GAL-GNR-siBRAFナノシステム：標的BRAF遺伝子沈黙と光熱療法の融合で肝癌増殖を阻止

要旨

肝臓がんは世界で最も一般的な悪性腫瘍の一つである。RAFキナーゼ阻害剤は肝細胞がん（HCC）治療に有効であり、BRAF/MEK/ERK経路の阻害は新たなHCC治療戦略となっている。しかし、腫瘍への標的特異的送達システムは依然として臨床応用の大きな障壁である。ガラクトース（GAL）は、肝がん細胞で高発現するアシアロ糖タンパク受容体（ASGPR）を標的とする。本研究では、肝がん標的モエティとしてのGAL、近赤外光下で光熱能力を発揮する金ナノロッド（GNR）、BRAFを特異的に沈黙させるsiRNA（siBRAF）の3部構成からなる新規多機能ナノ材料GAL-GNR-siBRAFを設計した。ナノキャリアGAL-GNR-siBRAFは高いsiRNA担持能を示し、血清中でのsiRNA分解を抑制した。裸GNRと比較して、GAL-GNR-siBRAFは低生物毒性と高い遺伝子沈黙効率を示した。GAL-GNR-siBRAF処理はBRAF発現を有意に低下させ、肝がん細胞の増殖、遊走、浸潤を阻害した。さらに、GAL-GNR-siBRAFによる光熱効果とBRAFノックダウンの併用が、腫瘍細胞死を効果的に誘導した。したがって、本研究では肝臓がん治療のための新型標的多機能ナノ材料GAL-GNR-siBRAFを開発し、新たな臨床治療法開発への指針を提供する。

序論

肝細胞がん（HCC）は主要なグローバルヘルス問題である[1]。世界で6番目に多いがんであり、がん関連死の第3位を占める[2, 3]。大半のHCCは東アジアとサハラ以南アフリカで発生するが、フランス、英国、日本、米国など一部の先進国でも発生率が上昇している[4]。早期HCCの標準治療は腫瘍の外科的切除であり、手術後の5年生存率は89-93%に達する[5]。残念ながら、HCC患者のわずか20-30%のみが早期診断され、70%以上が進行期に発見され手術適応外となる。他の治療選択肢には肝移植、経カテーテル動脈化学塞栓療法（TACE）、全身化学療法がある[6]。しかし、肝移植はドナー不足に限定され、不完全なTACE塞栓は治療失敗を招き、全身化学療法は副作用が大きく予後不良である。したがって、HCCの新規治療法が強く求められている[7]。

RAS/RAFシグナル伝達経路は肝がん発症に必須の役割を果たし、BRAFはこの経路の主要ながん関連遺伝子の一つである。これらの遺伝子の遺伝的変異は二段階のカスケード障害を引き起こすことが多い。RAS/RAF経路の異常活性化はがん患者の不良予後と関連する[8]。BRAFはRAFファミリーで最も頻繁に変異する遺伝子であり、RAS/RAF経路を標的とすることはHCC治療の新戦略となっている[8-10]。RAFキナーゼ阻害剤ソラフェニブがHCC治療に有用であることから、BRAF変異はHCC治療の優先標的となった[8]。より具体的には、ソラフェニブの臨床開発がアジア、ヨーロッパ、米国でHCC治療に見出されたため、BRAF変異は進行HCC治療の望ましい標的となっている[11]。プラセボと比較して、ソラフェニブは進行HCC患者の全生存期間を延長した[12-14]。しかし、ソラフェニブは腫瘍標的能が乏しく、高血圧、脱毛、吐き気などの副作用を引き起こす[15]。高特異性で肝がんを標的としRAFを遮断する薬剤の更なる探索が必要である。

