SPIOナノ粒子の合成とその後のパーキンソン病の幹細胞標識への応用

はじめに

パーキンソン病は、中脳のドーパミン作動性ニューロンの進行性の喪失を特徴とする神経変性疾患です。比較的限局性の障害があるため、細胞ベースの治療法の候補として適しています。胎児中脳組織[1]から胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞（iPSC）[2]に由来する誘導ニューロンに至るまで、いくつかの細胞型がPDの治療に関与しています。しかし、適用中に倫理的な懸念と腫瘍形成の潜在的なリスクを回避することはできませんでした[3]。間葉系幹細胞（MSC）は、PDを含む神経変性疾患の有望な治療ツールとして過去10年間に報告されている多能性幹細胞集団です[4、5]。他の細胞タイプと比較して、MSCは良好な増殖、人体全体での広範な利用可能性、および免疫抑制能力を示します。いくつかの研究は、MSCの頭蓋内移植が神経保護、神経分化および免疫調節を促進することを示しています[6,7,8]。これらの研究では、in vivoでの移植細胞の生存率、移動、統合を追跡することは、幹細胞機能の基本的な理解と臨床的有効性の評価に不可欠です。

移植された細胞の治療効果をよりよく分析するために、様々なトレーサーが開発されてきた。トレーサーの安全性と有効性は、アプリケーションに影響を与える最も重要な要素です。蛍光タンパク質による標識と比較して[9]、超常磁性酸化鉄（SPIO）粒子を使用した追跡は、移植された細胞に遺伝子組み換えをもたらさないでしょう[10,11,12]。いくつかの研究では、移植された細胞を視覚化および追跡するための効果的な造影剤としてSPIOを使用しています[6、13、14]。ただし、市販のSPIOの一部は、MSCの通常の機能に影響を与えることが報告されています[15、16、17]。したがって、新しいSPIOを開発するために多大な努力が注がれてきました。本研究では、ポリアクリル酸（PAA）とそれに続くメトキシポリエチレングリコールアミン（PEG）層で超小型SPIOナノ粒子（USPIO）コーティングを合成しました。新規USPIO-PAA / PEGは、invitroおよびinvivoで良好な細胞内在化と長期MRI追跡能力を示します。さらに、ヒト脂肪組織（HADSC）に由来するUSPIO-PAA / PEG標識MSCは生物学的特徴を維持し、行動障害を改善し、PD動物モデルの黒質におけるTH免疫反応性を高めました。

材料と方法

資料

鉄アセチルアセトナート、TREG（トリエチレングリコール）、ジエチレングリコール、およびPEGは、Aladdin Industrial Corporation（上海、中国）から購入しました。メチルチアゾリルジフェニル-テトラゾリウムブロミド（MTT）は、Sigma-Aldrich Corporation（上海、中国）から購入しました。ダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）、トリプシン-EDTA（0.25％）、およびウシ胎児血清（FBS）は、Thermo FisherScientificから購入しました。 1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩およびN-ヒドロキシスクシンイミドはSigma-Aldrich（中国）から購入しました。 N、N-ジメチルホルムアミド、エチルアルコールアブソリュートおよび酢酸エチルは、Sinopharm Chemical ReagentCorporationから購入しました。超純水は、ミリポアの純水および超純水浄化システムによって製造されました。抗ヒトCD90-FITC、抗ヒトCD45-PE、抗ヒトCD34-FITC、および抗ヒトCD105-PEはBiolegendから購入しました。

USPIOの合成

USPIOは、以前の研究[18,19,20,21]としてポリオール法によって合成されました。実験の手順は次のとおりです。アルゴン、球状凝縮管、温度計に接続された3つ口フラスコで、アセチルアセトナート鉄1mmolとTREG25mLを混合しました。アルゴンフローで15分間インキュベートした後、混合物を120℃に加熱し（加熱速度は3°C /分）、1時間維持し、次に混合物を同じ加熱速度でさらに250°Cに加熱して維持しました。 30分間。反応混合物を自然に室温まで冷却し、2 mLの無水エチルアルコールで希釈した後、酢酸エチルで沈殿させました。 8000 rpmで20分間遠心分離して沈殿物を収集し、無水エチルアルコールに再懸濁しました。 USPIOは、さらに使用するために4°Cで無水エチルアルコールに保存されました。

