銅ナノ粒子のグリーン合成：触媒、抗菌、細胞毒性、抗酸化ポテンシャルのレビュー

概要

銅ナノ粒子（CuNPs）は、高い表面積/体積比、高い降伏強度、延性、硬度、柔軟性、剛性といった優れた特性により大きな関心を集めています。CuNPsは触媒、抗菌、抗酸化、抗真菌活性に加え、多様な応用における細胞毒性と抗癌特性を示します。レーザーアブレーション、マイクロ波支援、ゾルゲル、共沈殿、パルスワイヤ放電、真空蒸着、高エネルギー照射、リソグラフィ、機械粉砕、光化学還元、電気化学、電気噴霧合成、水熱反応、マイクロエマルション、化学還元など、多くの物理・化学的手法がナノ粒子合成に用いられてきました。植物合成（ファイトシンシス）は、低細胞毒性、経済性、環境調和性、生体適合性向上、高抗酸化・抗菌活性から、物理・化学的手法の有望な代替として提唱されています。本レビューでは、CuNPs調製に用いられる評価技術、その主役割、限界、感度を解説します。CuNPs合成に用いられる技術概観、合成手順、合成CuNPs特性に影響する反応パラメータ、様々な植物中のファイトケミカルを同定するスクリーニング解析を、近年の文献からレビュー・要約して提示します。ケルセチンによる銅イオン還元、サンチンによる銅ナノ粒子安定化、抗菌活性、4-ニトロフェノール還元の仮想的メカニズムを図解とともに説明。本レビューの主目的は、CuNPs合成に用いられた植物データをまとめ、過去に未使用の植物を探索する研究者への新たな道筋を開くことです。

銅ナノ粒子の抗菌活性の提案メカニズム。

背景

ナノ粒子（NPs）は、宇宙技術、磁性、光エレクトロニクス、エレクトロニクス、化粧品、触媒、医薬、生物医学、環境、エネルギーなど産業分野で多くの興味深い応用を持っています[1, 2]。NPsの延性、高降伏強度、硬度、柔軟性、剛性、高表面積/体積比、マクロ量子トンネル効果、量子サイズ効果といった非凡な特性は、同一化学組成のバルク材料と比較して顕著です[3]。実際、微粒子では観測されないNPsの特性—高比表面積、特異な光学特性、低融点、特異な磁化、機械的強度、多数の産業応用—が知られています[4]。銅ナノ粒子（CuNPs）は、容易な入手性、低コスト、貴金属に類似した特性から大きな関心を集めています[5-9]。CuNPsはセンサ、熱伝達システム[10-12]、エレクトロニクス（燃料電池、太陽電池）、多くの反応における触媒、病院機器コーティング用の殺菌・抗菌剤[13-19]としても利用可能です。

レーザーアブレーション[20]、マイクロ波支援、ゾルゲル[21]、共沈殿[22]、パルスワイヤ放電[23]、真空蒸着[24]、高エネルギー照射[25]、リソグラフィ[26]、機械粉砕[27]、光化学還元、電気化学[28-32]、電気噴霧合成[33]、水熱反応[34]、マイクロエマルション[35]、化学還元など、多くの物理・化学的手法がナノ粒子合成に用いられます。これらの手法は明確で純粋なナノ粒子を生成しますが、有毒化学物質の使用によりコスト効率も環境調和性も高くありません。ナノテクノロジーの最重要基準の一つは、環境調和的、無毒、クリーンなグリーンケミストリー手順の開発です[36]。したがって、植物[37, 38]、放線菌[39, 40]、菌類[41-44]、細菌[45-49]、酵母[50-52]、ウイルス[53, 54]など様々な生物主体を用いるナノ粒子の生物合成は、グリーンケミストリー基盤の手法を含みます。生物主体は、幅広いサイズ、物理化学的特性、形状、組成を持つNPsを、無毒、クリーン、環境調和的に合成するアプローチを提供します[55]。

