頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）に対する強力な抗腫瘍効果のためのNQO1阻害剤と5-フルオロウラシルのメソポーラスシリカナノ粒子ベースの組み合わせ

はじめに

頭頸部扁平上皮がん（HNSCC）は、がんの最も致命的な形態の1つであり、その起源の90％は扁平上皮細胞に由来します[1]。 HNSCCは本質的に血管新生が高く、その血管系は線維芽細胞成長因子（FGF）や血管内皮細胞成長因子（VEGF）などのさまざまなサイトカインを発現します。これらは転移の増加や生存率の低下に関連しています[2]。中国でのHNSCCの発生率は癌関連死で6番目であり、2015年には約25万人の新規症例が登録され、77,500人が死亡しました。 HNSCCの全体的な5年生存率は、攻撃的な性質、早期再発、高い転移、および予後不良による高い死亡率などの要因のために非常に低いです[3]。 HNSCCの主な治療選択肢は、外科的処置とそれに続く放射線療法または化学療法です。具体的には、化学療法を初期段階または術後段階で効果的に使用すると、腫瘍の成長が抑制されます[4、5]。化学療法を効果的に使用すると、腫瘍組織内の癌細胞が根絶され、腫瘍の再発が抑制されます。しかし、単剤に基づく長期化学療法は、しばしば薬剤耐性と治療効果の低下をもたらします[6]。したがって、HNSCC患者の生存と生活の質を改善するために革新的な戦略を採用する必要があります。

HNSCCの治療に使用されるいくつかの抗がん剤には、シスプラチン、5-フルオロウラシル（5-FU）、パクリタキセル、またはドセタキセルが含まれます。とりわけ、5-フルオロウラシル（5-FU）は、HNSCCおよびその他の扁平上皮癌治療の第一選択療法として採用されています[7]。 5-FUは、癌細胞内のチミジル酸シンターゼを不可逆的に阻害することによって作用し、それによってDNAの複製を抑制して細胞死をもたらすピリミジン類似体です[8]。すべての抗がん剤と同様に、5-FUは体循環に悪影響がないわけではなく、正常組織に毒性を引き起こしますが、5-FUと二次薬剤の併用は副作用を軽減し、がん治療における全体的な治療効果[9]。

NAD（P）H：キノンオキシドレダクターゼ1（NQO1）は、腫瘍組織で正常組織と比較して100〜200倍の範囲で上昇するフラボタンパク質です[10]。二電子酸化還元酵素は、安定したヒドロキノンを形成することによってキノンを解毒することができる誘導性の第II相解毒酵素です[11]。 NQO1は、正常なヒト組織で低い基底レベルで発現し、細胞を酸化還元サイクリングや酸化ストレスから保護し、p53サプレッサーを安定化させることが示されています。 NQO1は、乳がん、膵臓がん、扁平上皮がんを含むいくつかのがんで構成的に過剰発現しています[12]。 NQO1の過剰発現は、癌の負担の進行を促進し、癌細胞を5-FUやシスプラチン（酸化ストレス誘導物質）などの化学療法薬に対してより耐性にし、治療効果を改善するための潜在的な腫瘍標的としてNQO1を作ります[13]。 siRNAによるNQO1のノックダウンは、ゲムシタビンやドキソルビシンなどの複数の薬剤の細胞毒性効果を増強することが報告されています[14]。さらに、クマリンやクルクミン、ES936などのいくつかの合成および天然のNQO1阻害剤が報告されています[15、16、17]。この研究では、NQO1阻害剤としてβ-ラパコン（β-ラップ、3,4-ジヒドロ-2,2-ジメチル-2H-ナフト[1,2-b]ピラン-5,6-ジオン）を使用しました[ 18]。 ß-lapはNQO1に依存するメカニズムを介して作用し、大量の活性酸素種（ROS）を生成します。これにより、DNA鎖が損傷し、癌細胞死が引き起こされます[19]。

