メトトレキサートをロードした葉酸結合Au @ SiO2ナノ粒子を使用した乳癌の新しい化学光熱療法

要約

低レベルレーザー治療（LLLT）は、腫瘍組織/細胞を標的とする安全なタイプの光線療法として知られています。さらに、標的ナノ粒子を使用すると、癌治療の成功率が高まります。この研究は、葉酸（FA）/メトトレキサート（MTX）をロードしたシリカコーティングされた金（Au @ SiO ₂）の複合効果を調査するために設計されました。）乳がんとの闘いにおけるナノ粒子（NP）とLLLT。

NPは、FTIR、TEM、およびDLS-Zetaを使用して合成および特性評価されました。 NPは、平均直径が約25 nmで正電荷（+13.3 mV）の球状の形態を持っていましたが、FAおよびMTXと結合した後、それらの正味電荷は約-19.7mVに減少しました。

細胞取り込み研究における我々の発見は、葉酸受容体の高発現のために、FAおよびMTXが両方の乳癌細胞株、特にMDA-MB-231でNPを負荷した後のNPの細胞取り込みの増強を明確に示した。結果は、LLLTが両方の乳がん細胞株に増殖効果を示したが、人工乳がんを標的としたナノ粒子の存在下では、MTTアッセイ（p <0.05）、DAPI染色、および細胞周期の所見。乳がん細胞株に対する最も高いアポトーシス効果は、MTX-FAをロードしたAu @ SiO ₂の組み合わせに曝露された細胞で観察されました。 NPおよびLLLTは、DAPI染色および細胞周期（subG0 / G1の細胞停止を増加させることによる）によって証明されました。化学療法とLLLTを組み合わせることで、副作用を最小限に抑えながら乳がん治療の可能性を高めることができます。

はじめに

乳がん（BC）は、最も頻度の高い女性として、最近、世界中で170万人の新しい症例が報告されています[1]。その複雑な病因と治療への反応の悪さのために、一般的に女性の癌関連死の中心的な原因であることがしばしば知られています[2,3,4,5]。米国では、2014年に約40,000人の女性が紀元前に死亡すると予測されていました[2、6、7]「（www.cancer.org）」。全体で522,000人が死亡しており、これは癌による5番目の死因であり、開発が進んでいない地域では約800,000例、開発地域ではほぼ同じ頻度です[1]。アジア諸国では、60〜70歳に頻繁に見られる西欧諸国と比較して、最も年齢が高いのは40歳または50歳の成人です[8]。 BCの主な危険因子は、女性の性別、家族歴、年齢、および30歳以上での最初の出産、早発月経とその後の閉経、および無産などのさまざまな生殖傾向です[9]。

癌との闘いの主な目的は、腫瘍、主に転移を排除し、さらに再発を予防するために、毒性が低く特異性が高い効果的な治療計画を策定することです。しかし、外科手術、化学療法、放射線療法などの現在使用されている癌治療アプローチは、さまざまな副作用を示し[10、11、12]、すべてがこの目的を達成することができません[13、14]

過去数十年は、癌の治療において大きな闘争を観察してきました[15、16]。現在人気のある治療アプローチの間に、熱療法は将来の治療法として成長してきました[17]。最近、潜在的に効果的で非侵襲的な癌治療としての光熱療法（PTT）が大きな注目を集めています[18、19]。光吸収ナノ構造に基づくPTTは、一般的な方法とは異なる方法になっています[20、21]。典型的なPTTでは、PTT剤を使用して、レーザー照射（700〜1100 nmの範囲の近赤外（NIR）光）下で十分な温熱療法（42°C）を取得することにより腫瘍を破壊することが、非常に正確で、がん治療のごく侵襲的な方法[22、23、24、25、26、27、28]。

多くのナノ粒子が、造影剤、薬物送達担体、およびレーザー、電波、超音波などのエネルギーモダリティの治療効果の原因となる熱現象への変換器として広く研究されてきました[29、30、31、32、33 、34、35、36、37、38、39]。

