標的型カーボンナノチューブ光熱療法とチェックポイント阻害の併用：転移性乳がんに対する新戦略

概要

がん死亡の最大要因は転移とその治療の帰結である。ここでは、標的型単層カーボンナノチューブ（SWCNT）を用いた光熱療法と、チェックポイント阻害剤による免疫刺激を組み合わせた転移性乳がんの新規治療法を提示する。アンネキシンA5（ANXA5）機能化SWCNTバイオコンジュゲートを用いた近赤外（NIR）選択的光熱アブレーションが、同系BALB/cJマウスの原発巣直交移植EMT6乳腺腫瘍に対して、抗細胞傷害性Tリンパ球関連蛋白質4（抗CTLA-4）依存性のアブスコパル応答を相乗的に増強し、腫瘍接種後100日での生存率を55%に向上させた。一方、光熱療法単独または免疫刺激単独では100日生存は0%だった。光熱療法前に、SWCNT-ANXA5バイオコンジュゲートを1.2 mg/kgの比較的低用量で全身投与し、ANXA5依存的結合により腫瘍血管に蓄積させた。光熱療法中、腫瘍内平均最高温度は54℃（持続175秒）に達した。脾臓抗腫瘍免疫エフェクター細胞のフローサイトメトリー定量と血清サイトカイン定量により、光熱アブレーションと免疫刺激併用による生存延長メカニズムを評価した。

導入

転移とその治療の帰結は、がん死亡の単一最大原因である[1]。例えば、乳がんが転移すると患者の5年生存率は25%未満に低下。過去60年間で200以上の新規抗腫瘍薬が患者転帰を改善したが、転移性疾患での全生存率は依然として低い[2]。ここでは、腫瘍標的型単層カーボンナノチューブ（SWCNT）バイオコンジュゲートによる光熱療法と、抗細胞傷害性Tリンパ球関連蛋白質4（抗CTLA-4）チェックポイント阻害の併用を、直交移植マウスモデルでの転移性乳がん治療として研究する。

SWCNTのナノ材料としての独自特性は、がん治療への潜在的ツールとして大きな関心を集めてきた。SWCNTは多様な生物学的効果を及ぼすが、がん治療での利用は主に近赤外（NIR）光との相互作用とそれによる光熱効果、すなわち光熱療法（PTT）での腫瘍急速加熱に焦点が当てられてきた。多数のグループが、乳がん複数モデルでのSWCNTを用いたPTTベース治療戦略の可能性を検討してきた[3-10]。これら研究は主に、NIR光減衰がほぼ完了する数mm以下の深度での原発腫瘍治療におけるPTT能力に焦点を当てていた。

以前、我々は同系マウスの原発巣直交移植乳腺腫瘍が、光熱増強SWCNTバイオコンジュゲートと穏和なNIRレーザー光によりほぼ完全に消失可能ことを示した[11]。このバイオコンジュゲートでは、SWCNTがアンネキシンA5（ANXA5）タンパク質で機能化されており、ANXA5は腫瘍細胞と腫瘍血管内皮細胞で外部露出するアニオン性リン脂質ホスファチジルセリンに高親和性で結合するが、正常血管細胞には結合しない[12-14]。このコンジュゲートは原子間力顕微鏡（AFM）で可視化され、コンジュゲート高さが2.5-5.0 nmで、他のSWCNT-タンパク質コンジュゲートと類似[11]。この転移モデルで原発腫瘍を根絶可能だが、PTT単独では生存延長は控えめに留まった。しかし、シクロホスファミドなどの免疫調節薬との併用治療が生存率向上可能である予備的証拠を見出した。

最近、シクロホスファミドなどの免疫調節薬がSWCNT指向PTTを相乗的に増強する可能性が大きな関心を集めている。有望な免疫調節薬の一種がチェックポイント阻害剤である。チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4、抗PD-1、抗PDL-1など、がんに対する体の応答を調節する重要な細胞蛋白質に結合する抗体である。これら抗体は、免疫システムが自然な抗腫瘍応答を抑制するメカニズムである生物学的「チェックポイント」をブロックする。これら蛋白質は通常、体の免疫応答制御に重要な役割を果たす。これらの作用をブロックすることで、チェックポイント阻害剤は免疫システムが自然な抗腫瘍応答を抑制するメカニズムを除去する。最近、複数グループが抗CTLA-4チェックポイント阻害とSWCNT増強PTTの併用が乳がんで強力な免疫応答を促進する可能性を観察[15,16]。