小分子の全身送達にナノ粒子を採用することは、癌治療において有望なアプローチになります[20]。薬物をロードしたナノ粒子は、より少ない投与スケジュールを必要とし、抗癌効果を改善し、副作用を比較的減らすことが示されています。すべての担体の中で、メソポーラスシリカナノ粒子（MSN）は、ペイロードを腫瘍組織に効果的に送達する大きな可能性を秘めています[21、22]。マイクロメートルサイズの細孔は、薬物の安定した負荷を可能にし、体循環での薬物の放出を防ぎ、強化された透過性と保持（EPR）効果を使用して漏出性癌組織に優先的に蓄積することを可能にします[23]。

全体として、本研究の主な目的は、5-FUとNQO1阻害剤の治療効果を組み合わせて、HNSCCの抗がん効果を高めることでした。インビトロ抗癌効果は、細胞生存率、ウエスタンブロット分析、フローサイトメーター/ヘキストベースのアポトーシスアッセイ、および生/死アッセイなどのさまざまな技術を使用して分析されました。異種移植モデルを有するCal33腫瘍細胞でinvivo研究を実施しました。

結論

要約すると、5-FU +βラップをロードした脂質二重層でコーティングされたメソポーラスシリカナノ粒子の配合に成功しました。我々は、（i）HNSCC腫瘍細胞における濃度依存的なβ-lapの抗腫瘍効果、（ii）5-FU +β-lapの組み合わせが、NQO1タンパク質とBcl-2タンパク質の有意な阻害をもたらすことを示しました（ iii）組み合わせベースのFNQ-MSNは、HNSCC異種移植片における腫瘍量の有意な減少を示しました。これらのデータは、致死量以下のNQO1阻害剤（ß-lap）がHNSCC腫瘍における5-FUの治療効果を高める可能性があり、他の悪性腫瘍の臨床治療にまで拡張できる可能性があるという事実を明確に示しています。

材料と方法

5-FU /ß-lapをロードした脂質二重層-メソポーラスシリカナノ粒子の調製

薬物をロードしたMSNは、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）（210 mg）を180 mlの水に溶解し、80°Cで煮沸した後、5-FUとß-lapを20％w / wの全ナノ粒子と次にフッ化ア​​ンモニウム（NH4F）（30 mg）を加え、60分間よく攪拌しました。次に、1.6 mlのテトラエチルオルトシリケート（TEOS）を30分間滴下し、3時間連続して攪拌しました。半透明の白いコロイドが形成され、24±1°Cで10000rpmで遠心分離（15分）した後に収集されました。 MSNを超純水に再懸濁し、遠心分離サイクルを2回繰り返しました。これとは別に、DSPE-PEG2000（MSNの総重量の2％）を使用して薄膜膜を作成し、薬物をロードしたMSNで懸濁した水で水和しました。混合物を直ちに室温（25℃）で50Wで5分間プローブ超音波処理した。 PEG化脂質二重層に支持されたMSNを最後に2回洗浄し、超純水に再懸濁しました。

粒子サイズ、ゼータ電位分析、および形態分析

Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments、Malvern、UK）を使用して、粒子径、多分散度指数（PDI）、およびゼータ電位を評価しました。粒子は動的光散乱（DLS）メカニズムを使用して分析され、粒子分散液は実験前に十分に希釈されました。すべての実験は、室温で3回行った。ナノ粒子の形態は、100kVで動作するCM200 UT（米国マサチューセッツ州フィリップス）を使用した透過型電子顕微鏡（TEM）によって決定されました。簡単に説明すると、粒子分散液を希釈し、液滴を300メッシュのTEMグリッドに配置し、10分間静置しました。粒子をネガティブ染色として2％リンタングステン酸（PTA）で対比染色し、風乾し、TEM顕微鏡で観察しました。

