により、CD44⁺HeLa細胞の増殖、移動、侵襲、球形成率が抑制されアポトーシスが促進されました（図3a-i）。これはSOX2またはCCAT1沈黙がCC幹細胞の増殖と自己再生を抑制することを示しています。

miR-185-3p枯渇がCCAT1ダウンレギュレーションのCD44⁺HeLa細胞での役割を逆転

次に、miR-185-3pがCCAT1によるCC幹細胞増殖と自己再生調節プロセスに関与するか検証。CD44⁺HeLaをmiR-185-3pミミックでトランスフェクション、またはsh-CCAT1とmiR-185-3pインヒビターで共トランスフェクション。結果、miR-185-3pアップレギュレーションがCD44⁺HeLa細胞の増殖、移動、侵襲、球形成率を顕著に抑制しアポトーシス率を増加。miR-185-3pインヒビター処理細胞が、CCAT1ダウンレギュレーションのCD44⁺HeLa細胞における増殖、移動、侵襲、アポトーシス、球形成への役割を逆転させました（図4a-i）。

低発現SOX2と低発現CCAT1がCD44⁺HeLa細胞でFOXP3発現低下、miR-185-3p発現上昇

その後、sh-SOX2、sh-CCAT1、miR-185-3pミミック、sh-CCAT1とmiR-185-3pインヒビター共トランスフェクション後のCD44⁺HeLa細胞でのSOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3発現を検証。sh-SOX2処理細胞でSOX2、CCAT1、FOXP3発現低下、miR-185-3p発現上昇。sh-CCAT1処理細胞でCCAT1とFOXP3発現低下、miR-185-3p発現上昇。miR-185-3pミミック導入細胞でmiR-185-3p発現上昇、FOXP3発現低下。sh-CCAT1とmiR-185-3pインヒビター逐次トランスフェクション細胞でFOXP3発現上昇、miR-185-3p発現低下（図5a-d）。

SOX2がCCAT1に結合しmiR-185-3p発現に影響、FOXP3はmiR-185-3pの標的遺伝子

CCAT1プロモーター領域転写因子の潜在的結合部位をhttps://jaspar.genereg.net/で予測・解析。SOX2とCCAT1がCCAT1プロモーター領域に潜在的結合部位を持つことが示されました（図6a）。ChIP-qPCRで報告（図6b）：IgG群と比較し、E1結合部位でSOX2群により多くのCCAT1プロモーター断片が濃縮され、SOX2がCCAT1プロモーターE1部位に結合しCCAT1調節に関与することを証明。デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ表示（図6c）：sh-SOX2とE1-WT共トランスフェクション細胞でルシフェラーゼ活性抑制、SOX2がCCAT1に結合可能であることを示唆。

JeffersonウェブサイトでCCAT1がmiR-185-3pと結合可能と予測（図6d）。デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ報告（図6e）：miR-185-3pミミックとCCAT1-WT導入細胞でルシフェラーゼ活性低下、miR-185-3pがCCAT1に結合可能示唆。RNAプルダウンアッセイでCCAT1がmiR-185-3pと結合可能か検証。結果（図6f）：Bio-miR-185-3p-WT処理細胞でCCAT1濃縮レベル顕著上昇、Bio-miR-185-3p-MUT処理細胞では有意差なし。この結果はCCAT1がmiR-185-3pを吸着し、それによりmiR-185-3p発現に影響することを実証。

miR-185-3pとFOXP3の標的関係をJeffersonウェブサイトで予測（図6g）。デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイで検証（図6h）：FOXP3-WTとmiR-185-3pミミックをCD44⁺HeLa細胞に共トランスフェクション後、細胞相対ルシフェラーゼ活性が劇的に低下。一方、FOXP3-MUTとmiR-185-3pミミック共トランスフェクションでは相対ルシフェラーゼ活性に影響なし。これによりmiR-185-3pがFOXP3を標的とすることが示唆されました。