金ナノ粒子は、局在表面プラズモン共鳴（LSPR）が高く、生体分子との表面結合が容易なため、過去10年間で大きな注目を集めてきました[40]。彼らは、生物学的システム[44]に有害な副作用がなく、NIR領域[41,42,43]で高性能の光熱変換能力を明らかにしました。

金ナノ粒子は有望な光合成装置として認識されていますが、NIRを繰り返し照射すると光熱安定性が低いため、金ナノ粒子は徐々に光熱変換能力を失い、臨床現場での使用が制限されていました。さらに、金ナノ粒子は、薬物負荷容量が低く、薬物放出プロファイルが制御されているため、優れた薬物担体ではありません[45、46]。あるいは、メソポーラスシリカナノ粒子（MSN）は、その高い薬物負荷能力とその分解から生じる有毒な内容物の欠如のために、適切な薬物、DNA、およびタンパク質担体であることが知られていました。それらはまた、大きな表面積、制御可能なサイズ、非常に利用可能な細孔容積を有し、そして所望の表面特徴が改変に適用される[47]。

化学療法剤および癌標的リガンドに結合した後のナノ粒子は、非特異的送達、貧弱な水溶性、および低い治療指数などの通常の化学療法の不利な点を抑制することができます[48、49]。

ドキソルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ドセタキセルなどの化学療法特性を示す薬剤は、単独で、または主なコア治療として組み合わせて使用されるか、PTTなどの他の治療に使用されます。化学療法薬の副作用を経験している癌患者のほとんどは、すべての臓器に影響を与える患者の体内での不正確な分布が原因です。これらの薬は、血液細胞、内臓を覆う粘膜細胞、毛包など、急速に成長する正常細胞の一部を傷つけます[50,51,52,53]。

メトトレキサート（MTX）は、関節リウマチや、皮膚、肺、頭頸部、乳房などのいくつかの種類の腫瘍に最も頻繁に使用される薬剤です[54、55]。これは、チミジル酸合成とプリン合成に必要なテトラヒドロ葉酸とその副産物の生成に寄与する酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）を阻害し、両方とも細胞増殖と細胞増殖に不可欠です。したがって、DHFRメトトレキサートをブロックすると、4つの基本的な高分子DNA、RNA、チミジル酸、およびタンパク質の合成が妨げられます[56]。

残念ながら、ほとんどの従来のPTT剤と同様に、主な課題は、全身注射後に標的組織にGNPを選択的に蓄積することです[57,58,59]。標的癌治療は、正常な健康な細胞の曝露を減らしながら、特定の癌細胞への化学療法薬の送達を可能にします。これにより、全身毒性の低い癌細胞により多くの薬剤を投与できるようになりました。リガンドを標的としたナノ粒子は、正確に同定された癌細胞マーカーであり、癌細胞表面で高度に発現しています[40]。

葉酸（葉酸またはビタミンB9）は細胞の成長と代謝のための重要な材料です。葉酸受容体タンパク質に対する葉酸の親和性が高いため、癌を標的とする要素として利用されています。腫瘍バイオマーカーとしての葉酸受容体は、乳がん、卵巣がん、肺がん、腎臓がん、脳がん、結腸がんなどの明確な悪性細胞で過剰発現しています[60]。葉酸結合薬物送達システムは、エンドサイトーシスを介して薬物の細胞取り込みを強化します[61]。

材料と方法

試薬と材料

実験には、再蒸留水（Ghazi Company、タブリーズ、イラン）と分析グレードの化学試薬を使用しました。 Sigma-Aldrich Companyから、テトラエチルオルトシリケート（TEOS、98％）、（3-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（MPTES、純度95％）、葉酸、およびローダミンBを含む多くの試薬を購入しました。材料のグループはMerckから購入しました。 Co：塩酸（HCl、37％）、アンモニア溶液（25％）、トルエン水酸化ナトリウム（NaOH、98％）、およびその他の溶媒。 MTXは、イランのタブリーズにあるZahravi FarmaCompanyから購入しました。