銅ナノ粒子は、Euphorbia esula[56]、Punica granatum[57]、Ocimum sanctum[58]、Ginkgo biloba[59]、Calotropis procera[60]、Lawsonia inermis[61]、Citrus medicalinn[62]、Camellia sinensis[63]、Datura innoxia[64]、Syzygium aromaticum[65]、Sesamum indicum[66]、Citrus limon、Turmeric curcumin[67]、Gloriosa superba L.[68]、Ficus carica[69]、Aegle marmelos[70]、Caesalpinia pulcherrima[71]、Cassia fistula[72]、Leucas aspera、Leucas chinensis[73]、Delonix elata[74]、Aloe barbadensis Miller[75]、Thymus vulgaris[76]、Phyllanthus emblica[77]、Magnolia kobus[78]、Eucalyptus[79]、Artabotrys odoratissimus[80]、Capparis zeylanica[81]、Vitis vinifera[82]、Hibiscus rosa-sinensis[83]、Zingiber officinale[84]、Datura metel[85]、Zea mays[86]、Urtica、Matricaria chamomilla、Glycyrrhiza glabra、Schisandra chinensis、Inula helenium、Cinnamomum[87]、Dodonaea viscosa[88]、Cassia auriculata[89]、Azadirachta indica、Lantana camera、Tridax procumbens[90]、Allium sativum[91]、Asparagus adscendens、Bacopa monnieri、Ocimum bacilicum、Withania somnifera[92]、Smithia sensitiva、Colocasia esculenta[93]、Nerium oleander[94]、Psidium guajava[95]；藻類/菌類としてPhaeophyceae[96]、Stereum hirsutum[97]、Hypocrea lixii[98]；微生物としてPseudomonas fluorescens[99]、Enterococcus faecalis[100]培養によって合成・安定化されています。

銅ナノ粒子の生物合成

抽出に用いられる植物部位

葉、種子、樹皮、果実、果皮、繊維、根、樹脂など、植物の様々な部位が植物抽出液調製に用いられます。葉と根は2通りで使用：新鮮な葉/根を抽出液調製に用いるか、乾燥粉末葉/根を用います。

CuNPs合成手順

CuNPs合成のため、対象植物の部位を用いて植物抽出液を調製。葉を採取し、水道水で洗浄後、蒸留水で粉塵除去。洗浄葉を2通りで使用：第一に、1–2時間天日乾燥して残留水分除去。既知重量の乾燥葉を小分けし、脱イオン水またはエタノール溶液に浸漬。磁気撹拌機で室温24時間撹拌後、ろ過して抽出液を得る。第二に、4–7日天日乾燥または50 °Cオーブンで1日乾燥、家庭用ブレンダーで粉末化。既知重量の植物粉末を水またはエタノール溶液に混合、撹拌ろ過。

CuNPs合成では、硫酸銅、塩化銅、酢酸銅、硝酸銅などの前駆体塩水溶液（様々な濃度）を植物抽出液と混合。水酸化ナトリウム水溶液も調製し、反応混合物のpH制御のために添加。反応混合物を電動シェーカーで様々な時間間隔で強く振盪、オーブンで様々な時間・温度で加熱。反応混合物の色変化でCuNPs生成を確認。最後にナノ粒子を遠心分離、様々な温度で乾燥。反応最適化は混合物pH、前駆体塩濃度、加熱時間、反応温度の変更で実施。文献では、異なる植物、異なる前駆体塩、異なる反応条件でCuNPsが作製されており（表1参照）、反応条件がCuNPsの形状とサイズに影響することがわかります。

反応パラメータがNPs特性に与える影響

植物抽出液濃度はCuNPs還元と安定化の主役割を果たします。植物抽出液濃度増加で粒子数増加との報告[88]。植物抽出液濃度増加でファイトケミカル濃度増加、銅塩還元も促進。金属塩の迅速還元によりナノ粒子サイズも減少[101]。

CuNPsのサイズと構造は銅塩の種類に大きく影響されます。ナトリウム水酸化物存在下で塩（塩化銅、酢酸銅、硝酸銅、硫酸銅）を用いるとナノ粒子形態が変化。塩化銅で三角形/四面体、酢酸銅でロッド状、硫酸銅で球状との報告[102]。前駆体塩濃度増加でCuNPsサイズも増大。

CuNPs合成は、反応媒質pHを好ましい範囲で変化させることで最良結果を得られます。反応混合物pH値変更でナノ粒子サイズ制御可能。高pHでは低pH比でより小さなナノ粒子が得られます。この差は植物抽出液による金属塩還元速度の差に起因。pH値とナノ粒子サイズの逆相関：pH上昇で小径球状、pH低下で大径（ロッド状、三角形）ナノ粒子。異なるpH値（4、6、8、10、12）の吸収スペクトルへの影響は図1[36]に示す。植物抽出液添加のみではCuCl₂からCuNPs生成せず、反応混合物pHを塩基性に変えることでCuNPsが得られたとの報告。WuとChenも同様の挙動を観察し、pHがCuNPs合成に重要な役割を果たすと結論[103]。