薬物の装填

上澄み中の無負荷または非結合の薬物とナノ粒子に負荷された薬物を計算することにより、2つの方法で薬物負荷分析を実行しました。薬物負荷効率は、HPLC法によって実行されました。 HPLCには、Shimadzu LC-20 ADPLCポンプとSPD-M20APDA検出器、および逆相C18カラム（Phenomenex C18、150 4.6 mm、5μm）を含む分析ソフトウェアShimadzuLCが装備されていました。 5-FUの移動相は、アセトニトリルと水（10：90、v / v）の混合物で構成され、1 ml / minの速度で送液されます。 5-FUの検出波長は265nmに設定されています。アセトニトリル/水（31：69、v / v）と35°Cで254nmに設定された検出波長で構成されるß-lapの移動相。 5-FU /ß-lapの積載量（LC）と積載効率（LE）は、それぞれの式を使用して計算されました。

薬物放出研究

5-FUおよびβ-lapの放出は、透析法を使用して、37°C​​でPBS（pH 7.4）およびABS（pH 5.0）で評価されました。簡単に説明すると、1mg相当の各薬物負荷ナノ粒子を1mlのそれぞれのバッファー中の透析膜に負荷し、末端を密封します。密封された透析膜を25mlのそれぞれのABSおよびPBS緩衝液に入れ、37℃の振とう水浴に入れました。サンプルは所定の時間間隔で収集され、等量の新しいバッファーと交換されました。それぞれのバッファーで放出された薬物の量は、前のセクションで説明したように、HPLCメソッドによって評価されました。

細胞培養およびNAD（P）H：キノンオキシドレダクターゼ1（NQO1）活性アッセイ

Cal33 HNSCC細胞は、10％のFBSと1％の抗生物質混合物を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養しました。細胞はインキュベーター内で周囲条件に維持された。 NQO1活性アッセイでは、Cal33細胞を96ウェルプレートに8×10 ³ の播種密度で播種しました。 ウェルあたりの細胞数と一晩インキュベートしました。細胞をさまざまな濃度のβ-lapで処理し、24時間インキュベートしました。 0.8％ジギトニン（50μlの2 nM EDTA）を使用して細胞を溶解し、メナジオールとMTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を使用してアッセイを行いました。基質カップリング反応と活性は620nmで測定されました。アッセイは3回行った。

インビトロ細胞生存率アッセイ

濃度を増加させたβ-lapの細胞生存率アッセイおよび個別および組み合わせレジメンの細胞生存率アッセイを、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-5-（3-カルボキシメトキシフェニル）-2-（4）によって試験した。 -スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム（MTS）アッセイ。簡単に説明すると、Cal33細胞を96ウェルプレートに1×10 ⁴ の播種密度で播種しました。 ウェルあたりの細胞数と一晩インキュベートしました。翌日、細胞をβラップの濃度を上げながら別々に処理しました。細胞を、5、10、および20μg/ mlの塩基濃度で5-FUおよびβ-lapの個別および組み合わせレジメンで処理し、24時間インキュベートしました。細胞を2回洗浄し、製造元のガイドラインに従ってMTS溶液で処理しました。未処理の細胞について細胞生存率を計算し、460nmでの吸光度にマイクロプレートリーダーを使用しました。

ウエスタンブロット分析

6ウェルプレートに播種した細胞を、βラップの濃度を上げながら別々に処理しました。細胞を個別（5-FUまたはß-lap）および5-FUとß-lapの組み合わせレジメン（FNQ-MSN）で処理し、24時間インキュベートしました。細胞を回収し、溶解し（M-バッファーあたり）、遠心分離し、タンパク質を含む上清を回収しました。細胞溶解物中のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸（BCA）法を使用して評価しました。 10％のBis-Trisポリアクリルアミドゲルを使用してタンパク質を分離し、すぐにポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレンに転写しました。メンブレンは、Tween 20（TBST、pH 7.2）を含むnトリス緩衝生理食塩水（TBS）バッファーで調製した5％スキムミルクを使用してブロックしました。ウサギポリクローナルNQO1（1：1000）、マウスモノクローナルBcl-2（1：1000）、およびマウスモノクローナルGAPDH（1：1000）の一次抗体を、メンブレン上で4℃で一晩インキュベートしました。メンブレンをTBSTで洗浄した後、1：10000希釈の二次抗体（抗マウスまたは抗ウサギIgG）とインキュベートしました。メンブレンを再度TBSTで洗浄し、ブロットをECL基質溶液に曝露し、タンパク質バンドの密度をフォト現像液を使用して評価しました。