アシアロ糖タンパク受容体（ASGPR）、別名肝ガラクトース受容体は、肝実質細胞の血管内皮表面に発現するC型レクチンである[16]。ASGPRは、末端ガラクトース残基を持つ物質の結合、取り込み、排泄に重要な役割を果たすため、肝標的ナノ構造の必須ターゲットと見なされている[17]。複数の単糖（ガラクトース、マンノース、ラクトース、N-アセチルガラクトサミン、シアル酸）がASGPRと様々な程度で相互作用することが報告されており、ガラクトースが最も高い親和性を示す[18]。ASGPRは肝実質細胞表面に強く露出しているため[19]、この受容体はガラクトースおよびガラクトース修飾プロドラッグや送達システムに強い親和性を持ち、肝臓を標的とする。ガラクトースナノ粒子[20]、ガラクトースミセル[21]、ガラクトースリポソーム[22]は、肝細胞がん細胞に特異的に標的とする肝標的薬物送達系として同定されている。

金ナノロッド（GNR）はロッド状金ナノ粒子であり、ナノキャリアとして顕著な利点を持つ[23]。GNRは優れた生体適合性を持ち、siRNAの安定送達に利用可能[24]；大きな比表面積を有し、特定の腫瘍標的アダプターの柔軟な修飾が可能[25]；局在表面プラズモン共鳴（LSPR）が近赤外光照射下で高い光熱変換効率を示し、優れた光熱抗腫瘍材料となる[26]。GNRのアスペクト比を調整することで最大光熱効率が得られる。金ナノ粒子の体内外毒性はそのサイズ、表面電荷、表面修飾に依存する[27]。しかし、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）はGNR合成に不可欠な活性剤であり、明確な細胞毒性を持ち生物学的応用を制限している[28]。

RNA干渉（RNAi）は、低分子干渉RNA（siRNA）により標的遺伝子を効果的にノックアウトまたは沈黙させるため、がん治療の有望なアプローチとなっている[29]。近年、siRNA分子はヒト試験段階に入り、複数の変異遺伝子がんや腫瘍治療の有望な方法と見なされている[30]。しかし、siRNA応用には血清不安定性（細胞外環境でのヌクレアーゼによる分解）やオフターゲット効果など、依然として大きな課題がある[31]。さらに、siRNAは負に帯電しており、負に帯電した細胞膜との結合を阻害する[32]。これらの特性により、siRNA自体を直接細胞に送達することは困難である。siRNAの安定性は、siRNAの化学修飾や、保護キャリア材料へのsiRNAローダー挿入により向上可能[33]。

本研究では、新規多機能ナノキャリアGAL-GNR-siBRAFを新たに構築した。本システムは、光熱発生能を持つ金ナノロッドを内核とし、外部に肝腫瘍特異的標的能を持つGAL（D-ガラクトース）を修飾した。このシステムは、GNR表面のCTABによる生物学的毒性を低減し、高いsiRNA担持能を示し、肝臓がんにおけるBRAF遺伝子を効果的に沈黙させることができる。GAL-GNR-siBRAFの適用により、肝がん細胞の増殖、浸潤、遊走が有意に抑制された。さらに、GAL-GNR-siBRAFはBRAF遺伝子沈黙と光熱効果を同時に誘導し、腫瘍細胞殺傷能において相乗効果を達成し、肝臓がん臨床治療の新たな思考を提供する。

材料と方法

細胞株

マウス肝細胞がん細胞株Hepa1-6を中国科学院幹細胞バンクから購入した。細胞は10% FBS含有DMEM培地（Life Technologies、Carlsbad、CA）で、37℃、5% CO₂条件下で培養した。

BRAF siRNAの合成

BRAF遺伝子を標的とするsiRNA配列は5'-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3'であり、Dharmacon社（Lafayette、CO、USA）で合成した。市販のルシフェラーゼ遺伝子標的siGL2をネガティブコントロールsiRNAとして用いた。