PAA / PEGコーティングUSPIOの準備

USPIO-PAAは、以前のレポート[22]に従って取得されました。詳細には、ポリアクリル酸（PAA）1.5gを24mLのジエチレングリコールに溶解しました。 5分間のアルゴンフロー後、混合物を110°Cに加熱し、溶液が透明になるまで維持しました。前のステップで調製した28mgのUSPIOを含むエタノール分散液を、超音波分散後に上記の清澄化した溶液に添加しました。最後に、溶液を3°C /分の速度で210°Cに加熱しました。 2時間の還流後に反応を停止し、自然に室温まで冷却しました。冷却後、酢酸エチルを反応溶液に加えてUSPIO NPを沈殿させ、8000 rpmで20分間遠心分離して、上清を除去しました。次に、沈殿物をエタノールに分散させ、続いて酢酸エチルで沈殿させた。 3回の洗浄後、USPIO-PAAを超純水に分散させて使用しました。生体適合性を改善するために、EDCおよびNHSを介したアミド化によってPEGをナノ粒子の表面にさらに結合させました[23]。 0.45gのPEGを5mlの超純水に溶解し、20mgのEDCと12mgのNHSを添加した15mlのUSPIO-PAA分散液（35 mgのFeを含む）に添加しました。混合物を室温で2時間機械的に撹拌し、次に10 mlのDMF溶媒を加え、回転蒸発装置で40℃の水を除去しました。最後に、40mgのDECと24mgのNHSを混合物に加え、室温で48時間混合しました。反応溶液を超純水中の透析バッグに72時間移し、その間、12時間ごとに超純水を交換しました。混合物をさらに限外ろ過チューブに移し、4000 rpmで10分間遠心分離することにより、Mr> 30kDの分子を収集しました。最終製品を超純水に溶解し、4℃で保存しました。場合によっては、水に溶解したSPIO-PAA / PEGを限外ろ過遠心分離管（> 30 KDポアサイズ、ミリポア）で遠心分離して収集し、さらに実験するためにペレットを真空オーブンで乾燥させました。

NPの特性評価

サンプルの粒子サイズ、サイズ分布および形態をTEMによって分析した。コーティング層はネガティブ染色によって測定された。超音波分散後、水溶液中のUSPIO-PAAおよびUSPIO-PAA / PEGを300メッシュの炭素支持膜の銅ネットワークに添加し、自然乾燥させた後、投影型電子顕微鏡（Tecnai G2F20 s-twin、FEI）に入れました。観察用。

赤外分光分析は、Agilent Technologies Cary 600シリーズFTIR分光計で実行され、乾燥したサンプル粉末がサンプルタンクに直接追加されて検出されます。

USPIO-PAA / PEG分散液中のFe含有量は、モデルがPerkinElmer Analyst 700であるフレーム原子吸光分析（FAAS）によって決定されました。最初に、1、2、3、4、および5μg/ mLの鉄標準溶液が標準曲線、次に100μLのUSPIO-PAAまたはUSPIO-PAA / PEG分散液を硝酸で溶解し、鉄の含有量を50mLの容量フラスコで測定しました。

ナノ粒子の磁気共鳴画像法は、蘇州大学の最初の付属病院の画像部門で、磁場が3Tの臨床スキャナーで実施されました。ナノ粒子は、対応する濃度に従って1％アガロースゲル溶液に分散されました。溶液が固化した後、サンプルの横緩和時間をマルチエコーシーケンスで測定しました。 MRIの取得をDICOM形式でエクスポートし、RadiAnt DICOMビューアーを使用して開いてグレー値を読み取り、フィッティングのためにさまざまなエコー時間のグレー値を原点にインポートすることにより、さまざまな濃度のUSPIO分散の横緩和時間値を取得しました。;最後に、USPIO-PAAおよびUSPIO-PAA / PEGサンプルの横緩和率r2は、1 / T2の横緩和率とサンプルのFe濃度を用いた線形フィッティングによって得られました。 USPIO-PAAおよびUSPIO-PAA / PEGの磁気ヒステリシスループは、前述の方法[24]に従って、蘇州科技大学のQuantum DesignDynaCool-9デバイスを使用して取得されました。