アポトーシスとヘキストアッセイ

Cal33細胞を2×10 ⁵ の播種密度で6ウェルプレートに播種しました ウェルあたりの細胞数と一晩インキュベートしました。次に、細胞を個別（5-FUまたはβ-lap）および5-FUとβ-lapの組み合わせレジメン（FNQ-MSN）で処理し、24時間インキュベートしました。細胞を回収し、洗浄し、遠心分離し、ペレット化した。細胞を2.5μlのアネキシンVと2.5μlのPIで処理し、暗所で15分間インキュベートしました。次に、細胞を1 mlにし、蛍光活性化セルソーティング（FACS、BD、FACSverse）を使用して評価しました。合計10,000個のセルが分析されました。細胞播種および薬物治療の同様の手順に従い、次にヘキスト33342色素（10μg/ ml）で染色し、10分間インキュベートしました。細胞を洗浄し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、再度洗浄しました。細胞の形態を蛍光顕微鏡（ニコンA1、日本）で観察しました。

HNSCC異種移植腫瘍モデルにおけるFNQ-MSNの抗腫瘍効果

平均して4〜5週齢の18〜22グラムの雄BALB / cマウスを、河南省鄭州軽工業大学の家畜施設センターから調達しました。動物は、12時間の暗光サイクルで空調された部屋で飼育され、餌と水を自由に摂取できるようになりました。すべての動物プロトコルは、河南省鄭州軽工業大学の倫理委員会によって承認されました。異種移植モデルを確立するには、1×10 ⁷ 150μlの培地中のCal33細胞をマウスの右股関節に皮下接種しました。腫瘍の平均サイズが80〜100 mm3に達したとき、マウスをランダムに5つのグループに分け、それぞれコントロール、5-FU、ß-lap、5-FU +ß-lap、およびFNQ-MSNに分け、各グループに8匹のマウスを入れました。 。 5-FUは5mg / kgの固定用量で投与され、β-lapは25 mg / kgの固定用量で投与され、尾静脈注射ごとに3日間隔で3回投与されました。マウスの体重と腫瘍の体積を18日間定期的にモニターしました。腫瘍体積は、式を使用して計算されました

本研究では、腫瘍細胞の負荷によるマウスの死亡は観察されず、すべての動物はCO ₂ で安楽死させられました。 その後、研究の終わりに向かって頸椎脱臼によって犠牲にされました。

統計分析

二元配置分散分析（ANOVA）を使用して、複数のグループを比較しました。 p の有意水準 <0.05は有意であると見なされ、それぞれの実験で特に言及されていない限り、すべてのデータは平均±標準偏差として表されます。