CTAB-GNRの合成

水溶性金ナノロッドを種媒介成長法で合成した[34]。種溶液は以下のように調製した：セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）（0.2 M）1 mLとHAuCl₄（0.5 mM）1 mLを穏やかに混合し、28℃で撹拌し、冷却したNaBH₄（0.01 M）0.12 mLを添加して種溶液が褐色になるまで混合し、保存した。成長溶液は以下のように調製した：CTAB（0.2 M）50 mL、HAuCl₄（1 mM）50 mL、AgNO₃（4 mM）2.5 mLを28℃で穏やかに混合し、アスコルビン酸（0.079 M）670 μLを添加して溶液の色が暗黄色から無色に変わるまで混合した。種溶液120 μLを28℃で穏やかな撹拌下で添加し、色が紫から紫黒色を経て徐々に透明になった。定温で24時間撹拌後、12,000 rpmで10分遠心分離し余分なCTABを除去し、真空凍結乾燥してGNR粉末を得た。

MUA-PEIおよびGAL-PEI-MUAの合成

メルカプトウンデカン酸（MUA；654 mg）をクロロホルム（CHCl₃）30 mLに溶解し、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）100 mmolとN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）100 mmolを室温で15分反応させた。次にポリエチレンイミン（PEI）100 mmolを添加し、室温で24時間反応後、同量の脱イオン水で水溶性PEI-MUAを抽出した。同様の方法で水溶液中のD-ガラクトースを活性化し、活性化D-ガラクトース（500 mmol）を過剰に水溶性PEI-MUA溶液に添加し、室温で24時間十分反応させて水溶性GAL-PEI-MUA複合体を得た。

GAL-PEI-MUA-GNR（GAL-GNR）およびPEI-MUA-GNR（PEI-GNR）の合成

凍結乾燥CTAB-GNR粉末（10 mg）を水溶性PEI-MUAまたはGAL-PEI-MUA複合体10 mLに懸濁し、室温で24時間撹拌してCTABをAu-S結合で置換した。溶液を12,000 rpmで15分遠心分離し上清を除去し、沈殿を蒸留水で3回洗浄した。PEI-GNRまたはGAL-GNR粉末を凍結乾燥し、秤量後リボヌクレアーゼフリー水に溶解し、多機能酵素アナライザー（Spectra Max M5e、MD、USA）でプラズモン共鳴効果を観察した。

透過型電子顕微鏡観察

GNRまたはGAL-GNRを蒸留水に懸濁し、銅グリッド上に滴下した。銅メッシュ上の試料を空気中で30分十分乾燥後、透過型電子顕微鏡（LIBRA 120、Carl Zeiss、Germany）で撮像した。

紫外-可視吸収分析

GNR、PEI-GNR、またはGAL-GNRを蒸留水に懸濁し、多機能マイクロプレートリーダー（SpectraMax M5e、MD、USA）で600-900 nm波長域のナノ材料の表面プラズモン共鳴効果を測定した。

ゼータ電位と動的直径分析

GNR、PEI-GNR、またはGAL-GNRを蒸留水に懸濁し、Zetasizer Nano ZSでナノ材料のゼータ電位と動的直径を測定した。

核磁気共鳴分析

GAL-GNR凍結乾燥粉末を重水（99%、Sigma）に溶解して均一懸濁液を作り、NMR試料管に移した。核磁気共鳴（NMR、Bruker、600 MHz、Germany）でGAL-GNRの組成を決定した。

ゲルシフトアッセイ

GAL-GNRとsiBRAFを質量比（0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1）で混合し、室温で30分インキュベート後、DNAローディングバッファーを添加した。全試料を0.01% Goldview（Bioshop、USA）含有2%アガロースゲルに載せ、90 Vで30分電気泳動した。siBRAFの包接度をゲルイメージングシステムで可視化した。

血清中でのsiRNA安定性

GAL-GNR-siBRAF混合物（6:1）を新鮮マウス血清中で37℃、0、3、6、12、24、48時間インキュベートした。裸siBRAF+新鮮マウス血清群も同条件で処理した。GAL-GNR-siBRAF溶液に同体積の2%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を添加し、室温で30分インキュベート後、DNAローディングバッファーを添加し、0.02% Goldview（Bioshop、USA）含有2%アガロースゲルで90 V、30分電気泳動した。siBRAFのバンド輝度をゲルイメージングシステムで可視化した。