HADSCの分離と識別

すべての研究は、「ヒト胚性幹細胞研究に関する倫理的指導原則」（科学技術省および保健省、中華人民共和国、2003年）およびヘルシンキ宣言に従って行われました。脂肪サンプルは、蘇州大学の最初の提携病院からインフォームドコンセントと倫理的承認を得て入手しました。解剖学的顕微鏡下で血管と結合組織を取り除いた後、脂肪組織を洗浄し、細かく切った。ブロックをI型コラゲナーゼ（0.3 pzu / mL）で37°Cで30分間消化した後、500 g で遠心分離しました。 10分間。細胞ペレットをDMEM + 10％FBSに懸濁し、8×10 ⁴ の密度で播種しました。 / cm ² 。 48時間後、浮遊細胞を含む古い培地を廃棄し、新しい培地と交換しました。

HADSCは、間葉系幹細胞（CD90およびCD105）および造血幹細胞（CD34およびCD45）を特異的に標識する表面マーカーのフローサイトメトリーによって特徴づけられました。合計1×105個の細胞を回収し、PE、FITC、APC / cy7、またはCD34、CD45、CD90、CD105マウス抗ヒトモノクローナル抗体に対するPerCP結合抗体および適切なアイソタイプコントロールとともにインキュベートしました。染色された細胞はフローサイトメーター（LSRFortessa、BD、USA）を使用して分析され、データはFlowJoソフトウェアを使用して分析されました。 CD90 +、CD105 +、CD34-およびCD45-の4つの表現型がHADSCの表面マーカーとして選択されました。細胞表面マーカーの発現レベルは、フローサイトメトリー（BD LSRFortessa）によって特定されました。

HADSCの脂肪生成および骨形成分化は、それぞれオイルレッドOおよびアリザリンレッド染色によって評価されました。 HADSCは、MesenCultTM脂肪生成分化培地（Stem cell Tech。、05412）またはOriCellTM脂肪生成分化キット（Cyagen、HUXMA-90021）のいずれかで培養されました。 HADSCの脂肪生成分化については、14日目に、脂質で満たされた成熟脂肪細胞の定性的なオイルレッドO染色によって細胞を評価しました（VivaCell Biosciences、C37A00150）。 HADSCの骨形成分化については、21日目に、成熟骨細胞のカルシウム結節についてアリザリンレッド染色によって細胞を評価しました（VivaCell Biosciences、C37C00150）。倒立Nexcope顕微鏡を使用して画像を取得しました。

USPIO-PAA / PEGのinvitro細胞取り込みと生体適合性評価

HADSCは、1×10 ⁶ の密度で6ウェルプレートにプレーティングされました。 ウェルあたり。細胞をUSPIO-PAA / PEG（Fe10μg/ mLおよび0.1μg/ mL）を含む培地で2時間インキュベートし、細胞内Fe同定のためにプルシアンブルー（PB）染色で染色しました。

USPIO-PAA / PEGの生体適合性は、MTT比色分析および5-エチニル-2'-デオキシウリジン（EdU）取り込みアッセイ（EdU増殖キット、Thermo）によって決定されました。 MTTの場合、HADSCを96ウェルプレートに5×10 ³ の密度でプレーティングしました。 ウェルごとに、さまざまな濃度（0、10、20、40、80、160Feμg / mL）のUSPIO-PAA / PEGと24時間、48時間、または72時間インキュベートしました。 20μlのMTT溶液（5 mg / mL）を各ウェルに4時間加え、続いて150μLのジメチルスルホキシドを加えて結晶を溶解しました。各穴の吸光度値は、酵素標識装置（BioTek Synergy HT）を使用してOD 570nmで測定されました。 EdUアッセイでは、HADSCをSPIO-PAA / PEGと160Feμg/ mLで72時間インキュベートした後、10μMEdUと24時間インキュベートしました。細胞を回収し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、2 mg / mLグリシンで中和しました。透過処理細胞を色素溶液（アジド647複合体）とインキュベートした後、EdU取り込み率をフローサイトメトリーで評価しました。