考察

CCは世界で女性の悪性腫瘍第4位で、乳癌、結腸癌、肺癌に続きます。SOX2陽性発現CC細胞が癌幹細胞特性を示すことが報告されています。CCAT1がCC関連必須オンコジェニックlncRNAであり、CC細胞増殖と侵襲に促進役割を果たすとの研究報告。別の研究でmiR-185-3pが鼻咽頭癌放射線感受性予測と癌細胞増殖・アポトーシス調節可能と報告。FOXP3への循環自己抗体が子宮頸病変進行を反映し、CC早期予後の潜在的バイオマーカーとなり得ると報告。本研究は、SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3軸がCC幹細胞の増殖と自己再生能にどう影響するか探索する目的で設計されました。

本研究結果に基づき、SOX2とCCAT1発現がCC組織と細胞で上昇し、腫瘍サイズ、LNM、進行FIGOと関連。機能的に証明された通り、SOX2とCCAT1ダウンレギュレーションでCC幹細胞の増殖、移動、侵襲、球状細胞数低下、アポトーシス増加。本研究と同様に、SOX2発現がCCで上昇傾向。さらに、癌幹細胞由来CC細胞でSOX2発現上昇。過剰発現SOX2が複数癌タイプの患者臨床病理学的特徴と関連することが示唆され、CCに限定されない。例えば、FIGO I-II期子宮頸扁平上皮癌患者でSOX2上昇。また、SOX2発現が口腔扁平上皮癌LNMと関連。SOX2の癌進行における分子機能では、SOX-2ダウンレギュレーションが子宮頸扁平上皮癌細胞移動・侵襲抑制を示す観察研究。別研究でSOX2上昇がCC細胞クローン形成能、増殖、腫瘍形成能をin vitroおよびin vivoで対照細胞より増強することが証明。

SOX2とCCAT1の調節関係では、既存研究でSOX2沈黙がCCAT1 mRNAレベル顕著低下させることが提示。CCAT1の癌での役割では、CCAT1発現がCC組織で隣接正常組織対比顕著上昇。特筆すべきは、CCAT1過剰発現がCCで腫瘍サイズと正相関。CCAT1の癌細胞活性役割では、CCAT1過剰発現がCC細胞増殖、コロニー形成、侵襲加速との研究。興味深いことに、先行研究でCCAT1ノックダウンにより細胞生存率、侵襲能、移動能低下が実証。いずれにせよ、SOX2とCCAT1の機能的効果は他癌でもCCと類似。

その後、本研究でCCAT1がmiR-185-3pと結合し、CCAT1ダウンレギュレーションとmiR-185-3p過剰発現がCC幹細胞増殖と自己再生能抑制することが明らかに。CCAT1とmiR-185-3pが負相関と報告。さらに、放射線抵抗性鼻咽頭癌症例でmiR-185-3p発現低下との結果報告。miR-185-3pの癌細胞悪性度抑制機能では、miR-185-3p上昇が鼻咽頭癌細胞侵襲・転移特性抑制と報告。ZouらがmiR-185回復が乳癌細胞増殖・侵襲抑制と提唱。非小細胞肺癌でmiR-185上昇がin vitro細胞増殖、侵襲、コロニー形成能低下との論文。非小細胞肺癌でmiR-185過剰発現によりin vitro細胞増殖、侵襲、移動、in vivo腫瘍増殖抑制との報告。これらの研究から、本研究でのmiR-185-3p抗腫瘍役割が先行研究と整合することがわかります。

さらに、miR-185-3pがFOXP3を標的とし、CCで過剰発現する遺伝子としてCC幹細胞活性を調節することが判明。実際、FOXP3は結腸癌のSOX2癌幹細胞様マーカー調節因子として調査され、CCで上昇していることが示されています。FOXP3上昇が非小細胞肺癌で腫瘍球形成促進と幹細胞性刺激を行うことが証明されています。

結論

総合すると、SOX2転写活性化がCCAT1を活性化し、それによりmiR-185-3pを抑制しFOXP3を調節してCC幹細胞の増殖と自己再生を促進することを初めて解明しました。これはCC治療の潜在的アプローチとなり得ます。しかし、本研究には設計実験における比較的小さな試験サイズという限界が存在します。したがって、臨床研究をさらに実施し、CC治療への有効性を検証する必要があります。

データと材料の入手可能性

該当なし。