インストルメンテーション

この研究では、粒子のサイズと形態を分析するために、透過型電子顕微鏡（TEM）（LEO 906、ドイツ）を使用しました。室温で水溶液に懸濁したナノ粒子を約100μL調製しました。溶液をTEMの銅グリッド上にコーティングされたカーボンフィルムに転写し、続いて凍結乾燥し、80KVで観察しました。粒子サイズの決定は、Zetasizer Nano ZS90、Malvern Instruments、Malvern、UKを使用した25°CでのDLS（動的光散乱）測定によって実行されました。調製されたNPのゼータ電位測定は、光子相関分光法（Zetasizer-ZS、Malvern Instrument、英国）によって実行されました。ダブルビームUV-Vis分光光度計（UV-1601 PCモデル島津製作所、京都、日本）を使用して、光路長10mmの700μL石英キュベットによる吸光度測定を行いました。ドイツのBrukerTensor 27分光計からのフーリエ変換赤外（FTIR）分光法を使用して、KBrペレット法を実行しました。 pH測定は、Metrohm 713 pHメーター（Herisau、スイス）を使用して行いました。攪拌には、メカニカルスターラーHeidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer（Schwabach、Germany）を使用しました。 FAおよびMTXのカプセル化効率は、UV-vis検出器Waters 2500 Pump 1000検出器（Waters、マサチューセッツ州ミルフォード）を備えたWaters2690分離モジュールで構成されるHPLCシステムを使用して計算されました。クロマトグラフィー分離は、C18 m Bondapak（250 mm 4.6 mm、10 mm、125 A Waters、アイルランド）クロマトグラフィーカラムを使用して周囲温度で実施しました。

Au @ SiO ₂の準備ナノ粒子

SiO ₂ NPは、以前に報告されたゾルゲル法[62、63]に基づいて合成されました。次のステップでは、チオール官能化シリカコーティングナノ粒子（TFSNP）を、以前の研究[64]で述べた方法に従って調製しました。 Auナノ粒子はクエン酸還元法（Turkevich法）によって生成されました[65]。最後に、TFSNPの表面はAuNPで覆われていました。最初に、TFSNPをバスソニケーターを使用して少なくとも1時間水に分散させ、AuNPs溶液に添加し、さらに30分間超音波処理しました。反応は、25℃で動的撹拌しながら暗条件で2日間行った。 Au @ SiO ₂ 紫色の外観を持つナノ粒子を遠心分離（10000 rpm、10分）で収集し、真空オーブンで乾燥させました。

MTXおよびFAの読み込み

MTXとFAがAu @ SiO ₂にロードされましたナノキャリアは次のとおりです。MTX（10 mg）をPBS（5 mg / mL、pH 7.4）中のナノキャリアの10 mLの十分に分散した懸濁液に添加し、室温で1日暗条件で適度に攪拌しました。 MTXはAu @ SiO ₂をロードしましたナノキャリアを遠心分離によって収集した。無負荷のMTXの測定のために上清を収集した。次に、MTXはAu @ SiO ₂をロードしましたナノキャリアをPBS（5 mg / mL、pH 7.4）に分散させ、FA（10mg）を溶液に加え、室温でさらに1日間、暗条件で適度に攪拌しました。 FA-MTXはAu @ SiO ₂をロードしました遠心分離によってナノキャリアを収集し、最終ステップで非結合FAを計算するために上清を分離しました。 FA-MTXはAu @ SiO ₂をロードしましたナノキャリアを凍結乾燥し、次の実験のために保存しました。非結合MTXおよびFAの量は、以前に報告されたプロトコル[66]によるHPLC法を使用して計算されました。葉酸を水酸化アンモニウム（10 wt％）に溶解し、移動相で希釈しました。 MTXと葉酸のリテンションタイムはそれぞれ10.5分と5.95分でした。三重のサンプルが適用された。薬物負荷効率（DLE）は、次の式で計算されました。

$$ ee \ left（\％\ right）=\ frac {\ left（initial \ total \ Drugs- Unabsorbed \ Drugs \ right）} {Initial \ total \ Drugs} \ times 100 $$（1）