6-OHDA誘導PDモデル

15〜20匹のオスのウィスターラット（SPFグレード、体重220±20 g）を使用して、PD動物のUSPIO-PAA / PEG標識HADSCをinvivoで追跡しました。すべての手順は、中国の規則（実験動物に関する事務の管理に関する規則、2017年）に従って実行され、中国科学院の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。全体を通して、動物は制御された照明（12/12時間の明暗サイクル、午前7時に「オン」）の下で飼育され、餌と水を自由に摂取できました。 PDモデルは、ラットの片側線条体に6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA、Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国）を2点注射することによって作成されました。以前に説明したように[25、26]、ラットに2つの座標（AP：1.2 mm、ML：2.2 mm、DV：-4.0〜6.0 mm）で3μLの6-OHDA溶液（5μg/μL）を定位注射しました。 AP：− 1.0 mm、ML：4.4 mm、DV：− 4.5〜6.5 mm）。 PDモデルの妥当性をテストするために、アポモルヒネ誘発回転（0.5 mg / kg、皮下）テストが使用されました。ラットにアポモルヒネ（0.5 mg / kg）を6-OHDA治療の1、2、3週間後に皮下注射し、オープンフィールドでローテーションスコアを30分間評価しました。 PDモデルは、アポモルヒネによって1分あたり7回転を超え、成功したと見なされました。

細胞移植とinvivoMRIイメージング

HADCは、80％のコンフルエンスに達したときに、USPIO-PAA / PEG（鉄濃度は10μg/ mL）と2時間インキュベートしました。 PDモデルの準備から3週間後、3×10 ⁶ USPIO-PAA / PEG標識HADCまたは生理食塩水をPDラットモデルの左線条体に次の座標（AP：1.2 mm、ML：2.2 mm、DV：-4.0〜6.0 mm）で注入しました。移植を受けた動物には、手術直後とその後2日間、ブプレノルフィン（0.5 mg / kg）を投与しました。これらの動物は、移植手術後1、2、または3週間でアポモルヒネ誘発回転試験を受けました。

インビボMRIの場合、動物は、生理食塩水またはHADSCの注射後3、9、15、および21日目に、インビボイメージングシステム（IVIS）小動物イメージングシステム（PerkinElmer、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）を使用してイメージングされました。

組織学的分析

残りのラットモデルの脳を採取し、幹細胞移植の3週間後に分析するために、厚さ30 mmに切断しました（ n =グループあたり5）。切片を抗チロシンヒドロキシラーゼ（TH、abcam、England）とインキュベートし、Alexa-594結合ロバ抗ウサギ抗体（Abcam）で視覚化しました。 DAPIは核による対比染色に使用されました。ライカTCSSP5共焦点顕微鏡を使用して画像をキャプチャしました。

統計分析

数値データは平均±SDとして表されました。データは、GraphPad Prism 7.0（GraphPad Software Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、両側スチューデントのt検定または一元配置分散分析にかけられ、差異が評価されました。 *は p を示します <0.05およびNSは有意差がないことを示します。

結果

ナノ粒子の合成と特性評価

実験計画を図1に示します。疎水性USPIONPは、熱分解法を使用して調製しました。図2a–cに示すように、元のUSPIONPの直径は4.07±0.57nmでした。 PAAでコーティングすることにより、USPIO-PAANPの直径は6.34±0.54nmに増加しました。 NPをPEGでさらに修飾すると、USPIO-PAA / PEGNPの直径は10.07±0.55nmに達します。 3つのナノ粒子はすべて球形で、均一に分散しています。統計分析は、有意差があったことを示しました（ F =10、** p <0.01、## p <0.01）USPIO、USPIO-PAA、USPIO-PAA / PEG NPの直径の中で、PAAとPEGによる修飾が成功したことを示しています（図2d）。