結果と考察

5-FU /ß-lapをロードした脂質二重層でサポートされたメソポーラスシリカナノ粒子の調製

この研究では、PEG化脂質二重層によって安定化されたメソポーラスシリカナノ粒子をカスタマイズしました。 5-FU /βラップロードMSNは、エマルジョン超音波処理法によって調製され、次に、DSPE-PEG2000からなる脂質薄膜を含むフラスコに薬物ロードMSNが導入されました。混合物を超音波処理し、5-FU /β-lapを含む脂質被覆MSNを得た（FNQ-MSN）（図1a）。 5-FUとß-lapの負荷効率（LE）は、それぞれ91.5±1.65％と92.9±1.24％でした。 FNQ-MSNは、8.1±1.12 wt％の5-FUと7.6±​​0.95 wt％のß-lapを示し、MSNキャリアの高い負荷容量（LC）を示しています。脂質二重層の存在は、体循環におけるその望ましくない放出を防ぎ、それによって毒性を防ぎます。薬物をロードしたMSNの平均粒子サイズは92.1±0.85nm（PDI〜0.089）でしたが、MSN表面での脂質二重層の集合（FNQ-MSN）は平均粒子サイズを128.4±1.24 nm（PDI〜0.115）に増加させました。 MSNの表面に脂質物質がしっかりと存在している（図1b）。ゼータ電位は-18.2±1.22から-26.4±mVに変化しました。 FNQ-MSNの粒子サイズが小さいため、EPR効果により、漏出性腫瘍組織に薬物を充填した担体を優先的に蓄積することができます。さらに、表面のPEG化により、優れた安定性と血液循環時間が長くなり、腫瘍組織でのFNQ-MSNの可能性がさらに高まります。 ＴＥＭ画像は、リポソームの形態学的類似性を示し、グリッド上に均一に広がった完全な球形を示した。 TEM画像は、後で灰色がかった外側と暗いコアを明確に示しており、MSN表面に脂質集合体が存在することを示しています（図1c）。 TEMから観察されたサイズは、ゼータサイザーからのDLS粒子サイズと一致します。 MSNは、薬物分子を均一に分布させるための秩序だったチャネルを備えています。細孔の表面特性は、小分子の安定した負荷における重要な要素の1つです。ホスト-ゲスト相互作用に関与するさまざまな物理的力には、主に疎水性力とファンデルワールス相互作用力が含まれます。より高い薬物負荷容量は、腫瘍部位におけるより高い細胞内濃度およびより高い殺傷効率を提供するであろう。 FNQ-MSNは、PBS培地で優れた安定性を示し、粒子サイズは30日までの研究期間を通じて変化しませんでした。キャリアシステムのこのような改善された安定性とキャリアシステムの高い負荷容量は、腫瘍治療における生体内分布と効率を改善します。

a 5-FUおよびβ-ラップをロードした脂質二重層でコーティングされたメソポーラスシリカナノ粒子の構築の概略図。 2つの薬剤がMSNの細孔にロードされ、MSNの外面にあるPEG化脂質二重層アセンブリによってさらに安定化されました。 b FNQ-MSNの粒度分布。 c 高倍率の挿入図を使用したFNQ-MSNのTEM画像

インビトロ薬物放出

FNQ-MSNからの5-FUおよびβ-lapのinvitro薬物放出は、PBSおよびABSで研究されました（図2）。示されているように、2つの異なる放出傾向がpH7.4とpH5.0で観察されました。たとえば、24時間でのpH 5.0での薬物放出の約40％と比較して、pH 7.4で24時間で放出される5-FUの25％。同様に、βラップの20％と30％がそれぞれpH7.4とpH5.0で放出されました。放出動態は研究期間を通して同一であり、アルカリ性緩衝液で放出された5-FUの50％と、研究期間の72時間後のpH 5.0での薬物放出の80％でした。酸性条件での薬物のpH応答性放出は、癌治療に有利である。バースト放出現象は、主に研究期間を通してFNQ-MSNからの薬物の放出を制御するDSPE-PEG層の存在に起因する両方のpH条件で観察されませんでした。 pH7.4とpH5.0の条件の間で薬物放出の有意差が観察されました。 pH 7.4条件では、PEG- b -DSPEは高いステルス層特性を示し、それによってカプセル化された化合物の放出を防ぎます。今回の結果は、pH 5.0で薬物放出が加速することを示しており、MSN表面周辺の保護シェルが分解していることを示しています。癌細胞内で最大の薬物放出を保証するpH感受性の薬物放出速度は、抗腫瘍効果を改善し、正常組織への望ましくない毒性を減少させる可能性があります。 pH応答エレメントの存在下で、FNQ-MSNはMSN上の脂質二重層の脱落を引き起こし、より低いpH条件での放出を促進する可能性があります。

pH7.4およびpH5.0の緩衝液条件でのFNQ-MSNからの5-FUおよびβ-lapのinvitro放出。放出研究は72時間まで続けられ、薬物放出はHPLC法を使用して定量化されました。 ** p <0.01

