極薄Pdナノザイムのホットエレクトロン活性化ペルオキシダーゼ模倣活性

はじめに

天然酵素は、生命のほとんどすべての化学的変換を触媒することができる絶妙な生体触媒です[1、2]。ただし、安定性の低さやコストの高さなど、固有の欠陥がまだ存在します。固有のペルオキシダーゼ模倣活性を有するマグネタイトナノ粒子が最初に報告されて以来[3]、酵素様活性を有するナノ材料（ナノザイム）の設計と開発がますます研究の注目を集めています[4]。これまで、一連の酸化物-[5,6,7]、金属-[8,9,10]、および炭素ベースのナノ材料[11,12,13]が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を模倣するために使用されてきました。これらの中で、銀（Ag）[15]、金（Au）[16、17]、白金（Pt）[8]などの貴金属ナノ材料[8、14、15、16、17、18、19]、パラジウム（Pd）[18、19] et al。は、高いペルオキシダーゼ模倣活性を有することが報告されています。一方、ナノザイムの活性を活性化するために光を導入することも報告されており、これはバイオテクノロジーおよび化学産業に豊富な機会を提供します[4、20]。しかし、現在の遠隔制御触媒システムはまだ満足のいくものではありません。

プラズモン金属ナノ材料は、表面プラズモン共鳴（SPR）の独自の光学特性により、太陽光を捕捉または応答することができます。これらの金属ナノ材料は、SPR効果によって光子を捕捉してホットエレクトロンを生成することができ、触媒速度の向上[21]、生体分子の新しい光センシングの促進[22]、光熱療法のエンジニアリング、および再生可能エネルギーとしての太陽光の使用[21]の重要な材料になりました。 23、24]。しかし、それらのどれも、それらの酵素模倣活性に対するプラズモン金属ベースのナノザイムのSPR効果に焦点を合わせていませんでした。したがって、プラズモン金属ベースのナノザイムをSPR効果と組み合わせて、非常に活性で光調整可能な酵素触媒作用を実現することは魅力的です。

ここでは、厚さ約1.1 nmの極薄Pdナノシート（Pd NS）が、優れた光制御可能なペルオキシダーゼ模倣物として機能できることを初めて報告します。 Pdベースのナノザイムおよび光制御ナノザイムシステムは、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、およびスーパーオキシドジスムターゼを含む複数の酵素模倣活性を示すことが報告されています[4、18、19]。ただし、それらの構造は通常、粒子、バルク、およびロッドです。ご存知のように、極薄のPd NSは、表面エネルギーが高く、横方向のサイズが小さく、電子移動度が高いため、活性表面サイトの密度が高くなります[25]。さらに、極薄のナノシートにさらされた原子のほとんどは、それらの性能を設計するための理想的なプラットフォームとして機能することができます[26]。極薄ナノシートのユニークな構造に触発されて、Pd原子の活性部位を最大限に活用するだけでなく、酵素触媒プロセスにホットエレクトロンを注入する戦略を提示します。スキーム1に示すように、光子と極薄Pd NSとの相互作用により、表面プラズモン共鳴が励起され、非放射性でホットエレクトロンと正孔に崩壊し、H ₂ が促進されます。 O ₂ その場で還元的に分解して、可視下でTMBを酸化して酸素種ラジカル（O *）を生成します。可視光を酵素反応に導入することにより、Pd NSは、暗い条件下でPdNSよりも大幅に高い触媒活性を示します。

暗所および可視光下でのPdNSの構造とPdNSの活性変化の概略図

材料と実験

材料と特性

クエン酸（CA）; N、N-ジメチルホルムアミド（DMF）; 3,3,5,5-テトラメチルベンジジン（TMB）;臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）はSigmaAldrichから購入しました。 Pd（II）アセチルアセトナート、W（CO） ₆ 、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は、マックリンから入手した。過酸化水素（H ₂ O ₂ 、30 wt％）はBeijing Chemicals（北京、中国）から購入しました。すべての化学物質は、さらに精製することなく使用されました。 Milliporeシステム（18.2MΩ; Millipore Co.、USA）で精製された実験用水が、作業全体で使用されました。

