アルテミシア・カピラリス、スベリヒユ、ウツボグサ抽出物による金ナノ粒子のグリーン合成：抗酸化活性と細胞毒性評価

概要

3種の水溶性植物抽出物（アルテミシア・カピラリス、スベリヒユ、ウツボグサ）を用いて金ナノ粒子（AuNPs）をバイオ合成しました。それらの抗酸化プロファイル（フリーラジカル消去能、総ポリフェノール含量、還元力）を定量化し、AuNPs合成効率との相関を検証。ウツボグサが最も強い抗酸化活性を示し、最も効果的な還元剤として機能し、表面プラズモン共鳴（SPR）ピーク530 nm、多様な形態を持つAuNPs（PV-AuNPs）を生成。高分解能X線回折で面心立方晶格を確認、ICP-OESで99.3%の反応収率を推定。動的光散乱で流体力学的直径45 ± 2 nm、ゼータ電位-13.99 mV。PV-AuNPsは用量依存的抗酸化活性を示し、胎児牛血清（FBS）非存在下でヒト大腸腺癌（HT-29）細胞に有意な細胞毒性、FBS存在下で膵管腺癌（PANC-1）細胞が最大応答。これらの知見は、ウツボグサ抽出物が生体活性AuNPs製造のための強力で環境調和型還元剤であることを強調します。

はじめに

金ナノ粒子（AuNPs）は薬物担体、触媒、イメージング剤、バイオセンサーとしての汎用性から需要が拡大しています。従来の合成法（イオンスパッタリング、逆ミセル法、化学還元）は高価な試薬を必要とし、毒性懸念があります。植物抽出物を天然の還元・キャッピング・安定化剤として利用するグリーン合成は、コスト効率が良く、スケーラブルで生体適合性のある代替手段です。フェノール類、テルペノイド、フラボノイドなどの植物化学物質は金属イオンを還元するだけでなく、抗酸化特性を付与しナノ粒子安定性を高めます。

アルテミシア・カピラリス（キク科）は抗菌、抗炎症、肝保護作用で伝統医学で用いられ、カピリン、スコパロンなどが関与。スベリヒユ（スベリヒユ科）はアルカロイド、脂肪酸、フラボノイド由来の抗菌、抗真菌、抗酸化作用。ウツボグサ（シソ科）はフェノール酸、ロズマリン酸、ウルソール酸などのトリテルペノイドによる抗ウイルス、抗がん、免疫調節、抗酸化作用。

タンパク質コロナ（ナノ粒子が生体液中に入ると形成される血清タンパク質吸着層）は細胞取り込み、生体分布、細胞毒性に決定的影響を与えます。AuNPsの表面電荷、サイズ、形態がコロナ組成を決定し、治療効率を調節。本研究では、3植物抽出物の抗酸化力がAuNPs形成にどう影響するか、およびFBS有無でのがん細胞との相互作用を検討しました。

方法

材料

試薬はすべて分析グレード。四クロロ金酸カリウム（KAuCl₄）、標準抗酸化剤（BHT、ビタミンC）はSigma-Aldrich（米国）。細胞培養用品はGibco（Thermo Fisher）とGE Healthcare HyClone（オーストラリア）。詳細仕様は補足表参照。

機器

UV-Visスペクトル：Shimadzu UV-2600（λ=300-800 nm）。HR-TEM：JEM-2100F（JEOL、200 kV）。XRD：Rigaku Miniflex（CuKα、1.54056 Å）。ICP-OES：Perkin Elmer Optima 8300。DLSとゼータ電位：NanoBrook 90 Plus。すべてメーカー指示に従い校正。

水溶性抽出物の調製

ウツボグサとアルテミシア・カピラリスの乾燥地上部をOmniherb（韓国大邱）から、スベリヒユをHandsherb（韓国永川）から購入。各植物100 gを脱イオン水1 Lで25 ℃、3時間超音波処理を3回繰り返し。濾液を凍結乾燥し粉末化、-20 ℃保存。

抗酸化アッセイ

フリーラジカル消去（DPPH、ABTS）、還元力、総ポリフェノール含量を標準プロトコルで定量。すべて三重測定、結果をIC₅₀（µg mL⁻¹）またはmg GAE g⁻¹で表示。詳細法は補足資料参照。

AuNPsのバイオ合成

KAuCl₄（10 mM）と植物抽出物（2% w/v）ストック溶液を調製。遠心分離（18,500 g、30分、18 ℃）後、上清を混合し最終濃度0.5 mM Au、0.05% w/v抽出物、2 mLバイアルで反応。37 ℃で5時間、UV-VisでSPR発生をモニター。

細胞培養

HT-29（大腸）、PANC-1（膵臓）、MDA-MB-231（乳房）細胞を高糖DMEM + 10% FBS + 100 U/mLペニシリン + 100 µg/mLストレプトマイシン、37 ℃、5% CO₂で維持。

細胞毒性アッセイ

EZ-CYTOX WSTアッセイで細胞生存率評価。細胞（5×10³ cells/mL）を96ウェルプレートに播種、24時間培養後、PV-AuNPs（0-478.3 µg mL⁻¹ Au）±10% FBSで24時間処理。450 nm吸光度測定、PV-AuNPs固有吸光度を背景差し引き。