実験計画の概略図

ナノ粒子の特性評価。 a–c USPIO NPの代表的なTEM画像（ a ）、USPIO-PAA NP（ b ）およびUSPIO-PAA / PEG NP（ c ）。 d 統計分析では、USPIO、USPIO-PAA、USPIO-PAA / PEGの粒子サイズに有意差があることが示されました（ n =グループあたり20）。 e USPIO、USPIO-PAA、およびUSPIO-PAA / PEGNPのナノ粒子のフーリエ変換赤外。矢印は、1728 cm ^-1 での比吸収ピークを示しています。 PAAの変更により、1595 cm ^-1 および3440cm ^-1 PEGの変更による。数値データは平均±SD、** p として表されます <0.01対USPIONP、## p <0.01対USPIO-PAA / PEGNP。バーは20nmを表します

赤外線吸収法を使用することにより、USPIO-PAAには1728 cm ^-1 に明らかなカルボニル吸収ピークがあることがわかりました。 PAA分子のカルボニル伸縮振動ピークによるもの。 USPIO-PAA / PEGには、1595 cm ^-1 に炭素-窒素結合の面内曲げ振動ピークがあります。 3440 cm ^-1 のヒドロキシル基の伸縮振動ピーク （図2e）。これらのデータはすべて、PAAまたはPEG分子がNPの表面に正常に修飾されていることをさらに確認しました。

USPIO-PAA / PEGはinvitroで良好な磁気応答とHADSCとの生体適合性を示しました

USPIO-PAAおよびUSPIO-PAA / PEGのinvitroイメージング能力は、さまざまな濃度（Fe濃度に相当）でのMRI画像のグレースケール値によって評価されました。フィッティング後、さまざまな濃度での分散液の横緩和時間の値が得られました。 1 / T2の横緩和率を垂直座標、Fe濃度を水平座標として設定することにより、USPIO-PAAの横緩和率は107.94 s ^-1 と計算されました。 mm ^-1 （図3a）、および84.65 s ^-1 mm ^-1 USPIO-PAA / PEGの場合（図3b）。両方の粒子は、良好なMRIイメージング特性を示しました。 SPIO-PAAとSPIO-PAA / PEGの磁気ヒステリシスループは、SPIO-PAAの飽和磁化値が10,000Oeを超えると57emu / gであり（図3c）、SPIO-PAA / PEGの飽和磁化値が40であることを示しました。 10,000Oeを超えるemu / g（図3d）。強制力と残留磁気はゼロに近く（図3c、d）、SPIO-PAAとSPIO-PAA / PEGの両方が超常磁性であることをさらに示しています。

合成されたUSPIO-PAAおよびUSPIO-PAA / PEGNPのinvitro磁気応答。 a 、 b USPIO-PAA NPのMRIおよび横緩和率（ a ）およびUSPIO-PAA / PEG NP（ b ）。 r ₂ 緩和率を表します。 USPIO-PAAおよびUSPIO-PAA / PEGNPの緩和率は107.94s ^-1 でした。 mM ^-1 および84.65s ^-1 mM ^-1 。 c 、 d USPIO-PAA NPの磁気ヒステリシスループ（ c ）およびUSPIO-PAA / PEG NP（ d ）。磁気ヒステリシスは、最大磁場強度50,000 Oe（5 Telsa）で295 k（21.85°C）で測定されました。飽和磁化値は、SPIO-PAAで57 emu / g、SPIO-PAA / PEGで40emu / gに近かった。両方の曲線の磁化ヒステリシスはゼロに近かった

USPIO-PAA / PEG NPをHADSCと異なる時間インキュベートすることにより、USPIO-PAA / PEG NPが細胞の生存に有意な影響を及ぼさないことがわかりました（ p > 0.05）。同等のFe濃度が0〜160μg / mLの範囲である場合、HADSCの細胞生存率は96％を超えたままです。さらに、インキュベーション時間の増加（24時間から72時間）は、各Fe濃度で有意な細胞損失を引き起こしません（図4a）。 USPIO-PAA / PEG NPをさまざまな濃度のiPSCとインキュベートした場合にも、同様の観察結果が得られました（図4b）。 HADSCを160μgFe/ mL USPIO-PAA / PEGで72時間処理しましたが、EdU取り込み率で示される増殖能力は、USPIO-PAA / PEGの存在によって損なわれていません（図4c）。これらのデータはすべて、合成されたUSPIO-PAA / PEGNPのバイオセーフティを示しています。