GAL-GNR-siBRAFの競合阻害アッセイ

2 × 10⁵ Hepa1-6細胞を12ウェルプレートで一晩培養し、ラクトビオン酸で12時間前処理後、GAL-GNR-siBRAF（Cy3標識）で30分トランスフェクションした。細胞内蛍光強度を蛍光顕微鏡で測定した（スケールバー=200 μm）。

GAL-GNR-siBRAFの肝がん標的送達能

1 μgのCy3標識siBRAFを、PEI-GNR（30 μg/mL）およびGAL-GNR（30 μg/mL）と室温で20分インキュベート後、Hepa1-6細胞培地に添加した。30分インキュベート後、50% FBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡下で細胞内蛍光強度を測定した。

光熱効果

20、40、60、80、100 μgのGAL-GNRおよび100 μgのGNR凍結乾燥粉末をそれぞれ1 mL蒸留水に完全溶解し、24ウェルプレートに分注した。803 nm近赤外レーザー（2 W/cm²）で15分連続照射し、温度を赤外線温度計で最初の5分間は0.5分ごと、その後1分ごとに記録した。

MTTアッセイ

200 μLの細胞懸濁液（3.5 × 10⁴/mL）を96ウェルプレートで24時間培養後、GNRまたはGAL-GNR（0、15、30、45、60、75、90、105、120 μg/mL）を添加して培養した。24または48時間インキュベート後、20 μL MTTを添加しさらに4時間インキュベートした。紫色結晶を150 μL DMSOで溶解し、マイクロプレートリーダー（SpectraMax M5e、MD、USA）で490 nm（参照650 nm）で分光光度測定した。

Calcein-AMとPI染色試験

Hepa1-6細胞（1.5 × 10⁵）を12ウェルプレートで一晩培養し、PBS、レーザー、GAL-GNR-siBRAF（30 μg/mL:1 μg）、GAL-GNR-siGL2（30 μg/mL:1 μg）+レーザー、またはGAL-GNR-siBRAF（30 μg/mL:1 μg）+レーザーで4時間処理後、近赤外光（808 nm、2 W/cm²）で15分照射した。GAL-GNRの細胞毒性を、Calcein-AM（生細胞）とPI（死細胞）染色実験で検出した。Calcein-AMの緑色蛍光とPIの赤色蛍光を蛍光顕微鏡で撮影した。

リアルタイム定量PCR

Trizol（Trizol試薬、Invitrogen）で全細胞RNAを抽出し、cDNA合成の鋳型とした。遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマー（各0.5 μL × 10 μM）を用いて、Stratagene Mx3000P qRT-PCRシステム（Agilent Technologies、Lexington、MA、USA）でqPCRを実施した。SYBR Green PCR MasterMix（Life Technologies）を製造元プロトコルに従って使用した。ハウスキーピング遺伝子β-actinを内部標準とした。プライマー配列：β-actin：5'-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3'（フォワード）、5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3'（リバース）；BRAF：5'-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3'（フォワード）、5'-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3'（リバース）。遺伝子発現差は2^−ΔΔCt法で算出・表示した。

ウェスタンブロット

Hepa1-6細胞の全タンパク質をRIPAバッファー（Cell signaling、Pickering、Ontario、Canada）で抽出し、ビシンコニン酸（BCA）法で定量した。タンパク質を12% SDS-PAGEで分離し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写した。ハウスキーピング遺伝子β-actinを内部標準としてBRAFタンパク質発現を検出し、標的タンパク質バンドと内部標準をECL化学発光法で検出した。

スクラッチテスト

トランスフェクション済みHepa1-6細胞（1.7 × 10⁵/mL）を12ウェルプレートで一晩播種し、完全接着した細胞層を10 μLピペットチップで掻爬した。PBSで2回洗浄後、2% FBS含有培地に置換し、0、24、48時間後の平均創傷幅を顕微鏡で観察した。各スクラッチテストは3回繰り返し実施した。