植物抽出液調製に用いられる植物部位

銅ナノ粒子ファイトシンシスのメカニズム

ファイトケミカルスクリーニング：定性分析

ファイトケミカルスクリーニング分析は、様々な植物中のファイトケミカル検出のための化学分析です。新鮮な植物抽出液に化学薬品/試薬を用いて実施[77]（表2参照）。

金属還元とNPs安定化のためのファイトケミカル

ファイトケミカルを用いたCuNPsグリーン合成は、反応温度、植物抽出液濃度、金属塩濃度、反応時間、反応混合物pH変更により、NPs形状とサイズのより柔軟な制御を可能にします。反応媒質の色変化は金属イオン還元とNPs生成を指示。銅塩のグリーン還元は即座に開始され、反応混合物の色変化で銅ナノ粒子生成が示されます。ファイトケミカルは、第一に金属イオンを還元し、第二に金属核をナノ粒子として安定化する主役割を果たします（図2参照）。ファイトケミカルと金属イオンの相互作用とこれらの濃度がCuNPsの形状とサイズを制御します。

金属イオン還元と金属核安定化のプロトコル

フラボノイドはポリフェノール化合物（ケルセチン、カテキン、フラバノン、イソフラボン、サンチン、ペンデュレチン、アリザリン、ピノセムブリン、アントシアニン、フラボン、タンニン、サポニン等）を含み、Ginkgo biloba[59]、Citrus medicalinn[62]、Phyllanthus emblica[77]、Hibiscus rosa-sinensis[83]、Dodonaea viscosa[93]等様々な植物に存在。これら化合物は金属還元とキレート化の主役割を果たします。フラボノイドに存在する様々な官能基が銅イオン還元を担います。フラボノイドの反応性水素原子がエノール型からケト型へのタウトマー変化時に放出され、銅イオンを還元して銅核またはCuNPsを形成すると推定されます。例えば、Ginkgo biloba抽出液では、ケルセチン（フラボノイド）のエノール型からケト型への変化が銅金属イオンを銅核またはCuNPsへ還元する主役割を果たすと推定されます（図3）。

ケルセチンによる銅イオン還元

CuNPs合成プロセス中、一価または二価酸化状態の金属イオンが零酸化銅核に変換され、これら核が合併して様々な形状を形成。核生成段階では、核が集合してワイヤー、球体、立方体、ロッド、三角形、五角形、六角形などを形成。一部フラボノイドはπ電子とカルボニル基でCuNPsをキレート化する能力を持ちます。ケルセチンとサンチンは、水酸基とカルボニル基という2つの官能基を持つため強いキレート活性を示します。これら基は前述のメカニズムに従い銅ナノ粒子とキレート化し、サンチン（フラボノイド）のCuNPs表面への吸着能力も説明します（図4）。

サンチンによる銅ナノ粒子安定化

異なる植物（Hibiscus rosa-sinensis[83]、Camellia sinensis[104]）に含まれるタンパク質分子（スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオン）が金属イオンからナノ粒子形成への高い還元活性を示すが、キレート活性は過度ではないと推定。糖類（単糖類グルコース、二糖類マルトース/ラクトース、多糖類）がCamellia sinensis[63]に存在し、還元剤または抗酸化剤として作用し、ケトンからアルデヒドへのタウトマー変化系列を経ます。

その他のファイトケミカルとして、ポリフェノール（エラグ酸、没食子酸）がHibiscus rosa-sinensis[40]、フェニルプロパノイド（フェニルアラニン、チロシン）がAegle marmelos[70]、テルペノイドがOcimum sanctumとAsparagus adscendens[58, 92]、システインプロテアーゼがCalotropis procera[60]、クルクミンアニリンアゾメチンがTurmeric curcumin[67]、アスコルビン酸がCitrus medicalinn[62]、オイゲノールがSyzygium aromaticum[65]、アルカロイドがAegle marmelos[70]等、銅イオン還元と銅ナノ粒子安定化に同役割を果たします。炭水化物、アントラキノン、キノン、アントシアノシドがPhyllanthus emblica[77]；リグニンとキサントンがHibiscus rosa-sinensis[83]；強心配糖体、トリテルペノイド、カロテノイド配糖体、アントラキノン配糖体がColocasia esculenta[93]に存在し、様々な植物抽出液に含まれる還元・安定化剤として作用するファイトケミカルです。特定ファイトケミカルの構造例を図5に示します。