合成されたUSPIO-PAA / PEG NPは、優れた生体適合性と標識能力を示します。 a 、 b HADSCまたはiPSCを、さまざまな濃度（0、10、20、40、80、および160μgFe/ mLでのFe濃度に相当）のUSPIO-PAA / PEG NPと、24、48、および72時間、および細胞生存率とともにインキュベートしました。 MTT法で測定され、 a に表示されます。 、 b 、 それぞれ。異なるNP濃度（ n ）での生存率に有意差はありません。 =5）またはインキュベーション時間（ n =5）。 c フローサイトメトリー分析では、USPIO-PAA / PEG（160μgFe/ mLで72時間）の存在下または非存在下でインキュベートしたHADSCでEdUの取り込み率が類似していることが示されました。 EdUで処理されなかったHADSCはネガティブコントロールとして使用されました。 d 10μgFe/ mLのUSPIO-PAA / PEGと2時間のインキュベーション時間により、プルシアンブルー染色で評価した場合、HADSCのほぼ100％の標識効率が得られました。 0.1μgFe/ mL（2時間のインキュベーション時間）のUSPIO-PAA / PEGは、HADSCで軽いが均一なPB染色を生成したことに注意してください。数値データは平均±SDとして表されます。バーは20μmを表します

細胞をUSPIO-PAA / PEG NPで効果的に標識できるかどうかを確認するために、HADSCをUSPIO-PAA / PEGNPと同等のFe10μg/ mLまたは0.1μg/ mLで2時間インキュベートしました。図4dに示すように、USPIO-PAA / PEG（Fe10μg/ mL）の存在下では、ほぼ100％のHADSCで青色に染色された多数のNPが観察されました。 USPIO-PAA / PEGの投与量は0.1μgFe/ mlに減少しましたが、ほとんどすべてのHADSCでかなり均一で分散したPB染色が観察されました。他の報告されたSPIOのいくつかと比較して[14、27、28]、USPIO-PAA / PEGは高い細胞取り込み効率を示しました。

PDラットモデルにおけるUSPIO-PAA / PEGNPでラベル付けされたHADSCの長期追跡

USPIO-PAA / PEG NPで標識されたHADSCは、定位注射によってPDラットモデルの左線条体に移植されました。図5に示すように、HADSC移植の3日後に左線条体で明確なMRI信号が観察されました。これは、移植された細胞の適切なinvivoトレースを示しています。移植後のD3、D9、D15、およびD21の動的観察では、NP標識を使用した移植細胞は、最大3週間まで明確に追跡でき、MRI信号はプロセス中に明らかな減少を示さなかったことが示されました。これらの結果は、合成されたナノ粒子が移植された細胞の生体内追跡に優れた可能性を秘めていることを示しています。

3日、9日、15日、21日の脳の代表的なMRI画像と、それに続くUSPIO-PAA / PEG標識HADSCまたは生理食塩水による移植。対応するコントロール、すなわち生理食塩水を注射した正常ラットまたはPDラットモデルのMRI画像をそれぞれ1行目と2行目に示した。コントロールの負の信号と比較して、USPIO-PAA / PEGでラベル付けされたHADSCを移植されたラットの脳は、21日まで一定で明確なMRI信号を示したことに注意してください。バーは5mmを表します

USPIO-PAA / PEGNP-ラベル付きHADSCはPDモデルで治療効果を示しました

NPで標識されたHADSCが治療効果を示すかどうかを評価するために、最初に、単離されたHADSCの表現型の特性評価を行いました。図6aに示すように、培養されたHADSCは紡錘形の細胞でした。フローサイトメトリー分析では、HADSCがCD90（> 99％）やCD105（> 99％）などの間葉系細胞のマーカーとして高度に発現しているのに対し、CD34やCD45などの造血マーカーを発現しているものはほとんどないことが示されました（図6b–g ）。 HADSCは、特定の条件下で脂肪生成または骨形成系統のいずれかに分化する可能性があり、分化能力は、それぞれオイルレッドOまたはアリザリンレッド染色によって示されました（図5h）。分化したHADSCには脂肪滴または石灰化した小結節がありますが、コントロールのHEK293細胞にはそのような構造はありません（図6h）。これらはすべて、HADSCが間葉系細胞の基準を満たしていることを示しています。