トランスウェルアッセイによる遊走と浸潤評価

8 μmポアサイズのトランスウェルチャンバー（Corning Life Science）を用いて細胞遊走と浸潤を評価した。Hepa1-6細胞を無血清培地200 μLに懸濁し、上チャンバーに1.7 × 10⁵ cells/wellの密度で播種し、下チャンバーに12% FBS含有培地500 μLを添加した。24-48時間インキュベート後、4%パラホルムアルデヒド溶液で30分固定し、1%クリスタルバイオレット溶液で30分染色した。最後に倒立顕微鏡下で撮影・計数した。細胞浸潤アッセイではECMゲルコーティングが必要で、その他の手順は同一である。

統計解析

全実験を3回繰り返し実施した。データを平均±SDで表し、2群間比較にStudentのt検定（両側）、多群比較に一元配置分散分析（ANOVA）を用いた。p < 0.05を統計的有意差とした（*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001）。

結果

ナノキャリアGAL-GNR-siBRAFの合成とキャラクタリゼーション

siRNAを肝細胞へ送達しつつ金ナノロッドの光熱効果を維持できる新規ナノキャリアGAL-GNRを設計した。GAL-GNRの合成手順をスキーム1に示す。この肝標的システムは3つの機能成分を含む。第一に、GAL-GNRの基盤はGNR骨格であり、TEM像（図1a）で約30 nm長、10 nm径であることが確認された。化学修飾されたGNR（GAL-GNR）は寸法変化がなく、良好な分散性を保持した（図1b）。粒子径データでは、GNRの平均サイズは30.23 nmで電子顕微鏡結果と一致し、GAL-GNR（50 nm）とPEI-GNR（42.35 nm）はGALとPEIの結合による粒子間水和増大でGNRより大きかった（図1c）。第二に、GNR表面の生物学的毒性を持つCTABを、負電荷siRNAと結合可能な正電荷MUA-PEIで置換した。ゼータ電位測定では、GNR表面電荷がPEI修飾で35.6から42.7 mV、GAL-PEI修飾で41.8 mVに上昇し、GAL-GNRがsiRNAと強く結合する能力を持つことを示した（図1d）。第三に、ガイド分子としてGALをGNRナノキャリアに結合させ、肝細胞がんへの特異的ホーミングを可能にした。UV-Vis吸収分光法で修飾GNRの構造を予備的に検出した。未修飾GNRの初期吸収ピーク波長は763 nmであり、MUA-PEI修飾で最初に7 nm、最終的なGAL修飾完了時にさらに8 nmの波長シフトが観察された（図1e）。ナノシステム内のGALを確認するため、NMRで化学基を分析した。結果は、NMR水素スペクトル上でガラクトースのHシグナル（δ: 3.60、3.65、3.70、3.78、3.90、4.53）がGAL-GNRスペクトルのみに見られ、GALの化学構造を確認し、GALがGNR表面に成功裏に結合したことを示した（図1f）。

GAL-GNRのsiRNA包接能と安定性

GAL-GNRナノ骨格は正電荷PEIで修飾され、静電相互作用で負電荷siRNAと結合可能である。ゲルシフトアッセイでGAL-GNRのsiRNA結合能を評価した。フリーsiRNAはゲル通路を移動するが、結合siRNAは遅延または完全に停止する。また、結合siRNAはブロマイドと効果的に結合しなくなるため、蛍光強度が低下する。ゲル電気泳動結果、GAL-GNRをsiBRAFで飽和させる最適比は6:1（w/w）であった（図2a）。

裸siRNAは特に生体内で極めて分解されやすい。送達システムの重要な機能は、siRNAを分解から保護することである。したがって、ナノキャリアGAL-GNRの新鮮血清中でのsiRNA保護効果を検証した。裸siRNAと比較して、結合siRNAは血清中でより長期間存在可能であった。図2bに示すように、裸siRNAは血清中で最大12時間まで存在可能だったが、結合siRNAは48時間後でも豊富に残存していた。この結果は、GAL-GNRが血清中でのsiRNA分解を効果的に防ぎ、生体内標的送達を保証することを示している。

