単分散貴金属マイクロスフェアの磁場アセンブリによる再現性・リサイクル可能なSERS基板の作製

概要

コロイド構成要素のアセンブリによる均一アレイ膜の作製は、個々の機能と集団機能の統合という点で実用的な関心を集めています。ここでは、単分散貴金属マイクロスフェアを均一アレイ膜に整列させ、表面増強ラマン散乱（SERS）応用に向けた磁場アセンブリ経路を提案しました。この手法は、単一貴金属マイクロスフェアの信号感度と、それらが形成する均一アレイ膜の再現性を統合的に示しています。この目的で、自作の超音波アシスト反応システムを用いて、多機能Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂@Ag（FOSTA）コロイドマイクロスフェアを構成要素として合成しました。SERS試験では、これらの多機能マイクロスフェアが溶液中の分析物（R6G）をまず捕捉し、外部磁場下で均一膜へアセンブリすることで、良好な再現性を伴う高いSERS検出感度を示しました。さらに、FOSTAコロイドマイクロスフェア内のTiO₂中間層により、吸着分析物の光触媒分解を通じて構成要素をリサイクル・自己洗浄し、SERS基板の繰り返し使用を可能にしました。

はじめに

独自の分光フィンガープリント、高感度、非破壊データ取得という比類なき利点の統合により、表面増強ラマン散乱（SERS）分光法は、生化学、化学合成、食品安全、環境モニタリングなど幅広い潜在的応用を持つ強力かつ極めて感度の高い分析技術として盛んに研究されてきました[1-3]。粗い銀表面が吸着分子のラマン散乱を大幅に増強することが発見されて以来[4,5]、SERS基板はラマン信号との強い関連性から研究の焦点となってきました。凝集体内の隙間や接合部、いわゆる「ホットスポット」が強いラマン信号に寄与することが判明し[6]、「ホットスポット」を含む構造を持つ様々な貴金属ナノ構造材料の設計・合成において大きな進展がありました[7]。

これまで、SERS活性ナノ粒子とナノ構造支持材料で構成される様々な材料が、更なる増強のために設計されてきました[8,9]。一般的にSERS基板は、構造化膜とコロイド粒子の2大カテゴリに分類されます。構造化膜は、電子ビームリソグラフィ、AAOテンプレート、ポリスチレンなどのコロイドアレイテンプレートなどの複雑な手順で作製されることが多く[10-14]、これらの膜表面は比較的均一で、再現性のあるSERS信号に有利です。しかし、作製手順が時間を要し、5 nm未満の制御可能なナノギャップを持つナノパターン表面を作るのは困難です[15]。したがって、構造化表面のSERS増強は、濃密なナノスケールギャップが階層粒子全体に分布しているウェットケミストリー法で作製される貴金属粒子や階層マイクロスフェアのものより通常ははるかに小さいです[16-18]。残念ながら、階層貴金属粒子をSERS基板として用いた場合の信号感度は優れていますが、無秩序な凝集により再現性は比較的劣ります[19]。

不規則な「ホットスポット」分布を解決するため、自己組織化戦略を用いて秩序ある凝集を実現し、ナノスケール構成要素間で比較的均一に分布した「ホットスポット」の生成を誘導してきました[20,21]。表面張力、共有結合相互作用、ファンデルワールス力、静電引力など、様々な力に基づく手法が開発されています[22-29]。例えば、Baiらは制御蒸着プロセスにより垂直配向した金ナノロッドの大面積アレイを作製しました[23]。KimらはPS-b-P4VPミセルに基づく簡便な方法で、高感度・優れた再現性を持つ超高密度銀ナノクラスタアレイをSERS基板として作製しました[28]。これらの貴金属粒子の膜アセンブリは高い再現性のSERS信号を示しますが、懸濁液アプローチと比較して分析物の結合率が低いという課題があります。

磁性貴金属マイクロスフェアは、磁気分離により溶液中で分析物を効率的に捕捉し、ガラススライド上で固定化後に優れたSERS性能を発揮します[30-32]。さらに、光触媒材料を導入して自己洗浄型SERS基板を作製し、基板のリサイクルを容易にする試みもなされてきました[33,34]。しかし、これらの多機能磁性複合マイクロスフェアは分析物を捕捉し、外部磁場下で速やかに膜を形成できますが、その結果得られる膜はしばしば無秩序で、「ホットスポット」の分布が非常に不均一になり、SERS信号の再現性が低くなります。したがって、これらの磁性貴金属マイクロスフェアはSERS応用において単なる磁気分離ツールとしてのみ機能するにとどまっていました。磁気アセンブリは外部磁石による簡便な操作が魅力ですが、特に三次元アセンブリでは構成要素の高い単分散性が要求されます[35]。これまで、磁気アセンブリ経路を用いて再現性・リサイクル可能なSERS基板を構築した研究は報告されていません。