本研究では、新規PTTモダリティと免疫刺激剤抗CTLA-4の併用を評価する。抗CTLA-4は転移性黒色腫治療で承認済み[17]であり、現在他の免疫刺激剤と併用して乳がん臨床試験でテスト中[18]。PTTと抗CTLA-4チェックポイント阻害併用による抗腫瘍免疫増強メカニズム、および標的臓器におけるSWCNTの長期運命を評価する。

材料と方法

材料

ANXA5コードプラスミドpET-30 Ek/LIC/ANXは本研究室で以前構築[11]。ウシ血清アルブミン（BSA）、トリトンX-100、EDTA、β-メルカプトエタノール、フェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）、Tris-酢酸-EDTA緩衝液をSigma-Aldrich（セントルイス、MO）から購入。リン酸塩とドデシル硫酸ナトリウム（SDS）をMallinckrodt Chemicals（フィリップスバーグ、NJ）から購入。HPLCグレードエタノールをAcros Organics（ウォルサム、MA）から購入。His-trapカラムをGE Healthcare（シカゴ、IL）から購入。フローサイトメトリー染色緩衝液、固定/透過化緩衝液、透過化緩衝液、発色性エンドトキシン定量キット、Slide-A-Lyzerダイアリシスカセット（3.5 kDa）をThermo Fisher Scientific（ウォルサム、MA）から購入。2と100 kDaダイアリシス膜をSpectrum Laboratories（ランチョドミンゲス、CA）から購入。RPMI-1640培地とHanks平衡塩溶液をATCC（マナサス、VA）から購入。胎仔牛血清（FBS）をAtlanta Biologicals（ローレンスビル、GA）から購入。トリプトン、酵母エキス、硫酸カナマイシンをAlfa Aesar（ワードヒル、MA）から購入。水酸化ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムをVWR Inc（ラドナー、PA）から購入。HRV-C3プロテアーゼをSino Biologics（ポートランド、OR）から購入。抗CTLA-4マウス単クローン抗体（クローン：9H10）とマウスサイトカインELISAキット（TNF-α、IFN-γ、IL-6）をBioLegend（サンディエゴ、CA）から購入。CoMoCAT SWCNTs（平均直径0.8±nm、平均長さ1.5±0.5 μm）をCHASM（ボストン、MA）から購入。CoMoCAT法は少数の(n,m)キラリティを高選択性で得ることで知られる[19]。本研究使用サンプルは[5,6] SWCNTsに高濃度富化され、980 nm波長で強いNIR吸収を示す。この吸収は、占有van Hove特異点から対応する非占有特異点へのS₁₁遷移に対応。したがって、腫瘍堆積SWCNTによる放射吸収を最大化するため、本研究使用レーザー波長を980 nmとし、S₁₁光学遷移と完全一致させた[20]。Additional file 1 Figure S1に蛍光スペクトルを示し、可視光でS22遷移励起後のS₁₁ NIR放射を明確に示す。

細胞培養

ATCC（マナサス、VA）由来EMT6乳がん細胞を、2 mM L-グルタミン含有Waymouth's MB 752/1培地に15% FBS補充で培養。全細胞を37℃、100%湿度、5% CO₂下で培養。0.25%（w/v）トリプシン、0.53 mM EDTAで継代。細胞系統とマイコプラズマフリー状態をSTR試験（Charles River）とリムルスアッセイで確認、エンドトキシンフリーを確認。

ANXA5とSWCNT-ANXA5調製

SWCNT-ANXA5コンジュゲートを、2.5 mg ANXA5/mg SWCNTを得る以前開発手順[11]で調製。簡略化すると、ANXA5コードプラスミドpET-30 Ek/LIC/ANXを導入した大腸菌を培養し、固定化Ni²⁺による固定化金属親和性クロマトグラフィーでANXA5を単離、酵素切断で(His)₆タグ除去。フリーズドライCoMoCAT SWCNTsを1% SDS中で20 Wプローブ超音波処理2サイクルと29,600 g、30分遠心分離2サイクルで分散。懸濁SWCNTsをNIR蛍光で特性評価（Additional file 1: Figure S1）、次に1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-ポリエチレングリコール-マレイミド（DSPE-PEG-マレイミド）リンカーと室温30分反応し、SWCNTとDSPE官能基間の疎水相互作用を許容。その後、蒸留水で8時間透析し過剰リンカーとSDS除去。透析済みコンジュゲートを、システイン基を1つ持つANXA5と2時間反応し、1.5 mg/mL L-システインでブロッキング。最終生成物SWCNT-ANXA5を20 mMリン酸緩衝液で8時間透析し過剰ANXA5とL-システイン除去。タンパク質重量と純度をSDS-PAGEで評価。SWCNTとANXA5含有量をUV-Vis-NIR蛍光分光、フーリエ変換赤外分光（FT-IR）ラマン分析、Bradfordアッセイで評価（Additional file 1: Figure S2）。

