有機リン・カルシウム源から作製した高比表面積卵黄-殻構造リン酸カルシウムマイクロスフェア：HEL吸着能向上

概要

卵黄-殻構造リン酸カルシウムマイクロスフェアは、優れた物理化学的特性と生体適合性により医療応用への大きな可能性を秘めています。しかし、高吸着能力を持つ卵黄-殻構造リン酸カルシウムの開発は課題となっています。本研究では、アデノシン5'-三リン酸二ナトリウム塩（ATP）をリン源、グルコン酸カルシウム一水和物（CG）をカルシウム源とし、セルフテンプレート法で多孔性卵黄-殻構造マイクロスフェア（ATP-CG）を合成しました。その比表面積（SBET = 143 m²/g）は、カルシウム源を乳酸カルシウム五水和物（CL）に置き換えて合成したATP-CLマイクロスフェアの約3倍に相当します。Ca/Pモル比、水熱温度、時間がATP-CGマイクロスフェア形態に与える影響も調査。有機カルシウム源と有機リン源が卵黄-殻構造形成に重要な役割を果たすことが判明しました。さらに、異なるカルシウム源で合成した2種の卵黄-殻構造マイクロスフェアの吸着実験を行い、ヘン卵白リゾチーム（HEL）吸着メカニズムを解明。ATP-CGマイクロスフェアの吸着容量（332±36 mg/g）はATP-CLマイクロスフェア（176±33 mg/g）の約2倍でした。カルシウム源由来の高比表面積とATP-CGマイクロスフェア特有の表面化学特性がHEL吸着能力向上に重要な役割を果たします。本研究は、調製した卵黄-殻構造マイクロスフェアが薬物送達分野での応用に有望であり、薬物吸着能力向上の効果的アプローチを提供することを示しています。

はじめに

リン酸カルシウムは、優れた生体適合性、高担持容量、送達効率により近年大きな注目を集めています。リン酸カルシウム関連生体材料は組織工学、骨修復、薬物送達など様々な生物医学分野で広く使用されています。リン酸カルシウムベース材料の応用範囲拡大と性能向上のため、炭酸アパタイト（HAp）マイクロスフェア、HApマイクロチューブ、中空HApマイクロスフェア、非晶質リン酸カルシウム（ACP）のメソポーラス卵黄@ケージ殻ナノスフェアなど、様々な形態・微細構造を持つリン酸カルシウム材料が報告されています。

様々な形態の中でも、卵黄-殻構造マイクロスフェアは材料科学のフロンティアであるだけでなく独自の形態的特徴を示すとして、ますます注目されています。卵黄-殻構造マイクロスフェアでは、卵黄コアと殻の間のボイド空間が様々な担持物の貯蔵庫として機能し、多孔質構造の殻がゲスト分子の拡散経路を提供するため、触媒、リチウムイオン電池、光触媒、生物医学など多様な応用への大きな可能性を秘めています。従来、犠牲テンプレート法が卵黄-殻構造マイクロスフェア調製の主流でした。これらテンプレート戦略は構造と特性調整で大きな成功を収めましたが、煩雑な工程ステップ、界面活性剤や構造指向試薬の使用など、人体健康への有害性が懸念される欠点があります。現在、セルフテンプレート法が卵黄-殻構造マイクロスフェア研究で広く用いられています。従来のテンプレート法とは異なり、セルフテンプレート法で用いられるテンプレートはボイド形成用テンプレートであると同時に卵黄-殻構造マイクロスフェアの前駆体でもあります。したがって、セルフテンプレート法は卵黄-殻構造マイクロスフェア調製の便利なアプローチです。しかし、セルフテンプレート法をリン酸カルシウム卵黄-殻構造マイクロスフェア合成に導入することは、依然として興味深い課題です。

さらに、リン酸カルシウム材料はタンパク質、DNA、siRNAなど様々な担持物のキャリアとして利用されてきました。しかし、リン酸カルシウムの薬物吸着能力不足は早急に解決すべき課題です。一般に、薬物分子の担体表面固定化アプローチは、表面電位、疎水性/親水性、水素結合、比表面積などの表面特性に依存します。したがって、表面特性と比表面積の改善は担体の薬物吸着能力向上の有効なアプローチです。