本研究では、自作の超音波アシスト反応システムにおいて、単分散多機能Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂@Ag（FOSTA）複合マイクロスフェアを合成し、磁気アセンブリに適した構成要素としました。スキーム1に示すように、多機能FOSTA複合マイクロスフェアは、分散と磁気分離を通じて溶液中の分析物（R6G）を効率的に捕捉し、SERS分析を行います。次に、これらのFOSTA複合マイクロスフェアを外部磁場下でガラススライド上に均一膜へアセンブリし、高感度かつ再現性のあるSERS性能を発揮させます。さらに、使用済みFOSTA複合マイクロスフェアは、紫外線照射下での吸着分析物の光触媒分解によりリサイクル可能です。

実験手法

Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂マイクロスフェアの合成

単分散Fe₃O₄@SiO₂マイクロスフェアは先行研究[36]に従って合成しました。TiO₂シェルのコーティングは、凝集を防ぐため超音波槽で行いました。典型的な合成では、Fe₃O₄@SiO₂（20 mg）をヒドロキシプロピルセルロース（0.1 g）、エタノール（45 mL）、脱イオン水（0.1 mL）の混合液に分散させました。30分後、エタノール中のテトラブトキシチタン（5 mL中1 mL）をチューブポンプで15分かけて完全に注入しました。その後、超音波槽の水を徐々に85℃まで加熱し、100分間還流させました。生成物を外部磁石で分離し、エタノールで繰り返し洗浄後、ポリビニルピロリドン（PVP、1.0 g）を含む75 mL脱イオン水に超音波で30分再分散させ、テフロン製オートクレーブに移して180℃で非晶質TiO₂シェルをアナターゼ構造に変換しました。

FOSTAマイクロスフェアの合成

銀シェルのコーティングも凝集防止のため超音波槽で行いました。上記Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂マイクロスフェア（約25 mg）を、硝酸銀（0.1 g）とPVP（1 g）を含む水/アンモニア/エタノール混合溶液（2 mL/0.2 mL/13 mL）に分散させ、40℃で超音波アシスト下30分間分散させました。温度を85℃まで上昇させ、一定時間後にフラスコを超音波槽から取り出し、生成物を外部磁石で即座に分離、エタノールで数回洗浄しました。最終生成物はエタノール中に保存し、更なるキャラクタリゼーションと使用に供しました。

キャラクタリゼーション

生成物は、Cu Kα線（Philips X'pert回折計）を用いた2θ=10°-80°の範囲でのX線回折（XRD）、走査型電子顕微鏡（SEM、Hitachi S-4800）、透過型電子顕微鏡（TEM、JEOL-2010）で分析しました。磁気測定は超伝導量子干渉デバイス磁力計（SQUID、Quantum Design、MPMS XL）で行いました。

SERS測定

R6Gをラマンプローブとして用い、SERS基板の再現性をテストしました。異なる濃度のR6G溶液（20 mL）を調製し、エタノール中に保存したFOSTA複合マイクロスフェアを添加、シェーカーで2時間振盪しました。生成物を外部磁石で抽出し、エタノールで洗浄しました。残液を洗浄済みシリコンペレットに滴下し、その下に円形磁石を配置、ペトリ皿で覆い、エタノールが全て蒸発するまで放置しました。全工程を防振台上で実施しました。残留溶液を空気中で徐々に乾燥させた後、ラマン装置（LABRAM-HR）で測定しました。励起波長633 nmのレーザーを用い、試料表面へのレーザースポット径は約3 μm、各スペクトルの取得時間は3秒でした。

光触媒・リサイクル試験

合成したFOSTA複合マイクロスフェアの光触媒性能をR6Gをモデルとして評価しました。試料（40 mg）をR6G溶液（40 mL、10⁻⁵ M）に分散させ、暗所で30分間放置して暗所吸着実験を行いました。上記溶液を8等分し、300 W水銀灯を光源とする自作光触媒セットアップに入れました。各照射時間間隔で1アリコート（5.0 mL）を採取し、遠心分離で光触媒を除去。上澄み液を紫外可視吸収分光計（上海儀器分析機器有限公司）で525 nmの吸光度を測定し、定量分析しました。リサイクル試験は上記手順に従い、UV照射時間を100分に設定し、SERS試験前に脱イオン水で数回洗浄して残留イオンを除去しました。