細胞株の選択と培養

MCF-7およびMDA-MB-231を含む報告された表面発現レベルの葉酸受容体（FR）[67]を持つ2つの乳がん細胞株を選択し、細胞毒性調査のためにPasteur Cell Bank（テヘラン、イラン）から購入しました。選択した細胞株は、RPMI1640（Thermoscientific）、10％ウシ胎児血清（FBS）、および1％Penstrep（Thermoscientific）を含む完全培地で、37°C、5％CO _{2 、および湿度95％。}

細胞毒性アッセイ

レーザー照射なしで異なるNP処理後の細胞増殖を測定するために、細胞生存率アッセイを実施しました。簡単に説明すると、MCF-7またはMDA-MB-231細胞を、細胞密度1.5×10 ⁴ の96個のマイクロプレートに播種しました。次に24時間、細胞をMTX、Au @ SiO ₂で処理しました。およびFA-MTXをロードしたAu @ SiO ₂ NP。処理されていない細胞を対照と見なした。次のステップでは、5μg/ mlの最終濃度のテトラゾリウム色素MTT（Sigma）を細胞に添加し、37℃で4時間インキュベートしました。次に、ＭＴＴ溶液を除去し、沈降したフルマザン結晶を、穏やかに振とうしながら１０分間、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＢｉｏＩｄｅａ、イラン）に溶解した。最後に、ELISAリーダーによって570nmで吸光度を測定しました。細胞の生存率はコントロール細胞に対して正規化され、バックグラウンドはブランク測定値の減算によって除去されました。

invitroレーザー治療

低レベルレーザー治療（LLLT）では、出力出力185mWの810nm波長NIRレーザー（DiodeレーザーMustang 2000、ロシア）を癌細胞破壊に使用しました。最初は、セル密度が1.5×10 ⁴ のMCF-7およびMDA-MB231セル Au @ SiO ₂で処理およびFA-MTXをロードしたAu @ SiO ₂ 次に、NPをさまざまなレーザー線量（30、60、75、90、および105 J / cm ² ）のレーザー照射にさらしました。）および固定露光時間（139秒）。レーザー照射のみにさらされた細胞（NPなし）とNPなしの細胞、およびレーザー処理は、それぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールと見なされます。レーザー照射の24時間後、細胞生存率をMTTアッセイ法[64]で測定しました。

ナノ粒子細胞取り込みアッセイ

各細胞株の表面修飾ナノキャリアの特定の効果を確認するには、NP細胞の内部移行の詳細なチェックが不可欠です。本研究では、MCF-7およびMDA-MB-231細胞株によるNPの取り込みを定性的にチェックするために、定量的および蛍光顕微鏡としてフローサイトメトリーの両方を採用しました。

ＮＰの懸濁のために、ＰＢＳ中のローダミンＢ（ＲｈｏＤ）溶液を、周囲温度および暗室で２４時間撹拌しながら加えた（漂白を防ぐ）。次に、RhoDをロードしたNPを、公称分子量限界（NMWL）が30kDaのAmiconFilterで分離し、5000 rpmで15分間遠心分離し、PBSバッファーで洗浄して無制限のRhoDを除去しました。細胞を5×10 ⁵ の密度でプレートに播種しましたウェルごとに合流点に到達させます。細胞をローダミンBをロードしたNPで30、90、180分間処理し、未処理の細胞をコントロールとして使用しました。その後、細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄した後、フローサイトメトリー分析（BD BiosciencesFCASCaliburフローサイトメーター; BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ、米国）で蛍光を定量しました。ローダミンB標識NPまたはNPDの細胞内取り込みは、蛍光顕微鏡によってさらに確認されました。 MCF-7およびMDA-MB-231細胞をカバーガラス上で増殖させ、24時間後に細胞を遊離Au @ SiO ₂で処理しました。 NPおよびMTX-FAをロードしたAu @ SiO ₂ NP。 30、90、180分間インキュベートした後、細胞をPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡（Olympus顕微鏡Bh2-FCA、日本）を使用してローダミンB標識ナノキャリアの取り込みを観察しました。

