超薄膜パラジウムナノザイム：精密触媒のための光活性化ペルオキシダーゼ模倣

概要

光活性化ナノザイムは、化学産業とバイオテクノロジーに豊富な新機会を提供できます。しかし、現在のリモート制御触媒システムはまだ満足のいくものではありません。ここでは、超薄膜Pdナノシート（Pd NSs）を光制御可能なペルオキシダーゼ模倣として適用する興味深い例を提示します。厚さ1.1 nmのPd NSsは、ほとんどのPd原子が表面に露出しているため、高いペルオキシダーゼ様活性を持ちます。さらに重要なことに、光励起下ではこの固有活性がさらに2.4〜3.2倍活性化されます。この現象は、超薄膜Pd NSsの独自の光学特性、すなわち表面プラズモン共鳴（SPR）効果により光子を効率的に捕獲してホット電子を生成し、H₂O₂のその場分解を促進して反応性酸素種ラジカル（O*）を生成することに起因します。この強化触媒は、H₂O₂のリアルタイムかつ高感度な比色検出にも利用できます。本研究が、医療診断、薬物送達、環境化学における制御可能で効率的な活性を持つ人工ナノザイムの合理的設計への貴重な知見を提供することを期待します。

はじめに

天然酵素は、生命のほぼすべての化学変換を触媒できる精巧な生体触媒です[1, 2]。しかし、安定性が低くコストが高いなどの固有の欠点も存在します。磁性酸化鉄ナノ粒子が固有のペルオキシダーゼ模倣活性を持つことが初めて報告されて以来[3]、酵素様活性を持つナノ材料（ナノザイム）の設計開発は、ますます研究の注目を集めています[4]。これまで、酸化物系[5,6,7]、金属系[8,9,10]、炭素系ナノ材料[11,12,13]がホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）模倣に用いられてきました。中でも、銀（Ag）[15]、金（Au）[16, 17]、白金（Pt）[8]、パラジウム（Pd）[18, 19]などの貴金属ナノ材料[8, 14,15,16,17,18,19]が高いペルオキシダーゼ模倣活性を持つことが報告されています。一方、光を導入してナノザイム活性を活性化することも報告されており、バイオテクノロジーと化学産業に豊富な機会を提供します[4, 20]。しかし、現在のリモート制御触媒システムはまだ満足のいくものではありません。

プラズモニック金属ナノ材料は、表面プラズモン共鳴（SPR）という独自の光学特性により太陽光を捕獲または応答できます。SPR効果で光子を捕獲しホット電子を生成するこれらの金属ナノ材料は、触媒速度向上[21]、生体分子の新しい光学センシング[22]、光熱療法の設計、太陽光を再生可能エネルギーとして利用[23, 24]のための鍵材料となっています。しかし、それらのいずれもプラズモニック金属ベースナノザイムのSPR効果が酵素模倣活性に及ぼす影響に焦点を当てたものではありません。したがって、プラズモニック金属ベースナノザイムとSPR効果を組み合わせ、高活性で光調整可能な酵素触媒を達成することは魅力的です。

ここでは、厚さ約1.1 nmの超薄膜Pdナノシート（Pd NSs）が、優れた光制御可能なペルオキシダーゼ模倣として機能することを初めて報告します。Pdベースナノザイムと光制御ナノザイムシステムは、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼなど複数の酵素模倣活性を示すことが報告されています[4, 18, 19]。しかし、それらの構造は一般的に粒子、バルク、ロッドです。ご存知の通り、超薄膜Pd NSsは高い表面エネルギー、小さな側面サイズ、高い電子移動度を持ち、活性表面サイトの高密度化をもたらします[25]。また、超薄膜ナノシートに露出したほとんどの原子が、性能設計の理想的なプラットフォームとなります[26]。超薄膜ナノシートの独自構造に着想を得て、Pd原子の活性サイトを最大限に活用し、酵素触媒プロセスにホット電子を注入する戦略を提示します。スキーム1に示すように、光子と超薄膜Pd NSsの相互作用は表面プラズモン共鳴を励起し、これが非放射的に崩壊してホット電子と正孔を生成し、可視光下でH₂O₂をその場で還元分解し、酸素種ラジカル（O*）を生成してTMBを酸化します。酵素反応に可視光を導入することで、Pd NSsは暗条件下よりも著しく高い触媒活性を示します。