結果と考察

設計した経路によれば、単分散Fe₃O₄マイクロスフェアが磁気アセンブリの鍵となります。ここでは、先行研究[36]で報告した水熱法で合成しました。図1a、e、jに示すように、直径200 nmの単分散Fe₃O₄マイクロスフェアが得られ、明らかな凝集なく良好に分散していました。粒子の分散性と外殻成長への適合性をさらに向上させるため、Stöber法でFe₃O₄マイクロスフェア上にシリカ層をコーティングしました。図1bから、均一なFe₃O₄@SiO₂複合マイクロスフェアが得られ、SEM試料調製時にその高い形状・サイズ単分散性の結果として六方最密充填超構造を形成する傾向が見られました（図1b、f）。均一なFe₃O₄@SiO₂複合マイクロスフェアは後続のシェル成長のための優れた磁性プラットフォームですが、TiO₂とAgのヘテロ堆積時の凝集を防ぐため、特別な反応システムが必要です。本実験では、機械撹拌機と還流装置を超音波槽に統合しました。機械撹拌機と超音波を用いないで合成したFe₃O₄@SiO₂@TiO₂複合マイクロスフェアは、補足情報のAdditional file 1: Figures S1、S2に示されており、粒子間斥力の低下や反応溶液の不均一性により、凝集粒子や粗い表面を持つ粒子が観察されました[37]。一方、超音波と機械撹拌機の両方を備えた自作反応システムでは、図1c、g、kに示すように、微小なTiO₂ナノ粒子で構成されるシェルを持つ、良好に分散可能なFe₃O₄@SiO₂@TiO₂マイクロスフェアが合成できました。非晶質TiO₂シェルを水熱処理でアナターゼ構造に変換後、PVPによる銀イオンの緩やかな還元を利用したインシチュー法でさらに銀をコーティングしました。得られたFOSTA複合マイクロスフェアは依然として良好に分散しており（図1d）、TiO₂シェル上に高密度のAgナノ粒子が堆積していました（図1h、i）。以上の結果、自作セットアップを用いた多段階コーティング手順により、多機能FOSTA複合マイクロスフェアが合成されました。機械撹拌機と還流により反応が均一に進行し、超音波により磁性コアがコーティング過程で良好に分散されました。要約すると、磁気アセンブリ用構成要素として利用可能な単分散多機能FOSTA複合マイクロスフェアが合成されました。

各コーティング段階での生成物は全てX線粉末回折（XRD）でキャラクタリゼーションされました。図2aのFe₃O₄の特徴的XRDは、35.3°と62.4°に位置する2つのピーク（黒点）で特徴づけられ、それぞれFe₃O₄の立方相の（311）面と（440）面に対応します（JCPDS Card No. 75-0449）。非晶質SiO₂層コーティング後、図2bで23°付近に幅広いピークが観察されました[38]。さらにTiO₂層を堆積・水熱処理すると、Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂マイクロスフェアのXRDパターンに、Fe₃O₄@SiO₂マイクロスフェアと比較して25.3°、37.9°、48.0°（赤三角）に追加のピークが現れ、これらはアナターゼ相の（101）、（004）、（200）面からの反射に対応します（JCPDS Card No. 75-2545）。Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂マイクロスフェア表面に高密度Agナノ粒子を堆積させると、上記物質の回折ピークは依然として観察されますが、38.1°と44.6°（青星）の強いピークにより薄くなっており、これらはAgの立方相の（111）と（200）にインデックスされます（JCPDS Card No. 4-783）。図2のXRDパターンは、FOSTA複合マイクロスフェア中にスピネル型Fe₃O₄、非晶質SiO₂、アナターゼ型TiO₂、立方相Ag NPsの特徴的回折ピークが対応していることを示し、設計経路通りに3つの異なる層がFe₃O₄マイクロスフェア上に順次コーティングされたことを確認しています。