ß-lapに対するNQO1の感度

HNSCCを含む多くの癌細胞におけるNQO1のアップレギュレーションは、予後不良および治療結果の不良に関連しているため、NQO1を標的とする薬剤は癌治療に向けた潜在的な戦略となる可能性があります[24]。 NQO1は、正常組織に関連するものと比較して、扁平上皮癌で100〜200倍の範囲のレベルで過剰発現しています。したがって、NQO1酵素活性に対するβラップの影響をCal33細胞で研究しました。示されているように、β-lapはCal33細胞におけるNQO1酵素活性の濃度依存性阻害を示しました（図3a）。特に、20〜50μg / mlのß-lapの用量で有意な阻害効果が観察されました。さらに、NQO1タンパク質に対するβ-lapの阻害能は、ウエスタンブロット分析によってさらに研究されました（図3b）。結果は、β-lapの濃度の増加に伴う癌細胞のNQO1タンパク質の有意な減少を明確に明らかにしました。約、100μg/ mlのß-lapで80％のNQO1阻害が観察されました。 βラップなどのNQO1生物活性化薬物は、NQO1によって代謝され、不安定なヒドロキノン化合物を形成します。この化合物はすぐに元の成分に戻り、2つの一電子酸化を残して2つのO ^2- を消費します。 。これにより、1分子のβラップが130モルのスーパーオキシドを生成し、60〜70モルのNAD（P）H6を消費するという無駄なレドックスサイクルが作成されます。そのように形成されたスーパーオキシド（O2-）ラジカルは過酸化水素（H2O2-）に変換され、細胞アポトーシスと細胞死を引き起こします[25]。

a 酵素法によるCal33癌細胞のNQO1活性に対するβ-lapの濃度依存性活性の影響。 b ハウスキーピングタンパク質としてGAPDHを使用したウエスタンブロット分析によるNQO1タンパク質レベルに対するβ-lapの濃度依存性活性の影響

HNSCC細胞におけるFNQ-MSNのinvitro抗がん効果

Cal33細胞におけるβ-lapのinvitro抗癌効果をMTTアッセイによって研究した。結果は、β-lapが細胞生存率の典型的な濃度依存性の低下を示したことを明らかにしました（図4a）。特に、50μg/ mlの濃度で細胞生存率の有意な低下が観察されました。さらなる実験のために、20μg/ mlが選択されました（ß-lapのIC50値未満）。次に、5-FUに対するβ-lapの増強効果を3つの異なる濃度（5、10、および20μg/ ml）で研究しました。示されているように、5-FU +β-lapの組み合わせは、細胞生存率の低下をもたらしました。最も注目すべきことに、FNQ-MSNは、個々の薬物または物理的組み合わせのいずれかと比較して、有意に低い細胞生存率を示しました（図4b）。たとえば、5-FUとß-lapは35.7％と70.2％の細胞生存率を示し、5-FU +ß-lapは26.5％とFNQ-MSNは13.1％を示しました。結果は、β-lapと組み合わせると5-FUの細胞毒性効果が有意に増加したことを明確に示しました。 FNQ-MSNは、5-FU +βラップと比較してより効果的であったことは注目に値します。これは、キャリアシステムからのロードされた治療薬のより良い内在化と制御された放出に起因します。結果は、NQO1酵素活性とタンパク質レベルに対するβ-lapの阻害効果を明確に示し、5-FUの抗癌効果を増強し、HNSCCの治療における治療結果の向上をもたらします。

a Cal33細胞の細胞生存率に対するβ-lapの濃度依存性活性の影響。 b 個人および第2の化学療法剤である5-FUとの組み合わせによる細胞毒性効果（それぞれ5〜20μg / mlの3つの異なる濃度）。細胞生存率は、24時間のインキュベーション後にMTTアッセイによって評価されました。 c 5-FUとβ-lapの個別および組み合わせによる処理後のNQO1およびBcl-2タンパク質発現のウエスタンブロット分析