蛍光顕微鏡によるアポトーシス研究

アポトーシスの核定性的研究の1つの方法は、DNAに結合し、適切な顕微鏡で検出可能な蛍光色素DAPIです。 DAPI染色について以前に報告されたプロトコル[68]を使用しました。まもなく、MCF-7またはMDA-MB-231細胞を5×10 ⁵ の密度で6ウェルフォーマットの容器にプレーティングしました。それらを付着させて24時間成長させます。 MTXで処理した後、Au @ SiO ₂ NPおよびMTX-FAをロードしたAu @ SiO ₂ レーザー処理の有無にかかわらず、NPは細胞をPBS（Sigma）で洗浄し、次に10％ホルムアルデヒド（Merck）で固定しました。次に、細胞をTriton X-100（Sigma）で15分間透過処理しました。適切に洗浄した後、細胞をDAPI（シグマ）で5分間染色しました。最後に、アポトーシス核（断片化またはしわ）を蛍光顕微鏡（オリンパス）で視覚化しました。何も処理されていない細胞はネガティブコントロールと見なされ、セルはポジティブコントロールとしてレーザー照射のみを受けました。

細胞周期障害の調査

MCF-7およびMDA-MB-231の細胞周期分布は、フローサイトメトリー分析によって決定されました。このようにして、細胞に5×10 ⁵ の開始集団を播種しました。そして80％の合流点に達することができました。続いて、MTX、Au @ SiO ₂で処理された細胞 NPおよびMTX-FAをロードしたAu @ SiO ₂ レーザー照射の有無にかかわらずNPが実行されました。何も処理されていない細胞はネガティブコントロールと見なされ、セルはポジティブコントロールとしてレーザー照射のみを受けました。次に、適切なPBS洗浄に続くトリプシン処理によって細胞を回収した。次に、細胞をエタノール（メルク）で48時間固定した。次のステップでは、固定した細胞を洗浄し、リボヌクレアーゼA（Cinaclone）で処理した後、暗所でヨウ化プロピジウム（PI）（Sigma）を添加しました。蛍光シグナルは、Beckton DicinsonCompanyのFACSセットによって検出されました。

調査の統計

各ステップの実験は3回繰り返して行われ、結果は平均±SDとして報告されました。 ANOVAは、グループ間の有意性の比較に使用されました。差異は、確率値がSPSSソフトウェアによって<0.05で計算された有意性を反映しています。

結果と考察

合成されたNPの特性評価

Au @ SiO ₂ NPは4つのステップで生成されました：1-SiO ₂の合成ナノ粒子、2-SiO2 NPへのチオール含有リンカーの付加、3-金ナノ粒子の合成、4-金ナノ粒子のSiO2リンカー複合体の表面への付着（図1）。 Au @ SiO ₂の合成に成功 FTIRによって確認されました（図2a）。 Si–O–Siのピークは1088 cm ^-1 付近に現れました。 3000〜3700および803 cm ^–1 の広いピークは、それぞれ遊離シラノールO–H基の伸縮と面外曲げに起因します。脂肪族C–H伸縮振動は、2950 cm ^–1 に強いピークとして示されました。。 3つのメトキシシラン基のC–Oは、1191 cm ^–1 のピークで示されました。。