Fe₃O₄とFOSTA複合マイクロスフェアの磁気特性を調べました（図3）。図3aに示されるゼロ保磁力と可逆ヒステリシス挙動は、Fe₃O₄マイクロスフェアの超常磁性を示しています。Fe₃O₄マイクロスフェアの室温飽和磁化は73.3 emu/gですが、SiO₂、TiO₂、Agシェル等の非磁性物質が追加されるため、FOSTA複合マイクロスフェアの磁化（Fe₃O₄粒子から継承）は顕著に低下します。飽和磁化値（2.62 emu/g）は大幅に減少しましたが、FOSTA複合マイクロスフェアは懸濁系から磁気分離により徐々に充填可能です。

FOSTA複合マイクロスフェアにおいて、Agシェル構造はSERS性能を決定するだけでなく光触媒特性にも影響するため、Agシェルの制御成長が全体性能の最適化に必要です。ここではPVPが界面活性剤の役割に加え、穏やかな還元剤として機能するため、Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂マイクロスフェア上にAg核が出現した後の反応時間でAgナノ粒子の成長を容易に制御できます。異なる時間間隔で4つの代表的な生成物を採取・調査し、サンプルI-IVと命名しました（図4）。図4aに示すように、15分で微小なAgナノ粒子が出現し、20分でこれらが成長しますが互いに接触していません。Agナノ粒子の更なる成長により、25分でFe₃O₄@SiO₂@TiO₂マイクロスフェア表面の大部分が覆われます。最終的に、Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂マイクロスフェア表面が大型Agナノ粒子で完全に覆われます。成長過程で、Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂マイクロスフェア表面のAgナノ粒子が、Agナノ粒子から完全なシェルへと徐々に成長することがわかります。

上記の各間隔でのサンプルを、R6GをプローブとしてSERS基板としてまずテストし、結果を図4bに示します。図4bの500-1750 cm⁻¹の全ピークはR6G信号に帰属し、773 cm⁻¹のピークはキサンテン骨格の水素原子の面外曲げ振動、1187、1311、1363、1509、1651 cm⁻¹のピークは芳香環のC-H面内曲げ、C-O-C伸縮、C-C伸縮に割り当てられます[39]。最も強い1363 cm⁻¹のピークを比較対象としました。サンプルIは、分離したAgナノ粒子が小さすぎるため、明確なピークのない非常に弱いSERS信号を示しました。サンプルIIは、粒子サイズ増大に伴う局所電磁場増強により、サンプルIより強いSERS信号を示しました[40,41]。サンプルIIIでは、分離したAgナノ粒子のサイズが約50 nmに達し、最強の増強を生むと報告されていること[40]、さらにこれらのAgナノ粒子が接近して大量のギャップ（「ホットスポット」）を形成したこと[8]により、SERS信号がさらに増強されました。しかし、Agナノ粒子の更なる成長により、サンプルIVではそれらが合併し、ギャップが同時に消失したため、SERS活性が低下しました。したがって、サンプルIIIが他のサンプルと比較して最高のSERS性能を示します。

サンプルI-IVの光触媒性能をR6Gを用いて調べました。図4cに示すように、サンプルI-IIIでR6GがUV照射下で完全に分解可能でした。図4cのインセットに示すように、磁性マイクロスフェア上のTiO₂-Ag複合体のTiO₂コアがUV光で励起され、電子がTiO₂伝導帯からAg伝導帯へ移動し、超酸化物アニオン（·O₂⁻）やヒドロキシルラジカル（·OH）などの高活性酸化種を生成します。これらの酸化種がR6Gの分解を引き起こします[42]。しかし、FOSTA複合マイクロスフェア中のAg含有量増加に伴い、サンプルI-IVの分解能力は低下傾向を示しました。先行研究では、TiO₂上に最適化されたサイズと密度の貴金属ナノ粒子を担持することが優れた触媒性能に必要とされています。より大きなAg含有量は、Ag粒子が再結合中心としても作用するため、光分解性能に悪影響を及ぼす可能性があります。したがって、実験ではAg含有量増加に伴い全分解時間が長くなり、サンプルIIIではほぼ3時間に達しました。サンプルIIIは相対的に弱い分解効率を示しますが、吸着R6G分子を完全に分解可能であり、自己洗浄要件を満たします。したがって、総合的に考慮すると、最強のラマン増強を示すサンプルIIIが、アセンブリ型SERS基板の最適な構成要素となります。