シグナル伝達経路におけるFNQ-MSNの役割：ウエスタンブロット分析

βラップを介した細胞毒性効果のメカニズムは、ウエスタンブロット分析によってさらに調査されました。示されているように、βラップは対照と比較してNQO1のタンパク質バンドの減少をもたらしました。ただし、NQO1レベルの最も顕著な減少は、FNQ-MSN処理細胞グループで観察されました（図4c）。細胞アポトーシスを増強することによるCal33の化学感受性のβラップ誘導性増強を、Bcl-2タンパク質レベルを通して評価した。 Bcl-2ファミリーは、細胞の恒常性を調節する上で重要な役割を果たし、癌細胞の増殖と死を制御します。 Bcl-2の減少とBaxの増加のプロセスにより、細胞質ゾルでシトクロムCが放出され、カスパーゼカスケード全体が開始されて細胞死が引き起こされます[26]。結果は、5-FUとβ-lap（FNQ-MSN）の組み合わせがBcl-2を有意にダウンレギュレーションし、Cal33癌細胞における抗癌効果の増強を示していることを明確に強調しました。

HNSCCのアポトーシス分析

細胞生存率分析に続いて、Cal33細胞に対する個々の薬剤と組み合わせた薬剤のアポトーシス効果を、アネキシンV / PI染色後にフローサイトメーターで評価しました（図5）。個々の5-FU（10μg/ ml）またはß-lap（30μg/ ml）のアポトーシス効果は、癌細胞の感知できるアポトーシスを引き起こしませんでした。しかし、5-FU +β-lapは、癌細胞のアポトーシス率の劇的な増加をもたらしました。重要なことに、FNQ-MSNは細胞アポトーシス（初期および後期アポトーシス）の60％以上をもたらし、キャリアベースの併用レジメンの優れた治療効果を示しています。アポトーシス効果は、ヘキスト33342染色によってさらに確認されました。示されているように、FNQ-MSNで処理された細胞は、5-FUまたはβ-lap単独の場合と比較して、アポトーシス、核凝縮、および断片化の特徴を受ける細胞の量が多くなります（図6）。アポトーシスの過程で、細胞は細胞外膜に損傷を与えることなく収縮し、アポトーシス体の形成を増加させてクロマチンを凝縮させます。

個別および5-FUとß-lapの組み合わせで処理した後のアネキシンVとPIの二重染色を使用したCal33細胞のフローサイトメーター分析。 10,000件のイベントがフローサイトメーターで記録されました

Hoechst33342で染色した後のCal33細胞の核形態分析。細胞は、5-FUとβ-lapの個別および組み合わせで処理されました。 10,000件のイベントがフローサイトメーターで記録されました

ライブ/デッドアッセイ

個別および併用薬の抗癌効果は、Live / Deadアッセイによってさらに評価されました。処理された細胞は、生細胞と死細胞のそれぞれのマーカーとして、カルセインAMとエチジウムブロマイド染色にかけられました（図7）。示されているように、未処理の細胞は100％の緑色蛍光で染色されます。個々の薬剤、5-FU（10μg/ ml）またはß-lap（30μg/ ml）は、わずかに赤色の蛍光染色された細胞を示しました。ただし、優勢な細胞は、限られた細胞死を示す緑色の蛍光を示しました。顕著な細胞死は、主な赤色蛍光と少数の緑色蛍光染色細胞によって示されるように、FNQ-MSNで処理された癌細胞で観察されました。 FNQ-MSNのより高い抗がん効果は、がん細胞における5-FUとβ-lapの相乗作用と、5-FUの化学感受性を高めるβ-lapの能力に起因していました。