製品の相構造は、CuKα放射線（λ）を使用したPANalyticalX線回折計によって特徴づけられました。 =1.5406Å）。また、サンプルのUV-vis拡散反射スペクトル（DRS）は、Lambda 750、PerkinElmerを使用して室温で特性評価されました。溶液中の触媒濃度は、ICP-AES（720、Agilent）によって決定されました。透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、100kVで動作するJEM1400プラス透過型電子顕微鏡で記録されました。高分解能TEM（HRTEM）分析は、JEM-2100F電界放出型透過型電子顕微鏡（FE-TEM）で200kVで実行されました。

Pdナノシートの合成

報告された方法[27]に従って、PdNSが合成されました。簡単に説明すると、Pd（II）アセチルアセトナート（16 mg）、PVP（MW =24,000、30 mg）、CA（150 mg）、およびCTAB（60 mg）をDMF（10 mL）に混合し、窒素雰囲気中で1分間撹拌しました。 h。フラスコ内の溶液（25 mL）の色が均一なオレンジレッドの溶液に変わるとき、100 mgのW（CO） ₆ N ₂ の下でソリューションに追加されました 雰囲気。次に、フラスコを80°Cで1時間加熱します。反応後、十分な量のアセトンを用いた遠心分離（9000 rpm / min、3 min）により紺色の生成物を分離し、エタノールに分散させた。このプロセスを3回繰り返しました。最後に、さらなる実験のために、Pdナノシートを10mLのエタノールに分散させました。

光触媒ペルオキシダーゼ-測定を模倣

Pd NSsナノザイムのペルオキシダーゼ模倣活性は、TMBの酸化を測定することによって評価されました。 300WのXeランプ（CEL-HXF300 / CEL-HXUV300、中国教育Au-light Co.、Ltd。、北京）が光源として機能し、ガラスフィルターを追加すると可視光（λ ≥400nm）通過します。典型的な実験では、12.6μgmL ^-1 Pd NSsナノザイム（ICP-AESで測定）を、50 mM H ₂ を含む1mLリン酸緩衝液（0.1 M、pH 4）に添加しました。 O ₂ 室温で0.7mMTMB。照射下の異なる時間の間に、ペルオキシダーゼ模倣活性は、TMB酸化生成物の濃度を示す遠心分離後の652nmでの特徴的な吸収ピークを監視することによって決定されました。対照実験は、照明を除いて同じ条件でした。

結果と考察

PdNSナノザイムの設計と特性評価

パラジウムナノシートの典型的な合成は、古典的な方法（図1a）によって調製され、固有の基質と光子捕捉および効率的な過酸化物酵素模倣特性を備えた一連の高活性原子サイト極薄ナノザイムを構築しました。図1b–dは、合成されたPd NSの典型的な低倍率透過型電子顕微鏡（TEM）画像を示しています。この画像は、横方向の寸法が約10.0 nm（図1b、挿入図）で平均厚さが約10.0nmの均一なナノシートで構成されています。 1.1 nm（図1c、挿入図）。サイズによると、上下の平面の面積率は90％以上です。高分解能透過型電子顕微鏡（HRTEM）を使用して、PdNSの形態と位相をさらに確認します。図1gは、パラジウムの（111）および（200）格子面の適切な間隔が約0.22および0.256nmであることを示しています[27]。実験のニーズを満たすために、Pd NSのXRDパターンは、市販の炭素に負荷をかけることによって特徴づけられました。図1eに示すように、40.11、46.65、および68.12付近の回折ピークは、立方晶Pd NSの（111）、（200）、および（220）面に対応し、HRTEMからの観察と一致しています。さらに、市販の炭素に関連するピーク以外の結晶相を示すピークはありません。 Pd 3dスペクトルは2つのピークを示します（図1f）Pd 3d _5/2 およびPd3d _3/2 （スピン軌道相互作用の結果）、それぞれ335.5および339.2 eVに位置し[25]、パラジウム原子には2つの化学的環境があることが明らかになりました。

ナノザイムの特性評価。 a Pdナノザイムの成長メカニズム。 b 、 c 、および d TEM。 e XRDパターン。 f PdNSのPd3dXPSスペクトル。 g PdNSのHRTEM画像