インビボ実験

全手順はオクラホマ大学機関動物実験委員会（IACUC）承認プロトコルに準拠。6週齢雌BALB/cJマウスを使用（Jackson Laboratory、バーハーバー、ME）。標準餌を給餌。NIRレーザー光で腫瘍照射中、マウスを2%イソフルランと98%酸素でノーズコーン麻酔。

10⁶ EMT6マウス乳がん細胞を100 μL PBS中で第4乳腺脂肪パッドに直交移植し腫瘍誘導。腫瘍を12日間増殖させ、体積60 mm³（~5 mm径）到達時に、マウスに側尾静脈から1.2 mg/kg SWCNT-ANXA5（mg SWCNT/kg体重）バイオコンジュゲートを全身静注。3時間後、腫瘍境界から5 mm余分な領域を、エネルギー密度175 J/cm²、パワー密度1 W/cm²のNIR光（980 nm）で照射（時間175秒；Diodevet-50 NIRレーザー、B&W Tek Inc.、ニューアーク、DE）。チェックポイント阻害は、腫瘍接種後8、11、16日目に抗CTLA-4抗体200 μgを100 μL PBS中で連続腹腔内投与で実施。腫瘍体積は修正楕円体公式 V = 1/2 × 長さ × 幅² でノギス測定最長寸法と垂直幅から算出。腫瘍温度はFLIR TG165スポットサーマルカメラ（Raymarine ITC、ファーナム、UK）でオートスキャン最大検出温度モードで監視。標的臓器を毒性評価のため収穫し、10%中性緩衝ホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）スライスをヘマトキシリン・エオシン染色し毒性解析。

エクスビボSWCNT検出

マウスに側尾静脈から1.2 mg/kg SWCNT-ANXA5（mg SWCNT/kg体重）全身投与。選択的タイムポイントでマウス（n=3）を安楽死、剖検、標的臓器摘出し解析。組織試料を先行報告[21]に従い調製。エクスビボ組織試料中のSWCNT存在を、NS3 NanoSpectralyzer（Applied NanoFluorescence、ヒューストン、TX）による相対NIR蛍光分光で決定。

フローサイトメトリー

治療後14日目にマウスを安楽死し、脾臓抗腫瘍免疫エフェクター細胞を先行報告[21]に従い定量。

サイトカイン検出

上記治療後、マウス（n=4-5）をPTT後7日目に安楽死し採血。希釈血清中の腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、インターフェロンガンマ（IFN-γ）、インターロイキン6（IL-6）濃度をサプライヤープロトコルに従いELISAで定量。

統計解析

データをGraphpad Prismソフトウェアで解析。統計的有意性を一元配置分散分析とTukey-Kramer多重比較検定で評価。生存曲線の統計的有意性をMantel-Haenszel log-rank検定で決定。サイトカイン血清濃度の統計的有意性を一元配置分散分析とDunnett多重比較検定で分析。多重比較をBonferroni閾値で補正。誤差を平均標準誤差でグラフィカル表示、誤差がプロット平均点シンボルサイズを超えない場合は明確化のためバーを省略。

結果

熱力学

1.2 mg/kg SWCNT-ANXA5用量使用時、NIR光治療中の腫瘍最高温度を記録（図1）。照射前SWCNT-ANXA5投与マウスは、生理食塩水投与マウスよりNIR光治療全期間で腫瘍温度が高かった。SWCNT-ANXA5投与マウスの腫瘍平均温度は生理食塩水投与マウスと有意に異なる（54℃ vs 37℃、p<0.05）。この増強光熱療法の結果、SWCNT-ANXA5群でのみ可視的腫瘍アブレーションが発生。腫瘍アブレーションは急速な変色、続いて皮膚収縮と皺出現で特徴づけられる。48時間以内に光熱アブレーション部位に有意な落屑形成。完全な皮膚再生には数週間要した。