材料と実験

材料とキャラクタリゼーション

クエン酸（CA）、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）をSigma Aldrichから購入。アセチルアセトン酸Pd(II)、W(CO)₆、ポリビニルピロリドン（PVP）をMacklinから入手。過酸化水素（H₂O₂、30 wt%）を北京化学（北京、中国）から購入。すべての化学薬品を精製なしで使用。実験用水はMilliporeシステム（18.2 MΩ; Millipore Co., USA）で精製したものを全工程で使用。

生成物の相構造は、Cu Kα放射（λ = 1.5406 Å）を用いたPANalytical X線回折計で評価。試料のUV-vis拡散反射スペクトル（DRS）を室温でLambda 750（PerkinElmer）で測定。溶液中の触媒濃度はICP-AES（720、Agilent）で決定。透過電子顕微鏡（TEM）像をJEM1400 plus透過電子顕微鏡（100 kV）で記録。高分解能TEM（HRTEM）解析をJEM-2100F電界放出透過電子顕微鏡（FE-TEM、200 kV）で実施。

Pdナノシートの合成

報告された手法[27]に従い、Pd NSsを合成しました。簡単に言うと、アセチルアセトン酸Pd(II)（16 mg）、PVP（分子量24,000、30 mg）、CA（150 mg）、CTAB（60 mg）をDMF（10 mL）に混合し、窒素雰囲気下で1時間攪拌しました。フラスコ（25 mL）内の溶液色が均一なオレンジレッドに変わったとき、N₂雰囲気下でW(CO)₆（100 mg）を溶液に添加しました。次に、80℃で1時間加熱しました。反応後、暗青色生成物を遠心分離（9000 rpm/min、3分）でアセトンを十分量用いて分離し、エタノールに分散させました。このプロセスを3回繰り返しました。最終的に、Pdナノシートを10 mLエタノールに分散させ、さらなる実験に用いました。

光触媒ペルオキシダーゼ模倣測定

Pd NSsナノザイムのペルオキシダーゼ模倣活性は、TMB酸化測定で評価しました。300 Wキセノンランプ（CEL-HXF300/CEL-HXUV300、China education Au-light Co., Ltd.、北京）を光源とし、ガラスフィルターを追加して可視光（λ ≥ 400 nm）を透過させました。典型的実験では、12.6 μg/mL Pd NSsナノザイム（ICP-AES測定値）を、50 mM H₂O₂と0.7 mM TMBを含む1 mLリン酸緩衝液（0.1 M、pH 4）に室温で添加しました。照射下で異なる時間後、遠心分離後の特性吸収ピーク652 nmをモニタリングしてペルオキシダーゼ模倣活性を決定しました。これはTMB酸化生成物濃度を示します。対照実験は照明を除いて同条件で行いました。

結果と考察

Pd NSsナノザイムの設計とキャラクタリゼーション

典型的なパラジウムナノシート合成を古典的手法（図1a）で行い、固有の基質と光子捕獲、効率的なペルオキシダーゼ酵素模倣特性を持つ高活性原子サイトの超薄膜ナノザイムシリーズを構築しました。図1b-dに合成Pd NSsの典型的な低倍率透過電子顕微鏡（TEM）像を示します。約10.0 nmの側面寸法を持つ均一なナノシートで構成され（図1bインセット）、平均厚さ約1.1 nm（図1cインセット）です。サイズから、上面と下面の平坦表面の面積割合が90%以上を占めます。高分解能透過電子顕微鏡（HRTEM）でPd NSsの形態と相をさらに確認しました。図1gに、パラジウムの(111)面と(200)面に対応する約0.22 nmと0.256 nmの適切な面間隔を示します。実験ニーズに合わせ、市販カーボンに担持させてPd NSsのXRDパターンを測定しました。図1eに示すように、約40.11°、46.65°、68.12°の回折ピークは立方晶Pd NSsの(111)、(200)、(220)面に対応し、HRTEM観察と一致します。さらに、市販カーボンに関連するピーク以外に、他の結晶相を示すピークは観察されません。Pd 3dスペクトルは2ピーク（図1f）を示し、Pd 3d₅/₂とPd 3d₃/₂（スピン軌道分裂による）がそれぞれ335.5 eVと339.2 eVに位置し[25]、パラジウム原子に2つの化学環境があることを明らかにしました。