光触媒ペルオキシダーゼ模倣活性

Pd NSのペルオキシダーゼ様活性は、典型的なペルオキシダーゼ基質としてTMBを使用して調査されました。ほとんどのPd原子が極薄ナノシートの表面に露出しているため、極薄Pd NSは高密度の活性表面サイトを持ち、優れた触媒活性をもたらすと考えられます。さすがにH ₂ の共存 O ₂ 、Pd NSは、無色の基質TMBの青色生成物oxTMBへの酸化を効率的に触媒し、652 nmでの特徴的な吸収を示します（図2a、b）。ただし、H ₂ を追加しない場合 O ₂ 、Pd NSの活性は同じ実験条件下では無視でき、ペルオキシダーゼ様活性が反応中に重要な役割を果たしていることが明らかになりました。天然酵素や他のナノザイムと同様に、Pdナノザイムは、pH、温度、および濃度に依存するペルオキシダーゼ活性を持っています（図2cおよび図S1）。実験条件下で、Pd NSは弱酸溶液中で最適化された触媒活性を示し、反応溶液の特徴的な吸光度ピークは、温度が25°Cから75°Cに変化したときに35°Cで最も高くなりました（図2c）。驚くべきことに、光照射の有無にかかわらず、ペルオキシダーゼ模倣活性の有意差が観察されました（図2dおよび図S2）。 60分間の反応溶液の吸収値によると、可視光下でのPd NSの活性は、暗条件下でのPd NSの約2.4〜3.2倍の活性を示しました（図2dおよび図S2）。同様に、触媒作用プロセスに光を導入すると、他のプラズモン金属ナノ粒子もペルオキシダーゼのような活性を高めることができます（図S3–S5）。これらのナノザイムを比較することにより、PdNSが最大範囲の活性調節を示すことがわかりました。このような現象は、主に極薄ナノシートの独特な構造によるものです。これらの得られた結果から、可視光はすべてのプラズモン金属ナノ材料のペルオキシダーゼ様活性に直接影響を及ぼし（図2e）、SPR効果は触媒プロセスにおいて重要な役割を果たす可能性があると推測できます。

PdNSのペルオキシダーゼ模倣活性。 a-b 可視光および暗条件下でのさまざまなサンプルの典型的なUV-可視吸収スペクトル。 c ペルオキシダーゼ模倣活性に対する温度とpHの影響。 d ペルオキシダーゼ模倣活動の時間経過。 e 暗所および可視光下でのPdNSのペルオキシダーゼ様メカニズム。実験条件：可視光=λ≥400nm、TMB =0.7 mM、H ₂ O ₂ =50 mM、温度=25°C、Pd NSs =12.6μg/ mL、およびリン酸緩衝液（0.1 M、pH 4）

Pdナノザイムの速度論的およびメカニズムの調査

Pd NSの酵素的挙動を特徴づけるために、反応の酵素反応速度論を決定しました。ただし、TMBの適切な濃度範囲内では、Pd NSは典型的なミカエリスメンテン曲線を示します（図3a）。ミカエリス定数（Km）と最大反応速度（Vmax）は、表S1に示すように、ラインウィーバーバーク方程式を使用して得られました。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）と比較して、TMBを含むPd NSの見かけのKm値は0.28だけ弱まりました（図3a、bおよび表S1）。この結果は、調製されたままのPd NSの極薄シート構造がTMBに対して高い親和性を示し、天然酵素HRPよりもさらに高いことを示しています。

Pd NS（12.6μg/ mL）の定常状態の速度論的アッセイと触媒機構。 a H ₂ の濃度 O ₂ は50mMであり、TMB濃度は変化しました（0.1–1.5 mM）。 b TMBの二重逆数プロット