HADSCの特性評価。 a HADSCが典型的な紡錘状の表現型を持っていることを示す、位相差顕微鏡というフレーズの下の代表的な画像。 b–g HADSCは、CD45、CD105、CD34、およびCD90マーカーに対するさまざまな色素と結合する抗体とインキュベートされ、フローサイトメトリー分析にかけられました。散布図を b、c に示します。 、およびヒストグラムは d–g で表示されます 。ほとんどの細胞はCD90とCD105を発現していましたが、CD34とCD45は発現していなかったことに注意してください。 h HADSCとHEK293細胞の脂肪生成分化と骨形成分化は、それぞれオイルレッドOまたはアリザリンレッド染色によって評価されます。バーは20μmを表します

アポモルヒネ誘発回転は、6-OHDA注射後1、2、3週目で1分あたり17.1±1.79、28.7±1.77、31.86±1.72であり、ラットPDモデルの確立に成功したことを確認しました。図7に示すように、PDラットモデルのローテーション数は、1、2、3週目に32.59±1.12、31.85±1.98、31.54±1.73に減少し、続いて病変側の線条体にNP標識HADSCが移植されました。統計分析により、移植手術後2週間目から、生理食塩水投与群とHADSC投与群の間に有意差が明らかになりました（ p <2週目で0.01、 p 3週目で<0.01; n =各グループで5）、NPでラベル付けされたHADSCがPDモデルの行動障害を改善することを示します。

PDラットモデルは、6-OHDAで障害のある同側線条体に生理食塩水またはUSPIO-PAA / PEG標識HADSCのいずれかを投与し、1分あたりの回転数を記録して比較しました。生理食塩水を投与された対応するPDラットと比較して、HADSCを投与されたPDラット後の2、3週間で回転数の有意な減少があります。 ns わずかな変化を示し、**は p を示します <0.01。 n =グループごとに5

PDは、黒質でチロシンヒドロキシラーゼ（TH）を発現するニューロンが失われることを特徴としています。 THに対する免疫染色を使用することにより、6-OHDAは黒質のTH発現ニューロンを減少させ、PDラットモデルの線条体にHADSCを移植すると、そのような減少を軽減できることがわかりました（図8）。 Combined with the observation that cell transplantation alleviates the behavioral impairments of PD rats, we concluded that USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs exert therapeutic effects in PD rat models.

Immunostaining against TH in the substantia nigra of the rats receiving saline (a 、 d 、 g ), PD rats receiving saline (b 、 e 、 h ) or PD rats receiving USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs (c 、 f 、 i ）。 The area in the dashed frame indicates the compact area of substantia nigra (SNc) and the ventral tegmental area (VTA). Images in the boxes of d 、 e 、 f are enlarged and shown in g 、 h 、 i 、 それぞれ。 There are less TH-expressing cells in the SNc and VTA regions in the rats receiving 6-OHDA injection, as compared to the controls receiving saline. Following by HADSC transplantation, more of TH-expressing cells in the SNc of PD rats could be observed. The bar represents 100 μm

Discussion

Cell therapy is a promising strategy for the treatment of neurodegenerative diseases and has been in the front edge of preclinical research over the last 20 years [29, 30]. Tracing the transplanted cells is an indispensable part for the clarification of underlying mechanisms as well as the evaluation of clinical effects; however, it is challenging and to some extent, hampered the application of cell therapy [31, 32]. Computed tomography (CT), near-infrared fluorescence imaging (NIFI) and MRI are the most commonly used methods for the in vivo tracking of transplanted cells [31, 32]. Compared to the rather high radiation of CT and low sensitivity of NIFI, MRI shows good imaging of deep tissue, high contrast and low ionizing radiation, making it a good candidate for the in vivo tracing [33,34,35,36]. The development of proper tracers for MRI therefore becomes an indispensable part of promoting the application of cell therapy.