光熱療法とチェックポイント阻害

抗CTLA-4単クローン抗体によるチェックポイント阻害と光熱療法併用結果を図2に示す。PTT単独で原発乳がん腫瘍を容易に根絶可能だが、NIRレーザー光透過深度が数mmに限られるため乳がん転移治療は限定的。この局所NIR光熱抗腫瘍治療の短所を克服するため、全身性チェックポイント阻害との併用を検討（図2）。PTTは原発EMT6腫瘍破壊に優れる（図2a）が、転移根絶に失敗し、EMT6直交移植腫瘍保有マウス生存をわずかに延長のみ（図2b）。対照的に、抗CTLA-4チェックポイント阻害は全生存を向上させるが原発腫瘍増殖を一時的に遅延のみ。どちらの単独療法も全生存率向上なし。一方、SWCNT-ANXA5増強PTTと抗CTLA-4チェックポイント阻害併用で全生存率向上、腫瘍接種後100日で55%生存達成。

治療後フローサイトメトリーによる脾臓エフェクター細胞解析で、PTTとチェックポイント阻害併用による生存改善メカニズムを推定。マウスにEMT6接種し前述通り治療。治療2週間後、マウス安楽死し複数免疫エフェクタータイプの割合と相対数を定量。ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、好中球、骨髄由来抑制細胞（MDSC）単球、FoxP3制御性T細胞、マクロファージ集団を評価（Additional file 1: Figure S3）。これら集団解析で、PTTと抗CTLA-4チェックポイント阻害併用投与群のみ、対照群と有意差観察。併用群ではヘルパーT細胞（CD4⁺）と細胞傷害性T細胞（CD8⁺）相対数増加観察（図2c,d）。CD4⁺とCD8⁺細胞数増加は、剖検観察された脾臓サイズ顕著増加と相関。

脾臓エフェクター細胞フローサイトメトリー解析に加え、PTT後7日目の血清サイトカイン濃度測定で抗腫瘍免疫メカニズム解明支援。前炎症性サイトカインIL-6、IFN-γ、TNF-αレベルを図3に示す。SWCNT単独または抗CTLA-4単独では、未処理対照群比でサイトカインレベル有意増加なし。しかし、PTT単独でTNF-α有意増加。さらに抗CTLA-4をPTTに追加すると、TNF-α、IL-6、IFN-γレベル有意増加。

SWCNT-ANXA5の生体内分布と毒性

PTT増強用投与後SWCNT-ANXA5の各臓器生体内分布を、エクスシツ組織ライセートSWCNT蛍光定量と標準品比較でモニタリング（Additional file 1: Figure S4）。健常マウスへ1.2 mg/kg SWCNT-ANXA5静注後、標的臓器生体内分布を4ヶ月間追跡（図4a,b）。対照的に、EMT6腫瘍保有マウスへ前述投与プロトコル通り投与後のSWCNT-ANXA5蓄積を、前述治療研究でのPTT実施時点である投与3時間後に決定。臓器収穫前4ヶ月間、マウスの身体副作用と異常行動を監視。SWCNT-ANXA5投与マウスでこの期間中副作用観察なし。研究終了時、標的臓器のヘマトキシリン・エオシン染色FFPE切片組織病理学的検査で毒性観察なし（Additional file 1: Figure S5）。

考察

本データは、標的光熱療法と免疫チェックポイント阻害併用による転移性乳がん治療有効性を支持する。この現象は「アブスコパル効果」として知られ、局所照射が原発巣から遠隔部の腫瘍増殖抑制抗腫瘍応答を誘導する能力を記述。1950年代早期に、局所腫瘍照射が遠隔腫瘍に有意効果有すること観察[22]。研究でアブスコパル効果の全身性は宿主免疫応答由来と確立[23-25]。γ線照射がアブスコパル研究主焦点だが、増大する研究で光熱療法もアブスコパル効果誘導可能実証。多数研究で熱アブレーションとチェックポイント阻害剤抗CTLA-4併用が免疫応答増強示す[16,26-29]。本研究でもEMT6乳がんモデルで標的光熱アブレーションと抗CTLA-4ブロッケード併用後、類似アブスコパル応答観察。

アブスコパル効果は図2a,bデータで説明。直交移植EMT6腫瘍は急速増殖し、PTT治療時点で転移済み。これがPTT単独治療マウスが原発腫瘍完全アブレーションにもかかわらず、未処理対照比で生存わずか延長のみだった理由。抗CTLA-4単独投与は対照比で腫瘍増殖遅延、生存期間68日まで延長したが治癒せず。Jure-Kunkelらも抗CTLA-4投与で類似EMT6腫瘍増殖遅延観察[30]。PTTと抗CTLA-4併用では、接種後100日で55%マウス生存、治癒可能性高い。