H ₂ O ₂ 分解してPdNSと活性酸素種を形成することができるため、酸化機能を提供するためにどの種が生成されるかを理解することが重要です。原則として、貴金属はH ₂ の分解を触媒することができます O ₂ •OHを形成し、より低いpH条件で反応中間体O *を形成します[28]。どちらも酵素模倣反応で酸化機能を提供する種である可能性があります。 Pd NSの可能な触媒メカニズムを理解するために、最初にテレフタル酸（TA）/ H ₂ を使用しました。 O ₂ Pd NSのペルオキシダーゼのような特性が•OHラジカルの形成に関連しているかどうかをテストするシステム（図4a）。 TAを蛍光プローブとして使用し、2-ヒドロキシテレフタル酸と•OHの反応により高蛍光生成物が生成されました[29]。図4bに示すように、溶液の蛍光強度はPdNSの添加後に大幅に減少します。結果は、Pd NSs濃度の増加に伴って減少する蛍光強度とよく一致しています（図S6）。これらの結果は、PdNSが•OHラジカルを生成するのではなく消費できることを示しています。したがって、報告されているフェリチン-白金ナノ粒子の触媒作用[30]と同様に、PdNSの触媒性能は•OHラジカルの形成とは無関係でした。

a ヒドロキシルラジカル（•OH）を捕捉するテレフタル酸（TA）のメカニズム図。リン酸緩衝液（0.1 M、pH 4）、H ₂ を含むサンプルのスペクトル O ₂ （50 mM）、および可視光照明（λ ≥400nm、15 min）。 b Pd NS（12.6μg/ mL）およびTA（66.7μM）の存在下での蛍光発光スペクトル。 c KBrO ₃ のメカニズム図 ホットエレクトロニクスのキャプチャ。 d Pd NS（12.6μg/ mL）、KBrO ₃ の存在下での吸収スペクトル （0.3 mg / mL）、およびTMB（0.7 mM）

Pd NSの触媒メカニズムが光によるホットエレクトロンの形成に関係しているかどうかを調べるために、光触媒反応中の活性種のホットエレクトロンのトラップ実験も検討します（図4c）[31]。図4dからわかるように、TMB酸化に対するPd NSの触媒能力は、0.3 mg / mL KBrO ₃ の添加により、15分以内に大幅に低下します。 （e ⁻ のクエンチャー ）。 KBrO ₃ 間のこのような大きな違い /反応システムと純粋なシステムは、ホットエレクトロンの存在がTMB酸化にとって重要である可能性があることを示しています。これは、図S7の結果と一致しており、Pd NSは、500〜1000nmのスペクトル範囲でSPR効果により広い吸収ピークを示します[25]。さらに、ホットエレクトロンがPd NSの表面から離れると、対応するホールが表面に残ります。これらの穴はエタノールを酸化してアセトアルデヒドを生成する可能性があるため、TMBに対して強力な酸化能力を持っている可能性もあります。予想どおり、H ₂ を追加しませんでした O ₂ 、可視光の照明の下でより多くのoxTMBが作成されました。

次に、活性酸素種がO ₂ の活性化によって形成されたかどうかをテストします。 スーパーオキシド（O ₂ ）を含む可視光下 ⁻ ）。これに照らして、制御された実験が異なる雰囲気下で行われた。図S8の場合、反応系を飽和させた状態で窒素と酸素をそれぞれ導入しても、模倣酵素の触媒性能は大きく変化しません。これは、O ₂ の影響をあまり受けません。 PdNSの光触媒活性について。 Pd NSの最終的な性能は、可視光下で5分間で0.051 a.u./minまででも、暗所でのPd NSs触媒の3.2倍であったことを指摘する必要があります（図2d）。可視光下でのPdナノザイムの非常に高い活性は、フリーラジカルの代わりに反応中間体O *の形成を促進するPdNSのSPR効果によるホットエレクトロンの存在がペルオキシダーゼのような活性を説明するという仮説を導きます（図5a ）[28]。簡単に言えば、活性種のトラップ実験と換気実験は、PdNSの光触媒模倣酵素メカニズムを強力にサポートします。

a H ₂ のセンサーの概略図 O ₂ 検出。 b 異なる過酸化水素濃度の用量反応曲線。実験条件：Pdナノザイム（25.2μg/ mL）、リン酸緩衝液（0.1 M、pH 4）、およびTMB（0.7 mM）可視光照明（λ ≥400nm、3 min）。挿入図：線形キャリブレーションプロット。 c H ₂ の吸光度に対する他の不純物の干渉 O ₂ 652nmの測色センサー。実験条件：Pdナノザイム（25.2μg/ mL）、リン酸緩衝液（0.1 M、pH 4）、TMB（0.7 mM）、可視光照明（λ ≥400nm、15 min）、50 mM H ₂ を含む O ₂ 、200 mMグルコース、Na ⁺ 、K ⁺ 、Ca ^{2 +} 、およびCO ₃ ^2- 、挿入図は反応溶液の色の変化を示しています