統計解析

データは平均±SE。一元配置分散分析後Tukey事後検定（p<0.05）で有意差判定。GraphPad Prism 5.02使用。

結果と考察

抽出物の抗酸化プロファイル

抽出収率：アルテミシア・カピラリス 14.1%、スベリヒユ 39.12%、ウツボグサ 28.6%。抗酸化アッセイでウツボグサがDPPH（50.35±1.22 µg mL⁻¹）、ABTS（38.6±0.44 µg mL⁻¹）で最低IC₅₀、BHT（71.37±0.84 µg mL⁻¹）を上回る。還元力と総ポリフェノールも同傾向：ウツボグサ 162.98 µg mL⁻¹、アルテミシア・カピラリス 235.38 µg mL⁻¹、スベリヒユ 396.16 µg mL⁻¹。総ポリフェノール：ウツボグサ 90.53±6.81 mg GAE g⁻¹、アルテミシア・カピラリス 39.88±4.55 mg GAE g⁻¹、スベリヒユ 18.32±2.76 mg GAE g⁻¹。ウツボグサが最も強力な抗酸化成分を有することを確認。

AuNPsのグリーン合成

各抽出物でAuNPs形成を確認：PO-AuNPs（暗青色、広帯域500-700 nm）、AC-AuNPs（褐色、555 nmピーク）、PV-AuNPs（ワインレッド、530 nmピーク）。ウツボグサの優れた抗酸化活性がSPR強度増大、帯域幅縮小、コロイド安定性向上に直結。PO-AuNPsは25 ℃で30分後に凝集、3種中最低安定性。

形態とサイズ分布（PV-AuNPs）

HR-TEMで多様な形態を観察：球状（23.8±1.3 nm）、正三角形（25.7±2.2 nm）、ロッド（28.4±0.4 nm、アスペクト比2.4）、菱形（長対角22.0±0.6 nm、短対角15.4±0.3 nm）。全粒子が結晶性、格子縞で確認。各形状のサイズヒストグラムはガウシアン分布。

流体力学的サイズと表面電荷

DLSで流体力学的直径45±2 nm（多分散性0.258）、負のゼータ電位-13.99 mV。表面結合植物化学物質による立体・静電的安定化が有効。

結晶性（HR-XRD）

HR-XRDで2θ=38.1°、44.5°、64.8°、77.4°に特徴ピーク、面心立方格子の(111)、(200)、(220)、(311)面に対応。シェラ解析で(111)ピークから結晶子サイズ約16.7 nm。

反応収率

ICP-OESでコロイド溶液中96.337 ppm Au、上清中0.679 ppm Au、変換効率99.3%。

PV-AuNPsの抗酸化活性

PV-AuNPsは用量依存的DPPH消去、IC₅₀ 165.0 µg mL⁻¹ Au（≒49.4 µMビタミンC相当）。植物媒介AuNPsの報告値と同等、表面結合フェノール類に起因。

がん細胞株での細胞毒性

血清フリー条件下でHT-29がPV-AuNPsに最も感受性（478.3 µg mL⁻¹で65.6%阻害）。PANC-1とMDA-MB-231は低応答。10% FBS存在下ではPANC-1の細胞毒性増強（478.3 µg mL⁻¹で37.5%）、HT-29は減弱、タンパク質コロナ依存的な組織特異的効果を示唆。負のゼータ電位がフィブリノゲンなどの選択的タンパク質吸着を促進し、細胞取り込みと毒性に影響。

結論

3植物抽出物は測定可能な抗酸化活性を示し、ウツボグサが最強還元剤として、高結晶性ワインレッドAuNPs（PV-AuNPs）を99.3%変換率、流体力学的直径45±2 nmで生成。PV-AuNPsは用量依存的抗酸化能と大腸、膵臓、乳がん細胞への選択的細胞毒性を示し、タンパク質コロナが効力を調節。高抗酸化植物抽出物のグリーンナノ粒子合成における価値を強調し、PV-AuNPsが標的薬物送達の有望候補であることを示唆、特にウツボグサ由来の心保護植物化学物質と組み合わせた場合。今後は化学療法薬をPV-AuNPsに担持し、抗がんと保護効果の両立を目指す。

略語

ABTS

2,2′-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)

AC-AuNPs

アルテミシア・カピラリス抽出物合成AuNPs

AgNPs

銀ナノ粒子

AuNPs

金ナノ粒子

BHT

ブチルヒドロキシトルエン

DMEM

ダルベッコ改変イーグル培地

DPPH

2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル

FBS

胎児牛血清

GAE

没食子酸当量

HR-TEM

高分解能透過型電子顕微鏡

HR-XRD

高分解能X線回折

HT-29

ヒト大腸腺癌細胞株

IC₅₀

半数阻害濃度

ICP-OES

誘導結合プラズマ発光分光分析

MDA-MB-231

ヒト乳房腺癌細胞株

PANC-1

ヒト膵管腺癌細胞株

PO-AuNPs

スベリヒユ抽出物合成AuNPs

PV-AuNPs

ウツボグサ抽出物合成AuNPs

SPR

表面プラズモン共鳴

WSTアッセイ

水溶性テトラゾリウムアッセイ