抗腫瘍免疫メカニズム洞察のため、フローサイトメトリーで脾臓免疫エフェクター細胞集団定量。PTT単独または抗CTLA-4単独比で、併用療法でヘルパーCD4⁺ T細胞7倍増、細胞傷害性CD8⁺ T細胞3倍増、両者とも高統計的有意性（p<0.005）。これら結果は、光熱療法と免疫チェックポイント阻害によるT細胞共刺激療法併用による潜在的アブスコパル応答の更なる証拠。

CD4⁺とCD8⁺細胞数増加は剖検観察脾臓サイズ増加と相関。脾臓サイズ増大は免疫応答亢進示唆。脾臓は複数細胞型構成、最多はCD4⁺、CD8⁺、B細胞系統[31,32]。本研究未検討だが、CD4⁺とCD8⁺ T細胞数増加に伴いB細胞数も増加期待[33]。ヘルパーCD4⁺ T細胞はサイトカイン刺激と直接細胞間相互作用で他免疫細胞支援し体液性免疫補助。細胞傷害性CD8⁺ T細胞は腫瘍細胞直接殺傷。CD4⁺とCD8⁺細胞数増加は全身性アブスコパル免疫応答指標。

併用治療後全身性アブスコパル免疫応答存在は、マウス血清前炎症性サイトカインレベル増加（図3）でも支持。TNF-αは腫瘍関連マクロファージ活性化し抗腫瘍効果発現[34,35]。IFN-γは腫瘍監視重要役割[36,37]。IL-6はマクロファージとリンパ球増殖促進[38]。PTTと抗CTLA-4併用後7日目のマウス血清これらエフェクター分子有意増加は、抗腫瘍免疫応答存在をさらに支持。

SWCNT投与マウス照射終了時、平均最高腫瘍温度54℃；この温度で腫瘍完全アブレーション十分（図1）。これは酵素不活性化とミトコンドリア損傷起こる45-60℃範囲内[39]。生理食塩水対照群腫瘍温度40℃以下維持、最小治療効果のみ[39-41]。

SWCNT-ANXA5蓄積大部分は濃度ベースで肝臓、心臓、脾臓、腎臓、肺、腫瘍に観察（図4a）。EMT6腫瘍保有マウスでは、SWCNT-ANXA5濃度が肝臓と腎臓と類似（図4a,b）。微量SWCNT-ANXA5が脳、大腸、小腸検出。注目すべきは、投与量比率（%ID）ベースSWCNT生体内分布は標的組織内絶対濃度と相関良好でない。主因は臓器重量差。例えば、与えられた%IDが小臓器では高濃度、大臓器では低濃度対応。SWCNT濃度ベース比較では、腎臓で最高濃度、次いで肝臓と脾臓（図4a）。

生体内分布研究期間中、各臓器でSWCNT分解証拠あり（図4a,b）。臓器内SWCNT分解予想、マクロファージで多層カーボンナノチューブ分解先行知見[42]基づく。本研究使用SWCNTsは平均直径0.8 nm、平均長さ1500 μm。Zhuら[43]研究ではカーボンナノチューブ長と直径ベースで脂質二重層損傷可能性分類し、本研究SWCNTsは「生物学的ソフト」カテゴリ分類、細胞毒性最小化予測、マウス実験で副作用や組織病理学的毒性観察なしと一致。

結論

ここでは、攻撃的転移性乳がんマウスで、SWCNT-ANXA5バイオコンジュゲート光熱療法と抗CTLA-4ベースチェックポイント阻害併用により、比較的高い生存率達成する新規併用治療モダリティ実証。腫瘍血管標的タンパク質ANXA5使用で、原発腫瘍根絶に必要な全身投与SWCNT量を低用量一回投与で最小化。興味深いのは、原発腫瘍のみ照射にもかかわらず、併用療法で転移性がんマウス生存増加観察。重要脾臓抗腫瘍エフェクター細胞数定量メカニズム研究で、PTTと抗CTLA-4両モダリティ併用のみCD4⁺ヘルパーとCD8⁺細胞傷害性T細胞数増加示す。このT細胞増加がアブスコパル応答反映し、抗腫瘍エフェクター細胞が腫瘍転移抑制したと仮説。SWCNTs投与後4ヶ月経過しても臓器検出されるが、実験期間中副作用や明らかな組織毒性観察なし。