ファイトケミカルとその構造

評価技術

合成ナノ粒子の評価には、紫外-可視分光（UV-vis）、透過型電子顕微鏡（TEM）、小角X線散乱（SAXS）、フーリエ変換赤外分光（FTIR）、X線蛍光分光（XRF）、X線回折（XRD）、X線光電子分光（XPS）、走査型電子顕微鏡（SEM）、電界放出型SEM（FESEM）、粒子径分析（PSA）、Malvern Zetasizer（MZS）、エネルギー分散型X線分光（EDX/EDS）、ナノ粒子追跡分析（NTA）、X線反射率測定（XRR）、Brunauer-Emmett-Teller解析（BET）、選択領域電子回折（SAED）、原子間力顕微鏡（AFM）などが用いられています（表3）。

銅ナノ粒子の応用

優れた化学的・物理的特性、大きな表面積/体積比、常に再生される表面、低コスト、無毒調製により、CuNPsは様々な分野で応用が注目されています。CuNPsは触媒活性、抗菌活性、細胞毒性/抗癌活性、抗酸化活性、抗真菌活性を様々な応用で示します。触媒活性では、Huisgen [3+2] シクロアディション（アルキンとアジド、多溶媒、リガンドフリー条件）[59]、1-メチル-3-フェノキシベンゼン、3,3-オキシビス(メチルベンゼン)[94]、1-置換-1H-1,2,3,4-テトラゾール合成[76]、二酸化窒素吸着、二酸化硫黄吸着[66]に使用。多くの遷移金属触媒Ullmannカップリング反応ではリガンド（ホスフィン等）が文献報告されるが、多くは高価、調製困難、湿気感受性。本研究では合成CuNPsをジフェニルエーテルのリガンドフリーUllmannカップリングに使用。工業廃棄物中の様々な染料、有害有機化合物、農薬は環境と生物に有害。CuNPsはメチレンブルー分解[73]、アトラジン分解[86]、4-ニトロフェノール還元[76]に使用。

抗菌剤として、銅化合物は農業で除草剤[105]、アルジサイド[106]、殺菌剤[107]、農薬、畜産で消毒剤[108]として広く使用（表4参照）。生物起源CuNPsは、Pseudomonas aeruginosa（MTCC 424）、Micrococcus luteus（MTCC 1809）、Enterobacter aerogenes（MTCC 2832）[57]、Salmonella enterica（MTCC 1253）、Rhizoctonia solani、Xanthomonas axonopodis pv. citri、Xanthomonas axonopodis pv. punicea[58]、Escherichia coli（ATCC 14948）[62]、Staphylococcus aureus（ATCC 25923）、Bacillus subtilis（ATCC 6633）、Pediococcus acidilactici[69]、Klebsiella pneumoniae（MTCC 4030）などグラム陽性/陰性病原菌に強力な抗菌活性。抗真菌活性では、Alterneria carthami、Colletotrichum gloeosporioides、Colletotrichum lindemuthianum、Drechslera sorghicola、Fusarium oxysporum f.sp. carthami、Rhizopus stolonifer、Fusarium oxysporum f.sp. ciceris、Macrophomina phaseolina、Fusarium oxysporum f.sp. udum、Rhizoctonia bataticola[58]、Candida albicans、Curvularia、Aspergillus niger、Trichophyton simii[67]に使用。細胞毒性では、HeLa、A549、MCF7、MOLT4、BHK21細胞株（癌腫瘍）での研究に使用[60, 104]。