本研究では、アデノシン5'-三リン酸二ナトリウム塩（ATP）をリン源、グルコン酸カルシウム一水和物（CG）をカルシウム源とし、セルフテンプレート法で多孔性卵黄-殻構造リン酸カルシウムマイクロスフェアを調製しました。テンプレート剤添加なしで、調製マイクロスフェアは特に高い比表面積を示しました。さらに、ATP-CGマイクロスフェアのヘン卵白リゾチーム（HEL）吸着挙動を、カルシウム源を乳酸カルシウム五水和物（CL）に置き換えて調製したATP-CLマイクロスフェアと比較検討。結果、カルシウム源による比表面積差と表面化学特性がHEL吸着能力向上に重要な役割を果たすことが明らかになりました。

実験方法

材料

アデノシン5'-三リン酸二ナトリウム塩（ATP）はマックリン生化学株式会社（中国上海）製。グルコン酸カルシウム一水和物（CG）と乳酸カルシウム五水和物（CL）はサンゴンバイオテック株式会社（中国上海）製。ヘン卵白リゾチーム（HEL、~70000 U/mg）はシグマアルドリッチ（ドイツタウフキルヒェン）製。

ATP-CGおよびATP-CL卵黄-殻構造マイクロスフェアの合成とキャラクタリゼーション

ATP-CG卵黄-殻構造リン酸カルシウムマイクロスフェアは以下の手順で調製：0.9 g CGを20 mL超純水に溶解し60℃で溶液Cを調製。0.11 g ATPを5 mL超純水に溶解し溶液Pを調製。溶液Cを室温まで冷却し、溶液Pと激しく攪拌混合、2 M NaOH水溶液でpHを5に調整。最終溶液量を超純水追加で30 mLとし、Ca/Pモル比を3.3に設定。最終溶液をマイクロ波消化システムに移し、マイクロ波水熱反応で120℃、15分処理。生成沈殿を遠心分離（4500 rpm、10分）、超純水で洗浄、48時間凍結乾燥。ATP-CLマイクロスフェアは文献[24]手順で調製。

マイクロスフェア結晶相をX線回折（XRD、Cu Kα源、λ=0.154 nm）で評価。形態を走査型電子顕微鏡（SEM）、透過型電子顕微鏡（TEM）、高分解能TEM（HRTEM）で観察。組成をフーリエ変換赤外分光光度計（FTIR）で分析。比表面積をブラウナー・エメット・テラー法（BET）で測定。熱重量分析（TGA）で昇温速度10℃/分、窒素雰囲気下で熱特性評価。

HEL吸着とキャラクタリゼーション

2種マイクロスフェアのHEL吸着実験は以下の通り：一定量の卵黄-殻マイクロスフェア（ATP-CG：Ca/P=3.3、120℃、15分、ATP-CL：Ca/P=2.5、120℃、30分）を水に分散、10分間定常超音波処理で1.5 mg/mL懸濁液調製。様々な濃度HELを含む水溶液0.5 mLを上記懸濁液1 mLに即時添加、最終薬物濃度1–7.5 mg/mL。各溶液を37℃、200 rpmで6時間振盪。遠心分離後、上清中HEL量をUV-Vis分光光度計（280 nm）で測定。薬物担持前後マイクロスフェアのゼータ電位と組成をゼータ電位アナライザー、FTIR分光計、熱重量分析装置（TGA、昇温速度10℃/分、窒素雰囲気）で評価。

吸着等温線

吸着挙動調査のため、Dubinin-Radushkevic等温線（D-R）モデルを適用。D-Rモデルはマイクロポア充填理論に基づき、不均一表面上の非理想吸着記述と吸着メカニズム（物理吸着か化学吸着か）の識別に用いられます。モデル式：Qeq = Qm exp(-KDR ε²)、ε = RT ln(1+1/Ceq)、E = 1/√KDR。Qeqは平衡吸着容量（mg/g）、Ceqは平衡時水相吸着質濃度（mL/L）、Qmは最大吸着容量、Rは気体定数8.314 J/(mol·K)、Tは絶対温度、Eは吸着タイプ推定用平均自由エネルギー。E値8 kJ/mol未満で物理吸着、8–16 kJ/molでイオン交換、16 kJ/mol超で化学吸着と判別。