光触媒ペルオキシダーゼ模倣活性

Pd NSsのペルオキシダーゼ様活性を、典型的なペルオキシダーゼ基質であるTMBを用いて調べました。超薄膜ナノシート表面にほとんどのPd原子が露出しているため、超薄膜Pd NSsは活性表面サイトの高密度を持ち、優れた触媒活性を示すと推論されます。予想通り、H₂O₂と共存下でPd NSsは無色基質TMBを青色生成物oxTMBへ効率的に触媒酸化し、652 nmに特性吸収を示します（図2a、b）。しかし、H₂O₂添加なしでは同実験条件下でPd NSsの活性は無視でき、ペルオキシダーゼ様活性が反応中で重要な役割を果たすことがわかります。天然酵素や他のナノザイムと同様、PdナノザイムはpH、温度、濃度依存的なペルオキシダーゼ活性を持ちます（図2cと図S1）。実験条件下で、Pd NSsは弱酸性溶液で最適化された触媒活性を示し、温度を25〜75℃で変化させたとき35℃で反応溶液の特性吸光度ピークが最高になりました（図2c）。驚くべきことに、光照射ありとなしでペルオキシダーゼ模倣活性に有意な差が観察されました（図2dと図S2）。反応溶液の60分間吸収値によると、可視光下でのPd NSs活性は暗条件下の約2.4〜3.2倍高くなりました（図2dと図S2）。同様に、他のプラズモニック金属ナノ粒子への光導入もペルオキシダーゼ様活性を増加させます（図S3-S5)。これらのナノザイムを比較すると、Pd NSsが最も広い活性調整範囲を示しました。この現象は主に超薄膜ナノシートの独自構造によるものです。これらの結果から、可視光がすべてのプラズモニック金属ナノ材料のペルオキシダーゼ様活性に直接影響し、SPR効果が触媒プロセスで本質的役割を果たすと推測できます（図2e）。

Pdナノザイムの動力学的・メカニズム的調査

Pd NSsの酵素的挙動を特徴付けるため、反応の酵素動力学理論を決定しました。しかし、適切なTMB濃度範囲内で、Pd NSsは典型的なミカエリス・メンテン曲線を示します（図3a）。ミカエリス定数（Km）と最大反応速度（Vmax）は、ラインウィーバー・バーク方程式で求めました（表S1）。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）と比較すると、TMBに対するPd NSsの見かけKm値は0.28で弱められています（図3a、bと表S1）。この結果は、調製Pd NSsの超薄膜シート構造がTMBに高い親和性を示し、天然酵素HRPよりも高いことを示しています。

H₂O₂がPd NSsで分解され反応性酸素種を形成することは明らかですが、酸化機能を提供する種が何かを理解することが重要です。原則として、貴金属はH₂O₂を触媒分解して・OHや、低pH条件下では反応中間体O*を形成できます[28]、これらのいずれかが酵素模倣反応で酸化機能を提供する種となり得ます。Pd NSsの触媒メカニズムを理解するため、まずテレフタル酸（TA）/H₂O₂系で、Pd NSsのペルオキシダーゼ様特性が・OHラジカル生成に関連するかをテストしました（図4a）。TAを蛍光プローブとして用いると、2-ヒドロキシテレフタル酸と・OHの反応で高蛍光生成物が生成されます[29]。図4bに示すように、Pd NSs添加後に溶液の蛍光強度が有意に減少しました。この結果は、Pd NSs濃度増加に伴う蛍光強度減少（図S6）とよく一致します。これらの結果は、Pd NSsが・OHラジカルを生成するのではなく消費することを示しています。したがって、報告されているフェリチン-白金ナノ粒子の触媒挙動[30]と同様に、我々のPd NSsの触媒性能は・OHラジカル生成に依存しません。

Pd NSsの触媒メカニズムが光によるホット電子生成に関連するか調べるため、光触媒反応中の活性種ホット電子のトラッピング実験も探求しました（図4c）[31]。図4dから、0.3 mg/mL KBrO₃（電子クエンチャー）添加により、15分以内にPd NSsのTMB酸化触媒能力が有意に低下します。KBrO₃/反応系と純粋系のこの大きな差は、ホット電子の存在がTMB酸化にとって重要である可能性を示しています。これは、Pd NSsがSPR効果で500〜1000 nmスペクトル域に広い吸収ピークを持つ図S7の結果と一致します[25]。また、ホット電子がPd NSs表面から離れると、表面に対応する正孔が残ります。これらの正孔はエタノールを酸化してアセトアルデヒドを生成できるため、TMBに対しても強力な酸化能力を持つ可能性があります。予想通り、H₂O₂添加なしでも可視光照射下でより多くのoxTMBが生成されました。