ナノ材料の細胞毒性

低生物毒性は、ナノ材料ががん治療に用いられる上で重要な特性である。この新規GAL-GNRナノ構造の生体適合性を評価するため、細胞毒性を検証した。図3に示すように、未修飾GNR処理群では低濃度30 μg/mLでHepa1-6死細胞が初期観察された。75 μg/mL GNRで24時間インキュベート後、細胞死率は56.09%に達し、48時間では75.5%に増加した。対照的に、GAL修飾により細胞毒性が有意に低減した。GAL-GNRを48時間インキュベートした場合、高濃度（105 μg/mL）でも80%以上の細胞が生存した。これらのデータは、ナノキャリアGAL-GNRがGNRと比較して高い生体適合性を持ち、応用の安全性を保証することを示唆している。

肝腫瘍細胞へのsiRNA標的送達とBRAF遺伝子沈黙（インビトロ）

がん細胞へのsiRNA送達能はナノ材料の最も重要な機能の一つである。GAL-GNRのsiRNA送達可能性を調べるため、Hepa1-6細胞でGAL-GNR担持siBRAFの遺伝子沈黙効果を検証した。ブランク群と比較して、GAL-GNR-siGL2（ネガティブコントロール）トランスフェクション細胞ではBRAF発現に変化がなかったが、GAL-GNR-siBRAFトランスフェクション細胞では有意な減少が見られた（図4a）。さらに、沈黙効果は用量依存的であり、GAL-GNR濃度増加と相関した。qPCR結果では、GAL-GNR-siBRAFの理想的トランスフェクション濃度は30 μg/mLで、沈黙効率は90.29%に達し、リポフェクタミン2000（ポジティブコントロール）群と類似していた。ウェスタンブロット結果もqPCRと一致し、48時間トランスフェクション後BRAFタンパク質発現がダウンレギュレートされていた（図4b）。

ラクトビオン酸はGALと構造が類似し、肝細胞がん細胞膜表面に発現するASGPRと競合結合可能である[35]。GAL-GNRの特異的標的効率を確認するため、Hepa1-6細胞をラクトビオン酸で前処理後、GAL-GNR-siBRAFでトランスフェクションした。未処理細胞をブランクコントロール、古典的トランスフェクション試薬リポフェクタミン2000をポジティブコントロールとした。図4cに示すように、GAL-GNRトランスフェクション細胞の赤色蛍光強度はポジティブコントロール群と類似していたが、PEI-GNRトランスフェクション細胞では有意に減少していた。一方、GAL-GNR-siBRAF単独トランスフェクション細胞では、ラクトビオン酸前処理Hepa1-6細胞よりも強いCy3赤色蛍光が観察された（図4c）、qPCR結果も赤色蛍光結果と一致した（図4d）。これらの結果は、GALがHepa1-6細胞によるsiRNAエンドサイトーシスを効果的に促進し、HCC標的モエティとして適用可能であることをさらに裏付けている。

GAL-GNR-siBRAFがHepa1-6細胞の増殖、遊走、浸潤に及ぼす影響

BRAFはMAPK経路で重要な役割を果たし、細胞増殖、遊走、浸潤を制御している[36]。GAL-GNR-siBRAFが肝細胞がん細胞に及ぼす影響を評価するため、まずMTTアッセイで細胞増殖を解析した。図5aに示すように、GAL-GNR-siBRAFトランスフェクションHepa1-6細胞の増殖は、GAL-GNR-siGL2（ネガティブコントロール）またはPBS処理細胞と比較して有意に減少した。次に、スクラッチテストとトランスウェルアッセイで遊走への影響を調べた。ネガティブコントロール細胞と比較して、GAL-GNR-siBRAFトランスフェクションHepa1-6細胞の遊走能は明確に低下した（図5b-d）。