薬物吸着の統計解析

データを平均±標準偏差（SD）で表示。有意差（p<0.05）を一元配置分散分析で統計計算。全実験を三重実施、DPSソフトウェアでデータ解析。

結果と考察

マイクロスフェアの形態と化学的キャラクタリゼーション

ATP-CG卵黄-殻構造マイクロスフェア

図1に異なる反応条件で得られた各種試料のSEM像を示します。t=5分または15分では全生成物が均一マイクロスフェアで構成。水熱時間を30分に延長すると、ナノシート自己組立てマイクロスフェアが形成（図1f、i、l）。Ca/P影響もt=30分で観察され、Ca/P増加に伴いナノシート自己組立てマイクロスフェアが徐々に形成。ナノシート自己組立てマイクロスフェア形成理由：マイクロ波水熱プロセス下でATP分子が加水分解しアデノシンベース分子（ADP、AMP、アデノシン）を形成しつつリン酸イオン（PO₄³⁻）を放出。同時にCG分子が加水分解しグルコン酸とカルシウムイオン（Ca²⁺）を生成。リン酸イオンとカルシウムイオンが反応し一次ACP核を形成。初期ACP核が成長・集合しACPマイクロスフェア形成。水熱時間延長でATPとCG分子がさらに加水分解しより多くのPO₄³⁻とCa²⁺イオン放出、系の過飽和度と核生成率向上によりナノシート自己組立てマイクロスフェア形成。またCa/P増加で局所的高Ca²⁺濃度が同様に生成物形態変化を加速。以上より水熱時間とCa/Pが生成物形態に重要影響を与えることがわかります。

次に、120℃、15分で様々なCa/Pで合成したマイクロスフェアのFTIRスペクトルを調査（図2）。1620 cm⁻¹、1383 cm⁻¹、912 cm⁻¹のピークはそれぞれCG由来のC=O、C–O、ATP由来のP–O基に帰属し、未加水分解CGとATP分子またはそれら誘導体がマイクロスフェア表面に吸着していることを示唆。HAp由来PO₄³⁻特性ピークは1035 cm⁻¹に微弱に観察、1122 cm⁻¹と567 cm⁻¹の吸収ピークはACP由来PO₄³⁻イオンに帰属。生成物がACPとHApで構成されることを示唆。FTIR結果より、ATPをリン源、CGをカルシウム源としてリン酸カルシウムが成功裏に調製されたことが確認されます。

さらに、120℃、15分で様々なCa/Pでマイクロ波水熱法合成した試料のSEMとTEM像を図3に示します。Ca/P 0.8または1.67では多孔質マイクロスフェア（図3b、d）。Ca/P 2.5で形態が卵黄-殻構造マイクロスフェアへ変化開始（図3f）。Ca/P 3.3で完全に卵黄-殻構造マイクロスフェアで構成（図3h）。それ以上では一部破損スフェアと露出した卵黄-殻マイクロスフェアコア（図3gインセット）が機械的破砕後観察され、卵黄と殻間の中空構造を証明。以上の観察から、様々なCa/Pで合成した卵黄-殻構造マイクロスフェア形成メカニズムを暫定的に提案：Ca/Pが低い場合、多孔質ACPマイクロスフェアが最初に形成。これはATPとCG分子またはそれら誘導体の表面吸着による抑制効果に起因。Ca/Pさらに増加で系の高過飽和度によりメタスタブルなACPがさらに成長。最終的に結晶HApが外表面に形成（図3i HRTEM像で面間隔0.308 nmがHApの(210)にインデックス可能）。結果としてHApとACPの体積または密度差により卵黄と殻間に中空構造生成。対応するEDSマッピングでCa、P、O元素がマイクロスフェア全体に均一分布。図3kのEDSスペクトルと図3lのXPSスペクトルで化学元素が主にCa、P、Oで構成されることがわかり、FTIR結果（図2）と整合。