次に、可視光下でのO₂活性化による反応性酸素種生成（スーパーオキシドO₂⁻を含む）をテストしました。このため、異なる雰囲気下で対照実験を行いました。図S8では、反応系を窒素と酸素でそれぞれ飽和導入しても、模倣酵素の触媒性能は有意に変化せず、Pd NSsの光触媒活性はO₂によってほとんど影響されません。Pd NSsの究極的性能は、可視光下で5分間で0.051 a.u./minに達し、暗条件下の3.2倍でした（図2d）。Pdナノザイムの可視光下での極めて高い活性は、Pd NSsのSPR効果によるホット電子存在が、フリーラジカルではなく反応中間体O*の形成を促進し、ペルオキシダーゼ様活性を説明するという仮説を導きます（図5a）[28]。簡潔に言えば、活性種トラッピング実験と通気実験が、Pd NSsの光触媒模倣酵素メカニズムを強力に支持します。

新しいリアルタイム高感度センサー

いくつかの研究で、光を外部エネルギー入力としてセンサーに導入することでセンサー性能が向上することが実証されています[22, 32, 33]。例えば、Lingら[32]は、10 at.% LaOCl-SnO₂センサーのO₂センシング特性が紫外線照射で著しく改善されることを発見しました。光のセンサーへの顕著な影響と、実験での可視光下におけるPd NSsの優れたペルオキシダーゼ模倣活性を考慮し、効果的で感度の高いH₂O₂比色センサーを構築しました。センサーのメカニズム（図5a）は、Pd NSsが大きな比表面積を活用して光子を捕獲し、大量のホット電子を生成することを示します。その後、ホット電子がH₂O₂分解を促進し反応中間体O*を生成、これがTMBを青色oxTMBへ酸化します。最終的に、H₂O₂の効率的検出が実現されます。

図5bインセットから、構築したH₂O₂センサーの線形範囲が10〜100 μM、検出限界が13.40 μM（LOD = 3s/k、sとkは8回並列対照測定の相対標準偏差と傾きの線形較正ブロック。本研究ではs = 2.97988×10⁻⁴、k = 6.67×10⁻⁵）と計算されました。したがって、Pd NSsベースのH₂O₂センサーは、光導入条件下で他の報告ナノ材料より優れていました。表S2から、同じ比色法でH₂O₂を検出する場合、本センサーは広い線形範囲を示します[34]。検出限界もFe系やCo系ペルオキシダーゼ模倣ベースの多くのセンサーより低くなっています（表S3）[35, 36]。最後に、H₂O₂とK⁺、グルコース、Na⁺、CO₃²⁻、Ca²⁺などの潜在的干渉物質で対照実験を行いました（図5c）。図5cインセットから、これらの干渉物質の652 nmでの吸光度は弱く、色変化もないことが明らかです。本結果に基づき、可視光ベースの効率的かつ高特異的なH₂O₂センサーが成功裏に実現されました。このセンサーは可視光を最大限活用して検出性能を向上させるだけでなく、他のプラズモニック金属センサーへの良い例を提供します。

結論

まとめると、超薄膜Pdナノシート（Pd NSs）を、ナノシート表面の高密度活性サイトとSPRという独自の光学特性により、高効率で光制御可能なペルオキシダーゼ模倣として適用する興味深い例を実証しました。可視光照射により、PdナノシートからSPR効果で生成されるホット電子がH₂O₂を分解し中間体O*を生成します。可視光照射下で、このようなナノザイムは暗条件下よりもはるかに高いペルオキシダーゼ様活性を示します。この光活性化システムは、H₂O₂の高感度バイオセンシングにさらに利用されました。ここで提示した基本概念、すなわち光活性化Pdナノザイム上のSPR効果によるホット電子生成に基づくものは、スマートまたはより効率的な人工酵素システムの設計に貢献し、化学産業とバイオテクノロジーに多くの新機会を提供する可能性があります。