動的光散乱（DLS）測定は、FA-MTX共役Au @ SiO ₂ NPのサイズはナノメートルの範囲（105±2.3nm）で、サイズ分布は狭い（図2b）。

ゼータ電位は、ナノ懸濁液の安定性に影響を与える重要な物理化学的パラメーターです。極端に正または負のゼータ電位値は、より大きな反発力を引き起こします。他方、粒子の高い電荷は、正であろうと負であろうと、NPを肝臓の食細胞に吸収させて体を処分させる。静電安定化と立体安定化を組み合わせた場合、±20mVの最小ゼータ電位が望ましい[69,70,71]。 NPのゼータ電位データは、pH =7.4およびT =25°CでMTX-FAをロードする前後で比較されました（図2c）。得られたAu @ SiO ₂のゼータ電位 NPは+ 13.3mVでしたが、二重薬物負荷後は-19.7 mVに減少し、これは望ましい範囲内でした。 MTXとFAは、その構造内の2つのカルボン酸基の脱プロトン化により、pka（3.8と4.8、3.5と4.3）を超えるpH（7.4）で負の正味電荷を示しました（[72]、https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov。）。したがって、Au @ SiO ₂にMTXとFAを同時にロードした後 NP、正味電荷は負になりました。

TEM分析は、明確な個々の粒子サイズを提供します。 Auナノ粒子は、灰色の層としてSiO2NP上に分散した暗い球として見られました。 TEM画像により、Au @ SiO2 NPは、粒子の平均サイズが約25 nmである均質な球形で合成されていることが確認されました（図3）。

薬物の装填

ここで、葉酸は、受容体を介したエンドサイトーシスを介して葉酸受容体を過剰発現し、GNPの内在化の低い有効性を圧倒する特定のタイプの癌細胞におけるGNPの取り込みの増加を媒介しているため、腫瘍マーカーとして知られる葉酸受容体および腫瘍に対する葉酸の使用が増加しているターゲティング[67、73]。

MTXおよびFA分子がAu @ SiO ₂に結合した後 NP、ゼータ電位は+13.3から-19.7mVに変化しました。 MTXの2つのカルボン酸部分の推定pKa値は3.8、4.8であり、FAは3.5および4.3です[72]、https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov。したがって、pkaを超えるpH 7.4でのMTXとFAの2つのカルボン酸基の脱プロトン化により、正味電荷は負になり、Au @ SiO _{2 > NP。 De Ying Tian et alは、直径18mmと30mmのAuナノ粒子へのMTX負荷は、それぞれ15±0.4％と10±1.0％であることを示しています[74]。この研究では、FAとMTXをそれぞれ22.6％と77.5％のカプセル化効率でAu @ SiO2NPにロードしました。 MTXとFAの同時評価ピークのクロマトグラムを図2dに示します。}

細胞の取り込み

細胞内光熱剤は光熱癌治療の効率を改善できるため[75]、光熱物質の細胞内在化が必要であると考えられてきました。 invitro 細胞取り込み試験は、葉酸受容体を高度に過剰発現することが知られているヒト乳がんMDA-MB-231細胞を使用して実施されました[40]。ターゲティング剤としてのFAの役割と、Au @ SiO ₂の取り込みにおける表面コーティングの効率を研究すること標的細胞、MCF-7およびMDA-MB-231細胞によるNPは、Au @ SiO2NPおよびMTX-FAをロードしたAu @ SiO2NPで処理されました。細胞取り込みの平均蛍光強度の結果を図4に示しました。結果は、MCF-7とMDA-MB-231の両方でAu @ SiO2 NPの取り込みが、すべてのサンプルの細胞培養時間にわたって増加したことを示しました（図4および5）。）。また、MTXおよびFAによるAu @ SiO2 NPの表面装飾後、葉酸受容体発現細胞としてのMCF-7およびMDA-MB-231の両方で細胞取り込みが有意に増加しました。 MTX-FAをロードしたAu @ SiO2 NPのMDA-MB-231細胞への取り込みは、MCF-7よりも多かった。 MDA-MB-231細胞はより高レベルの表面葉酸受容体を発現するため、葉酸受容体を標的とするNPの大部分が受容体を介したエンドサイトーシスメカニズムを介して侵入し、細胞への取り込みが増加します。別の研究では、葉酸結合NPの細胞内在化の増加は、aHFRの細胞表面発現が少ない健康な細胞ではなく、aHFRを過剰発現する癌細胞でのみ発生しています[40]。 Au @ SiO2 NPとFAの結合は、NPおよびメトトレキサートの細胞取り込みを促進し、MDA-MB-231細胞に対する毒性を高めることができます[76]。