Ca/P=3.3で合成した試料のマイクロ波水熱時間と温度影響をさらに調査。図4a-bに示す通り、水熱時間5分では多孔質マイクロスフェア。前述の通りt=15分で卵黄-殻構造マイクロスフェアも形成（図4c-d）。水熱時間60分延長または温度160℃上昇でシートまたはロッド束観察（図4e-l）。多孔質→卵黄-殻→シート/ロッドへの形態変化は、溶液中ATPとCG分子の連続加水分解によるACPさらなる成長に起因。またACPマイクロスフェア表面吸着ATPとCG分子または誘導体の加水分解もACP成長加速。60分または160℃で興味深い現象：これらシート/ロッドもACPナノ粒子から発育（赤枠内）、図S1 DTA解析で確認。DTA曲線に650℃で発熱ピーク観察、ACP結晶化に帰属。発熱ピークは水熱時間または温度上昇で徐々に弱まり、生成物中ACPが結晶性リン酸カルシウムへ転移進行示唆。

Ca/P=3.3で異なる水熱時間・温度で合成した試料の化学組成と構造をFTIRとXRDで調査。図5aに示す通り、HAp由来PO₄³⁻イオン特性ピークは1037 cm⁻¹と603 cm⁻¹。1122 cm⁻¹はACP由来PO₄³⁻イオン特性ピーク。1620 cm⁻¹と1383 cm⁻¹はCG由来C=OとC–O基特性ピーク。912 cm⁻¹はATP由来非対称P–O伸縮振動。水熱時間・温度増加に伴いCGとATP特性ピーク強度は徐々に減少し、マイクロスフェア表面吸着ATPとCG分子または誘導体がさらに加水分解されることを示唆。一方、HAp由来PO₄³⁻イオン特性ピーク強度はACP特性ピーク強度減少とともに徐々に増加傾向、生成物結晶相がHAp相へ転移進行示唆。

図5bに様々な試料XRDパターンを示します。5分または15分合成マイクロスフェアで2θ≈30°付近に非晶相特性ハープ観察。水熱時間60分延長または温度160℃上昇でマイクロスフェア結晶相が完全にHApへ転移、標準データ（JDCPS no. 09-0432）でインデックス可能。(211)、(300)、(002)格子面相対強度向上が生成物結晶性向上をさらに説明。XRDとFTIR結果が水熱温度・時間増加に伴う生成物結晶相転移をさらに確認。

ATP-CL卵黄-殻構造マイクロスフェア

薬物吸着挙動比較のため、有機カルシウム源CLを用いマイクロ波水熱法で別の卵黄-殻構造マイクロスフェアを調製[24]。形態的には試料は依然として卵黄-殻構造マイクロスフェアで構成、破損スフェア（図6aインセット）とTEM像（図6b、c）で確認。カルシウム源変更が生成物形態に有意影響与えないことが示されました。また選択領域電子回折（SAED）で離散SAEDスポット観察（図6d）、高結晶性マイクロスフェア取得実証。EDSマッピングでCa、P、O元素均一分布（図6e）。EDSスペクトルもCa、P、O元素存在確認（図6f）、調製マイクロスフェアがリン酸カルシウムであること示唆。

マイクロスフェアのHEL吸着と吸着メカニズム

図7に示す通り、2種マイクロスフェア吸着容量は初期HEL濃度増加とともに増加。初期HEL濃度6.5 mg/mLでATP-CGマイクロスフェア吸着容量が飽和、最大吸着容量約332±36 mg/g（図7a）、ATP-CLマイクロスフェア（176±33 mg/g、6 mg/mL、図7b）の約2倍。