浸潤への影響をさらに調べるためトランスウェルアッセイを実施した。結果、GAL-GNR-siBRAFトランスフェクションHepa1-6細胞では、GAL-GNR-siGL2またはPBSと比較して浸潤能が有意に低下した（図5e、f）。以上の結果は、GAL-GNR-siBRAF複合体によるBRAF遺伝子ノックダウンが、肝細胞がん細胞の遊走と浸潤を効果的に抑制できることを示唆している。

GAL-GNR-siBRAFによる光熱効果と遺伝子沈黙の併用治療

先行研究で、金ナノ材料が近赤外放射下で熱エネルギーを生成することを実証している[37]；この現象はGNRのLSPR特性による光熱効果と呼ばれる。本結果では、GAL-GNR濃度増加に伴い発熱能が増強された。GAL-GNR濃度100 μg/mLで、温度が24℃から60℃以上に急上昇した。また、GNRとGAL-GNRの発熱能に有意差はなかった（図6a）。

新規ナノシステムGAL-GNR-siBRAFは、肝がん特異的標的化、siRNAベースのBRAF遺伝子沈黙、GNR由来光熱効果の3つの個別特性を持つ。したがって、抗腫瘍治療におけるGAL-GNR-siBRAFの相乗治療効果をさらに検討した。GAL-GNR非存在下のHepa1-6細胞は近赤外放射下でも高い生存率を維持し、レーザー自体は腫瘍細胞に有意な影響を与えないことを示した。GAL-GNR-siGL2処理をベースにレーザー照射を行うと、光熱効果がHepa1-6細胞に強力な殺傷能を示した。BRAF遺伝子沈黙単独でも細胞死を誘導したが、効果は限定的だった。ナノ材料GAL-GNR-siGL2とレーザー照射の併用治療は、BRAF遺伝子沈黙単独よりもはるかに強い細胞殺傷能を示した（図6b）。これらのデータは、BRAF遺伝子沈黙と光熱効果が相乗的に腫瘍細胞殺傷ポテンシャルを高めることを示している。

考察

腫瘍標的送達の困難さは、腫瘍臨床治療の主要な障壁である。本研究では、新規多機能ナノキャリアGAL-GNR-siBRAFを初めて開発し、多くの利点を示した。修飾GAL-GNRは優れた生体適合性を有するだけでなく、GNR骨格のLSPR現象を維持し、優れた光熱変換能を保持している。GAL修飾GNRはASGPRを介して肝細胞がん細胞へホーミング可能であり、肝細胞がんの標的分子療法に大きな可能性を秘めている。更なる研究で、BRAF遺伝子沈黙が肝腫瘍細胞の増殖、遊走、浸潤を抑制することを示した。特筆すべきは、GAL-GNR-siBRAFが光熱効果とBRAF遺伝子沈黙の併用で、より強い細胞殺傷能を示すことである。

RNA干渉（RNAi）は遺伝子発現と制御における重要な役割から注目されてきた。がん細胞でシーケンス特異的遺伝子をsiRNAでノックダウンする遺伝子治療は効果的かつ特異的な標的遺伝子治療であり、がんを含む多くの疾患の新たな治療ツールとなっている[29, 31]。しかし、血清中での低安定性と細胞取り込み効率の低さが、siRNAの臨床応用を制限している[38]。一方、siRNAは負電荷を持つため負電荷細胞膜との結合を阻害し、siRNA自体を直接細胞内へ送達することは困難である[32, 39]。さらに、siRNA治療には低トランスフェクション効率と細胞内取り込み不良の問題がある[40]。これらの障壁が標的細胞へのsiRNA送達を阻害している。siRNA安定性を高め遺伝子沈黙効率を強化するため、3成分を含む新規ナノキャリアGAL-GNR-siBRAFを合成した（スキーム1）。このナノキャリアは分子サイズが小さい（約30 nm長、10 nm径）且つ良好な分散性を有する（図1）。また、GAL-GNR-siBRAFは低濃度で大量のsiRNAを効果的に担持可能（図2a）であり、血清中のRNaseからsiRNA分解を保護し、37℃新鮮マウス血清中で少なくとも2日間の安定性が確認された（図2b）。