細胞毒性アッセイ

遊離MTX、ブランクAu @ SiO ₂のinvitro細胞毒性研究 NPおよびMTX-FA共役Au @ SiO ₂ NPは、24時間、48時間、および72時間のMTTアッセイによって評価されました（図6）。 MTTアッセイの結果は、Au @ SiO ₂ NPは、MCF-7およびMDA-MB-231細胞株に対して細胞毒性効果を示しませんでした。さらに、遊離MTXとMTX-FA結合Au @ SiO ₂の両方の細胞毒性効果を比較する NP、同じ濃度のMTX（25、50、100、および200μg/ mL）をすべての処理時間に使用しました。細胞毒性の結果は、遊離のMTXまたはMTX-FAがAu @ SiO ₂と結合していることを示しています NPは、24時間の処理後、両方の細胞株で約10〜25％の死亡率を示しました。以前の研究では、invitro条件下でのマウス骨芽細胞MC3T3-E1細胞やヒト歯根膜幹細胞などのさまざまな細胞株に対する金ナノ粒子の増殖効果が報告されています。私たちの結果はこれらの研究と一致しており、図6aおよびbは遊離Au @ SiO2NPの増殖効果を示しています。したがって、MTXとFA-MTXをロードしたAu @ SiO2ナノ粒子（NPD）の同等の細胞毒性効果は、この現象による可能性があります[77、78]。

レーザー照射

この研究では、Au @ SiO ₂で処理されたMCF-7およびMDA-MB231細胞の細胞生存率 NPおよびMTX-FAをロードしたAu @ SiO ₂ 30〜105 J / cm ² の範囲の線量でレーザー照射した後のNP MTTアッセイによって調査されました。 MTX-FAをロードしたAu @ SiO ₂で処理したMCF-7およびMDA-MB-231細胞の死亡率 75 J / cm ² の用量でのLLLT後のNP（MTX濃度は100μg/ mL）それぞれ約39％と45.5％でした。同じ条件で、Au @ SiO ₂で処理されたセルレーザー照射後またはレーザー単独後のNPは、明らかな細胞死を示さなかった。また、レーザー線量を105 J / cm ² に増やすことによって両方の細胞株の死亡率は60〜75％に増加しましたが、両方の細胞株はAu @ SiO ₂で処理されました。同じ照射線量でのNP +レーザーまたはレーザーのみは細胞毒性効果を示さなかった。 MTX-FAをロードしたAu @ SiO ₂との併用療法後のMCF-7およびMDA-MB-231細胞のIC50値 NP（100μg/ mLのMTX線量）およびLLLTは、90および75 J / cm ² の線量で得られました。、それぞれ。一方、MTXおよびMTX-FAをロードしたAu @ SiO ₂の死亡率 100μg/ mLのMTX線量（レーザー治療研究のために選択された線量）でのレーザー照射なしのNPは、両方の細胞株で15〜25％でした。これらの結果は、MTX-FAの組み合わせがAu @ SiO ₂をロードしたことを示しています。 NPs and laser therapy showed a synergistic effect in both cell lines and significantly decreased the cell viability (p <0.001) compared to cells received only laser irradiation. These results indicated that NPs treatment, especially with targeting strategy can improved the efficacy of laser therapy in breast cancer cell destruction (Fig. 7).