SPIO is a simple and reliable labeling strategy for MRI visualization. To achieve long-term in vivo tracing of the transplanted cells, the SPIO particles is required to have a uniform and ultrasmall size, since large particles may lead to uneven distribution of the tracers and interfere with the normal blood circulation [33]. Moreover, the internalization efficiency and biocompatibility of nanoparticles are another important index to evaluate the tracers. Nanoparticles usually enter cells through liquid phase endocytosis [37], receptor-mediated endocytosis [38] and phagocytosis [39]. To achieve a better cellular uptake, the SPIO particles are usually modified with intermediate ligands [18, 40, 41].

Besides cell tracking, SPIO has also been applied for drug delivery [42]. The tissue distribution and pharmacokinetic clearance are important index for both applications. Compared to the NPs-PAA, NPs-PAA/PEG showed longer retention time in blood and slower urinary clearance [43]. NPs densely coated with PEG provide much more uniform distribution over mucosal epithelial surfaces, including the gastrointestinal tract [44], respiratory system [45, 46] and brain tumor [42], etc. Moreover, PEG coating reduces the attachment of proteins and formation of corona, which in turn might promote uniform distribution of the NPs at the cost of reduced uptake [47]. As a potential good diagnostic and therapeutic tool, the labeling capacity of SPIO-PAA/PEG to MSCs and its further application in brain disorders such as PD have not been well studied, and the present study was designed to answer this question. In the present study, we synthesized a novel ultrasmall USPIO-PAA/PEG nanoparticles, modifying the SPIO cores with PAA and PEG ligands, respectively. The USPIO-PAA/PEG NPs have uniform ultrasmall diameter (10.07 ± 0.55 nm), good dispersion in aqueous solution, biocompatibility with various cell types as well as good magnetic response effect in vitro and in vivo. Importantly, the signals of labeled HADSCs could be clearly detected under MRI after brain transplantation for up to three weeks, indicating the good potential for clinical application.

PD is characterized by a progressively loss of dopaminergic neurons in the substania nigra, and by the deficiency of dopaminergic levels in the dopaminergic networks [1]; the most affected one is the nigrostriatal pathway including the striatum. In the present study, we transplanted USPIO-PAA/PEG-labeled HADSCs into the striatum of PD rat models, and found that such transplantation improved the behavioral impairments; moreover, it attenuated the loss of dopaminergic neurons in the substania nigra to some extent. Similarly, Ardeshir et al. reported that transplanting the MSCs derived from rat adipose tissues attenuated apomorphine-induced rotations in PD models [48]. Different from transplanting fetal midbrain tissues [49] or dopaminergic neural progenitors [50], HADSCs exert its therapeutic effects mainly through the paracrine effects [51, 52], rather than substituting for the impaired tissues. Studies have shown that MSCs act as promoters of immunomodulation, neuroprotection and neuronal differentiation, and these effects are essentially mediated by the secretome released by MSCs [6, 7, 51]. Our result is consistent with these observations; moreover, it indicates that the novel USPIO-PAA/PEG tracers did not interfere with the neuroprotection effects of HADSCs.

結論

We have developed a novel USPIO-PAA/PEG tracers showing high cell uptake efficiency, excellent biocompatibility and long-term MRI tracing capacities. The HADSCs labeled with USPIO-PAA/PEG could be traced with MRI for 3 weeks after cell transplantation. Moreover, the labeled HADSCs significantly attenuated the behavioral impairments of PD models, and increase the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra. The development of USPIO-PAA/PEG tracer may provide a promising tool in stem cell research and application.

データと資料の可用性

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略語

SPIO:

Small superparamagnetic iron oxide

USPIO:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide

PAA：

Polyacrylic acid

PEG：

Methoxypolyethylene glycol amine

HADSCs:

Human adipose-derived stem cells

USPIO-PAA/PEG:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles coating with the polyacrylic acid and methoxypolyethylene glycol amine

6-OHDA:

6-Hydroxydopamine

CT:

コンピュータ断層撮影

NIFI:

Near infrared fluorescence imaging

MRI：

磁気共鳴画像法

TH:

Tyrosine hydroxylase

TEM：

透過型電子顕微鏡