磁気アセンブリは、磁場勾配による磁気充填力が粒子の局所濃縮を誘導し、結晶化プロセスを開始できるため、非常に強力なアセンブリ手法と報告されています[43]。ここでは、外部磁場の誘導により、超常磁性と単分散性を持つFOSTA複合マイクロスフェア（サンプルIII、以下同じ）が速やかかつ効率的に秩序構造へアセンブリされました。図5aに示すように、単分散FOSTA複合マイクロスフェアが外部磁石下で大面積・均一膜へアセンブリ可能です（以下「磁気アセンブリ膜」と呼ぶ）。図5bの拡大局所領域から六方最密充填構造が観察されます。比較のため、外部磁場なしでFOSTA複合マイクロスフェアからなる膜（以下「自己組織化膜」と呼ぶ）も作製しましたが、溶媒蒸発時のランダム凝集（図5d）により、無秩序構造を持つ粗い膜が得られました（図5c）。さらに、磁気アセンブリ膜は自己組織化膜より平滑です。以上の結果、FOSTA複合マイクロスフェアの磁気アセンブリにより、秩序性と平滑性を含むより均一な膜が得られることが示されました。磁場あり・なしでアセンブリした膜のSERS信号再現性を、基板上の20スポットを選択して調べました（図5e、f）。R6G溶液濃度は10⁻⁸ Mとし、対応するラマン強度（1363 cm⁻¹）を図5gに記録しました。磁気アセンブリ膜の平均相対標準偏差（RSD）は約0.05と計算され、自己組織化膜の約0.197よりはるかに低い値でした。また、磁気アセンブリ膜からのラマンピーク強度は、平均的に自己組織化膜よりわずかに高く、これは粒子間で生成する二次的「ホットスポット」によるアレイ構造増強効果に起因すると考えられます[44]。要約すると、実験結果は磁気アセンブリがFOSTA複合マイクロスフェアに感度と再現性の両面で更なる利点を与えることを示しています。R6Gの濃度依存性SERSスペクトルをさらにテストし、FOSTA複合マイクロスフェアの検出限界を調べました。磁気アセンブリ膜の検出能力を、10⁻⁶から10⁻¹² Mの広範囲のR6G溶液濃度で評価しました。図5hに示すように、FOSTA複合マイクロスフェアは10⁻⁶から10⁻¹¹ Mの濃度で明確な増強信号を示し、図5cのインセットでは10⁻¹¹ Mという低濃度でも全増強ピークが明確に観察されました。1363 cm⁻¹ピークでの対数強度をR6Gの対数濃度に対してプロットしました（Additional file 1: Figure S3）。R6G検出の線形範囲は10⁻⁶から10⁻¹¹ Mで、検出限界（LOD）は10 ppbであり、設計されたSERSシステムの高感度検出能力を示しています[45,46]。

本実験では、AgとTiO₂シェルを含む異なる機能層を組み合わせることで、SERS技術と光触媒特性を統合しました。それらのリサイクル性を、繰り返しSERS試験と光分解試験で調べました（図6）。FOSTA複合マイクロスフェアをR6G分析物含有溶液に浸漬し、SERS試験後、脱イオン水中でUV光照射下約100分間分散させました。その後、試料を脱イオン水で数回洗浄し、残留イオンと分子を除去しました。主要ピークが消失し、SERS基板のラマンスペクトルが新品と類似になることが観察されました。基板への分析物吸着量が非常に少ないため、自己洗浄目標の実現は非常に簡単です。洗浄後、基板を数回繰り返し使用可能です。R6Gのラマンピークから、3サイクル後のSERS信号減少はわずかであり、自己洗浄後は毎回SERS信号が検出されませんでした。これはFOSTA複合マイクロスフェアがSERS基板として繰り返し使用可能であることを示しています。さらに、3サイクル全工程後、FOSTA複合マイクロスフェアの形態に明らかな変化は見られません（図6のインセット画像）、これはFOSTA複合マイクロスフェアが物理的に安定であることを示唆しています。

結論

高い再現性とリサイクル可能なSERS基板を作製するため、自作の超音波アシスト反応システムで多機能マイクロスフェアを構成要素として開発しました。外部磁場下で、得られたFOSTA複合マイクロスフェアが平滑でアレイ構造を持つ膜へアセンブリされ、感度が高く再現性のあるSERS性能を示しました。TiO₂シェルのおかげで、使用済みFOSTA複合マイクロスフェアは自己洗浄プロセスでさらにリサイクル可能です。SERS機能と光触媒機能を磁性マイクロスフェア上で統合することで、磁気アセンブリ経路は再現性・リサイクル可能なSERS基板のための有望な技術となります。