HEL吸着結果はFTIRスペクトルとTG曲線でさらに支持。図8a、bに示す通り、HEL吸着マイクロスフェアで1134 cm⁻¹（1139 cm⁻¹）と563 cm⁻¹（568 cm⁻¹）のACP由来PO₄³⁻イオン特性ピーク、1039 cm⁻¹（1040 cm⁻¹）のHAp由来PO₄³⁻イオン特性ピーク観察、HEL導入がマイクロスフェア構造に有意な変化与えないこと示唆。1542 cm⁻¹と1545 cm⁻¹のアミド基由来吸着ピークがHEL吸着マイクロスフェアで観察、HELがマイクロスフェア上に成功吸着確認。また2966、2962、2935、2927 cm⁻¹のHEL由来–CH₃と–CH₂基吸収バンドもHEL吸着マイクロスフェアで検出、HEL存在さらに検証。TGA曲線でATP-CGマイクロスフェアのHEL吸着前後重量減少は11.3%と36.7%（図8c）。したがってATP-CGマイクロスフェアHEL吸着容量約340 mg/g。一方ATP-CLはHEL吸着前21.1%重量減少、吸着後37%（図8d）。したがってATP-CLマイクロスフェアHEL吸着容量189 mg/g。TGA結果は図7結果と近似。

2種マイクロスフェア吸着容量差原因を調査するため、マイクロスフェア平衡吸着データをD-R等温線モデルで解析。フィッティング曲線を図9、フィッティングパラメータを表1に示します。フィッティング結果からATP-CG相関係数がATP-CLより高く、D-RモデルがATP-CGマイクロスフェア薬物吸着挙動記述に適していること示唆。E値が8 kJ/mol未満のため、HELのATP-CGマイクロスフェアへの吸着は物理吸着。ATP-CGマイクロスフェアHEL最大吸着容量（Qm）は381 mg/g近くに達し、図7a結果と近似。

HELのATP-CGマイクロスフェア吸着が物理吸着であるため、マイクロスフェア表面電位を調査。図10aに示す通り、超純水中でのATP-CG、ATP-CLマイクロスフェアとHELのゼータ電位はそれぞれ−17 mV、−22 mV、20 mV。HEL吸着後、ATP-CGとATP-CLマイクロスフェアゼータ電位はそれぞれ2.7 mV、1.5 mVに変化、HEL分子がマイクロスフェア表面へ静電気的引力で吸着すること示唆。しかしマイクロスフェア間ゼータ電位値（−17 mVと−22 mV）に有意差なく、静電気的引力が吸着容量差の主因ではないと判断。

したがってマイクロスフェア間吸着容量差理由をさらに解明するため、比表面積を調査。図11aに示す通り、ATP-CGマイクロスフェアBET比表面積（SBET）は143 m²/gで、ATP-CLマイクロスフェア（55 m²/g、表2）約3倍。比表面積が吸着容量差に寄与することがわかります。ATP-CGマイクロスフェアの高比表面積は主に低結晶性に起因[31]。図11bよりATP-CGマイクロスフェアがATP-CLマイクロスフェアより低結晶性。ATP-CGとATP-CL結晶性差は主に合成条件差に起因。一般に一定圧力・温度下で反応物加水分解程度進行とともに生成物結晶性上昇。グルコン酸（pKa=3.39）酸性度が乳酸（pKa=3.86）より高いため、加水分解速度低下し最終的に低結晶性呈示。結果としてカルシウム源変更で高比表面積ATP-CGマイクロスフェア取得。

結論

ATP-CG卵黄-殻マイクロスフェアを、ATPを有機リン源、CGを有機カルシウム源としマイクロ波水熱法で設計。マイクロスフェアは高比表面積と高吸着能力を示しました。Ca/P、水熱温度、時間がマイクロスフェア形態と構造に与える影響も調査。有機リン源と有機カルシウム源が卵黄-殻構造マイクロスフェア形成に有意な影響与えること示唆。さらに水熱条件（Ca/P、水熱時間、温度）が卵黄-殻マイクロスフェア形成に関与。異なるカルシウム源で合成した2種マイクロスフェアのHEL吸着挙動比較により、比表面積と表面電位など表面化学特性がマイクロスフェア吸着容量に影響する2大要因であること判明。