個別および5-FUとß-lapの組み合わせで処理した後のカルセインAMと臭化エチジウムの二重染色を使用したCal33細胞の生/死分析

HNSCC異種移植モデルに対するFNQ-MSNのinvivo抗腫瘍効果

動物モデルにおける併用レジメンの有効性をさらに評価するために、HNSCC異種移植片を調製し、それぞれ5 mg / kgの5-FUおよび10mg / kgのß-lapを投与しました。 βラップの医薬品グレードはARQ761であり、現在、転移性悪性腫瘍の治療を目的とした第I相臨床試験が行われています。 ß-lapは、前臨床試験[27]に従って、ヒトの最大耐量の限界を設定しました。これを念頭に置いて、invivo研究のために10mg / kgのβラップの用量を最適に選択しました。示されているように、個別に投与された5-FUおよびβ-ラップでは、未治療の対照と比較して、腫瘍体積の有意な減少は観察されなかった（図8a）。 5-FU +β-lapの物理的混合物で腫瘍体積の顕著な減少が観察されました。ただし、キャリアベースの5-FUとβ-lap（FNQ-MSN）の併用治療は、腫瘍の成長を大幅に遅らせ、担癌異種移植マウスの生存を延長しました。 FNQ-MSNの腫瘍体積グラフは2つの部分に分けることができます。腫瘍体積のわずかな増加が9日目まで観察されたが、腫瘍は9日目から18日目まで有意に増加したが、それにもかかわらず、全体的な腫瘍体積は対照または他のグループのそれと比較して多様に小さかった。個別および併用レジメンの毒性の懸念は、体重の観点から評価されました（図8b）。示されているように、5-FU +β-ラップの物理的混合物は、体重の10％以上の減少によって表されるような重度の毒性をもたらし、5-FUは体重の5％をもたらしました。予想通り、FNQ-MSNは体重の減少をもたらさず、脂質-MSNベースのキャリアシステムの独自の利点を示しています。 FNQ-MSNの強化された抗腫瘍効果は、NQO1酵素およびタンパク質に対するβ-lapの阻害効果に起因し、5-FUの化学感受性を増加させ、Cal33ヒト腫瘍、第2に、脂質二重層で相乗的な抗癌効果をもたらしました。コーティングされたMSNは体循環中に薬物を保護し、腫瘍組織で制御された方法で放出される可能性があります。第3に、ナノキャリアのPEG化により血液循環時間が延長され、EPR効果により腫瘍組織に優先的に蓄積できるようになります[28、29 ]。 PEG化されたMSNは、主に肝臓、脾臓、肺のRESにトラップされ、投与量の80％以上を占めていました。 MSNのPEG修飾は、臓器内のMSNのクリアランス率を明らかに低下させ、粒子の形状に関係なく、PEG化されたNPをRES臓器から除去することがより困難であることを示しています[30、31]。全体として、HNSCCモデルに関するin vivo研究は、安定したナノキャリアにおける5-FU +β-lapの効果的な組み合わせが、関連する毒性効果を軽減しながら腫瘍の治療効果を高める可能性があるという「概念実証」を提供します。

a HNSCC異種移植モデルにおけるFNQ-MSNのinvivo抗腫瘍効果。 HNSCC腫瘍を有するマウスは、5-FU、β-lap、5-FU +β-lap、およびFNQ-MSNで、5 mg / kgの5-FUおよび10mg / kgのβ-lapの固定用量で静脈内投与されました。 3回。腫瘍体積は、有効性分析の一部として記録され、未処理の対照と比較された。 b 腫瘍体積データに対応する体重分析。 * p <0.05および*** p <0.001

データと資料の可用性

この調査中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された記事とその補足情報ファイルに含まれています。

略語

5-FU：

5-フルオロウラシル

EPR：

強化された透過性と保持効果

FNQ-MSN：

5-FU /ß-ラップロードメソポーラスシリカナノ粒子

HNSCC：

頭頸部扁平上皮がん

MSN：

メソポーラスシリカナノ粒子

NQO1：

NAD（P）H：キノンオキシドレダクターゼ1

ß-lap：

ß-ラパコン