優れた生体適合性は、生物療法分野で用いられるナノ材料に不可欠である。CTABは金ナノロッド合成に不可欠な試薬だが、明確な細胞毒性により生物学的応用を制限している[41]。材料の細胞毒性を低減するため、正電荷PEIと標的アダプターGAL（D-ガラクトース）でGNRを外部修飾した。結果、未機能化GNRと比較してGAL修飾GNRはより良い生体適合性を示した。GAL-GNRの高濃度（105 μg/mL）で48時間処理後も細胞生存率は80%以上を維持した（図3）。さらに、ナノロッドの小さな分子サイズと円筒形状が細胞膜透過と細胞内進入を促進する[37, 38, 42]。この現象はがん細胞標的療法で特に顕著である。ガラクトース標的モエティで修飾されたナノ構造は、腫瘍細胞へのGAL-GNR-siBRAF高蓄積をもたらし、BRAF遺伝子発現の効果的なダウンレギュレーションを誘導した（図4）。また、競合阻害実験により、GAL-GNRがHepa1-6細胞のASGPR表面受容体を主経路として細胞内へ取り込まれることが判明した（図4c）。

BRAFとRAF1の高発現を持つHCCは急速な増殖と成長傾向があると報告されている[41, 43, 44]。B-RafとRaf1は主にERK/MAPK経路の下流で作用し、カスケード増幅により核因子を制御する。この経路の活性化はHCC細胞の異常な増殖と分化を加速する[41, 44, 45]。RAF遺伝子はマトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）発現を促進し、腫瘍細胞接着を変化させ、細胞外マトリックス（ECM）と基底膜を分解し、腫瘍浸潤と転移を促進する[44, 45]。BRAFキナーゼはRAS-RAF-MEK-ERK経路を制御し、腫瘍細胞増殖、浸潤、転移を促進し、アポトーシスによる細胞死を許容する[5, 46, 47]。先行研究でBRAF遺伝子がHepa1-6細胞で高発現していることを確認した（データ未提示）。Hepa1-6でのBRAF発現ノックダウンがRAS-RAF-MEK-ERK経路を遮断し、生物学的変化をもたらすと推測した。この仮説を検証するため、GAL-GNR-siBRAFで肝細胞がん細胞をトランスフェクションし、細胞増殖、遊走、浸潤が有意に抑制されることを確認した（図5）、肝細胞がん臨床治療の新戦略を提供する。

GNRのもう一つの重要な利点は、局在表面プラズモン共鳴（LSPR）を持ち、近赤外光照射下で吸収光エネルギーを熱エネルギーに変換し、細胞を殺傷・破壊できることである[42]。GAL-GNRの光-熱変換能を検証した結果、修飾GAL-GNRが近赤外光照射下で効果的に熱エネルギーを誘導することを確認した（図6a）。次に、GAL-GNR-siBRAFの相乗効果をさらに調査した。BRAF遺伝子沈黙は限定的な細胞毒性しか示さなかったが、GAL-GNR-siGL2+レーザー治療は腫瘍細胞により強い殺傷能を示した。同時に、光熱療法とBRAF遺伝子沈黙の併用で85%以上の細胞死を誘導できた（図6b）、これはGAL-GNR-siBRAFと光熱効果の相乗が肝臓がん抑制の理想的戦略となり得ることを示している。

結論

本研究は、GAL-GNR-siBRAFがsiRNA分解の障壁を克服し、インビトロで血清中siRNA安定性を効果的に向上させることを示した。さらに、GAL-GNR-siBRAFは肝細胞がん細胞へsiRNAを標的送達し、BRAF発現をノックダウンし、細胞増殖、浸潤、遊走を有意に抑制した。より重要なことに、GAL-GNR-siBRAFは新規多機能ナノキャリアとして、近赤外光と併用することで腫瘍細胞殺傷能を大幅に向上させる。結論として、GAL-GNR-siBRAFは肝細胞がん治療に大きな可能性を秘め、肝臓がん臨床応用への新たな指針を提供する。