抗菌活性の仮想的メカニズム

CuNPsが優れた抗菌活性を示すことは観察されていますが、文献には銅ナノ粒子抗菌メカニズムの限定的報告のみで、これらは仮想的です。CuNPsと–SH（スルフヒドリル）基の相互作用で細菌と酵素/タンパク質が破壊されることが観察[109, 110]。CuNPsとの相互作用でDNA分子のらせん構造が撹乱されるとの報告[111]。CuNPsと細菌細胞膜の相互作用で膜透過電位が低下し、膜完全性に影響[112]。金属NPsがそれぞれの金属イオンを放出すると推定。銅ナノ粒子と銅イオンが細菌細胞表面に蓄積し、膜にピットを形成、細胞成分の漏出と細胞内への流入、酸化ストレスを引き起こし細胞死に至る[112-114]。上記可能性を表す抗菌活性の仮想的メカニズムを図6に示します。

銅ナノ粒子の抗菌活性メカニズム

4-ニトロフェノール還元触媒活性

4-ニトロフェノール（4-NP）は農業排水と工業製品に通常見られ、有害で環境非調和的。ホウ化ナトリウム水溶液存在下で、4-NPの水素化/還元（4-アミノフェノール（4-AP）へ変換）がCuNPs存在下で進行。CuNPsはドナーであるホウ化物イオンからアクセプター4-NPへの電子移動を助け、反応の運動論的障壁を克服して触媒します。

合成CuNPsの触媒活性は、室温水系媒質で水溶液ホウ化ナトリウム存在下、4-ニトロフェノール還元で研究[56]。CuNPsによる4-NP還元は簡便で環境調和的プロセス。UV-vis分光光度計でCuNPsの4-NP還元触媒効率を検証。水系媒質中4-NP最大吸収ピークは317 nm、ホウ化ナトリウム添加で4-ニトロフェノレートイオン生成により403 nmへシフト。触媒不在では403 nmピークが2日後も変化せず、4-NP還元が進行しないことを示唆。CuNPs添加後、吸収ピークが300 nmへシフトし403 nmピークが完全消失、副生成物なしで4-NPから4-APへの還元を確認。4-NP還元の仮想的メカニズムを図7に示します。メカニズムでは、4-NPとホウ化ナトリウムが溶液中でイオン形態で存在。ホウ化物イオンのプロトンが銅ナノ粒子表面に吸着しBO₂生成。4-ニトロフェノレートイオンもCuNPs表面に吸着。両者の吸着によりCuNPsが反応物の運動論的障壁を克服し、4-ニトロフェノレートイオンを4-アミノフェノレートイオンに変換。変換後、4-アミノフェノレートイオンが脱着し4-アミノフェノールになります。

4-ニトロフェノール還元メカニズム

結論

本稿では、様々な植物を用いた銅ナノ粒子（CuNPs）生物学的合成法の最新情報をレビュー・要約しました。CuNPsのグリーン合成は、低細胞毒性、経済性、環境調和性、生体適合性向上、実現可能性、高抗酸化・抗菌活性を備え、物理・化学的手法の有望な代替として提唱されます。NPs生合成メカニズムは未解明であり、ナノ粒子形成メカニズムとファイトケミカルのNPs形成における役割理解により多くの研究が必要です。本レビューは、CuNPs合成に用いられた植物データ、合成手順、合成CuNPs特性に影響する反応パラメータを提供。ファイトケミカルスクリーニング分析は、炭水化物、タンニン、サポニン、フラボノイド、アルカロイド、アントラキノン、アントシアノシドなどの植物中ファイトケミカル検出に用いられる化学分析です。ケルセチンによる銅イオン還元メカニズムとサンチンによる銅ナノ粒子安定化メカニズムを記載。文献でCuNPsに用いられた評価技術：UV-vis、FTIR、XRD、SEM、FESEM、TEM、PSA、MZS、EDX、NTA、SAXS、XRR、XRF、XPS、BET、SAED、AFM。CuNPsは触媒活性、抗菌活性、細胞毒性/抗癌活性、抗酸化活性、抗真菌活性を様々な応用で示します。抗菌活性と4-ニトロフェノール還元の仮想的メカニズムを図解付きで提示。

今後、新たなグリーンプロトコルで異なる構造的特性と効果的な生物学的効果を持つCuNPsが作製されるでしょう。粒子サイズ制御と、それによるサイズ依存特性制御がCuNPs応用の新たな扉を開きます。本研究は、植物抽出液、微生物抽出液、天然バイオ分子を用いたCuNP合成の概観を提供。これら全グリーンプロトコルにはそれぞれ利点と限界がありますが、微生物抽出液より植物抽出液を還元剤とする方が、ナノ粒子生成速度が速いためより有益です。