Apoptosis study by DAPI

The apoptosis were studied in MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treatment with Au@ SiO₂ NPs; MTX-FA loaded Au@ SiO₂ NPs with or without laser to know if laser treatment could enhance the efficacy of chemotherapy. Our results summarized in Fig. 8 indicated that normal MCF-7 and MDA-MB-231 cells without any treatment set as control as well as cells treated with laser alone or free Au@SiO₂ NPs without laser irradiation had typical nuclei, lacking any apoptosis. However, MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with free MTX, Au@ SiO₂ NPs with laser irradiation and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs without laser irradiation showed partial apoptotic nuclei (Fig. 8). The cells treated with MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs in combination with laser irradiation (810 nm, 75 J/cm² , 139 sec) showed a major drop in MCF-7 and MDA-MB-231 cell population. Therefore, laser irradiation efficacy was enhanced after MTX/FA loaded Au@SiO₂ NPs uptake on MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Hence, the novel developed MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs has the capability of augmenting the photothermal effects by highly fragmented cell nuclei, a radical rise in cell loss and complete damage of cells.

Cell cycle

Cell cycle distributions after treatment with MTX, Au@SiO₂ NPs and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs either in combination with LLLT (75 J/cm² ) or without laser irradiation was studied in both MCF-7 and MDA-MB-231 cells using flowcytometry and PI staining of DNA. Our study indicated that in MDA-MB-231 or MCF-7 cells, the percentage of non-treated cells (control group) were actively in phase S (Fig. 9a, b). Using 75 J/cm² laser treatments reduced the percentage of cells in S-phase in a non-significant manner. On the other hand the cells irradiated with LLLT without NP and drug treatment showed the significant increase in Go/G1 cell population indicated the safety of LLLT alone. Also NPs treatment did not disturb the cell cycle in both cell lines. Treatment of cells with free MTX in the absence or presence of laser irradiation showed some disturbances in cell cycles, including reduction of cells in S-phase. Using NPD alone reduced the cells in S-phase. And interestingly using MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) enhanced the cell percentage in sub Go/G1 as a sign of apoptosis [72]. Also the percentage of the MDA-MB-231 cells present in sub Go/G1 (around 18%) were significantly higher than MCF-7 cells (12%) in MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) treatment group due to the higher uptake of NPs in MDA-MB-231 cells.

Ramos et al , showed that in tumor cells, LLLT increases the percentage of cells in S and G2 /M phases, also they detected a reduction in proliferation and enhancing in senescence [79]. The cell cycle study after LLLT (15 J/cm2) showed a G1 arrest, which is in line with growth stopover in irradiated TK6 cells [80]. Another group reported that PTT is primarily disturbing cells in the S phase and increasing the cell population and arrest in the G2/M phase [81]. As a result, PTT can induce radio-sensitization of the cells via disturbing cell cycle [82]. Their results are in accordance with our study, which showed cell cycle disturbance and reduction of cells in S-phase. Our study also showed the increase in population of apoptotic cells (sub Go/G1) after combination chemo-photothermal therapy. Therefore, applying a combination of LLLT and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) as breast cancer targeted nanoparticles could enhance the breast cancer therapy efficacy.

Conclusions

In this study MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs was designed for target breast cancer therapy in combination with LLLT as noninvasive, FDA approved laser therapy. MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs with spherical morphology and mean diameter of 25nm and surface charge of -19.7 was obtained. This size and surface charge is in a suitable range to increase the bio-distribution of NPs. The successful targeted strategy of this novel developed NPs was approved with a higher cellular uptake percentage of MDA-MB-231 compared to MCF-7 as two breast cancer cell lines with different folate receptor expression. The MTT assay, DAPI staining and cell cycle study's results indicated that the combination of chemo-photothermal therapy showed synergistic effect and the cytotoxicity and apoptosis effect on both breast cancer cell lines especially on MDA-MB-231 cells was increased significantly(p <0.001). Since the Au@SiO₂ nanoparticles or LLLT showed no cytotoxic effects, it can be concluded that our therapeutic design has synergistic effects on targeted site. The findings of this study could be useful for designing future cancer therapy programs using bio-chemotherapy combined with low level lasers.