新しいリアルタイムで高感度のセンサー

これは、外部エネルギーの入力としてセンサーに光を導入すると、センサーのパフォーマンスを向上させることができるといういくつかの研究で実証されました[22、32、33]。たとえば、Ling etal。 [32]はO ₂ 10atのセンシング特性。 ％LaOCl-SnO ₂ センサーは紫外線照射により大幅に改善されました。センサーへの光の大きな影響と、可視光下でのPd NSの優れたペルオキシダーゼ模倣活性を考慮して、効果的で感度の高い比色センサーH ₂ O ₂ 建設された。センサーのメカニズム（図5a）は、Pd NSがその大きな比表面積を最大限に活用して光子を捕捉し、多数のホットエレクトロンを生成できることを示しています。その後、ホットエレクトロンはH ₂ の分解を促進します O ₂ TMBを青色のoxTMBに酸化できる反応中間体O *を生成します。最後に、H ₂ の効率的な検出 O ₂ 実現しました。

図5bの挿入図からわかるように、構築されたH ₂ の線形範囲 O ₂ 私たちによるセンサーは10から100μMであり、検出限界の計算は13.40μMでした（LOD =3 s / k 、ここで s および k それぞれ、8つの並列制御測定の相対標準偏差と傾きの線形キャリブレーションブロックを表します。この作品では、 s =2.97988×10 ⁻⁴ 、 k =6.67×10 ⁻⁵ ）。したがって、Pd NSに基づく過酸化水素センサーは、光を導入する条件下で他の報告されているナノ材料よりも優れていました。表S2から、過酸化水素を検出するための同じ比色法で、センサーが広範囲の直線性を示していることがわかります[34]。また、検出限界は、FeベースまたはCoベースのペルオキシダーゼ模倣物に基づく多くのセンサーよりも低かった（表S3）[35、36]。最後に、H ₂ を実行しました O ₂ K ⁺ などの潜在的な干渉を伴う一連の制御実験（図5c） 、ブドウ糖、Na ⁺ 、CO ₃ ^2- 、およびCa ²⁺ 。図5cの挿入図に示されているように、これらの干渉の吸光度は652 nmで弱く、色は変化しません。私たちの結果に基づいて、可視光に基づく効率的で特異性の高い過酸化水素センサーが成功裏に実現されました。このセンサーは、可視光を最大限に活用して検出性能を向上させるだけでなく、センサー内の他のプラズモン金属の良い例を提供します。

結論

要約すると、ナノシートの表面に高密度の活性部位があり、SPRの独自の光学特性により、非常に効率的で光制御可能なペルオキシダーゼ模倣物として極薄Pdナノシート（Pd NS）を適用するエキサイティングな例を示しました。可視光の照射により、SPR効果を介してPdナノシートから生成されたホットエレクトロンは、その後H ₂ を分解する可能性があります。 O ₂ 中間体O *を生成します。可視光照射下では、このようなナノザイムは暗所よりもはるかに高いペルオキシダーゼ様活性を示しました。このような光活性化システムは、H ₂ のバイオセンシングを強化するためにさらに使用されました。 O ₂ 。ここで紹介する基本的な概念は、光活性化Pdナノザイムに対するSPR効果による高温電気の生成に基づいており、スマートまたはより効率的な人工酵素システムの設計に貢献し、化学産業とバイオテクノロジーに多くの新しい機会を提供する可能性があります。

データと資料の可用性

この調査中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された記事に含まれています。

略語

Pd NS：

Pdナノシート

Ag：

シルバー

Au：

ゴールド

Pt：

プラチナ

Pd：

パラジウム

SPR：

表面プラズモン共鳴

TEM：

透過型電子顕微鏡

HRTEM：

高分解能TEM

XRD：

X線回折

HRP：

西洋ワサビペルオキシダーゼ

Km：

ミカエリス定数

O ₂ ⁻ ：

スーパーオキシド