固体ナノポアの内面修飾に基づく過酸化水素検知

背景

ナノポア検出技術は、コールターカウンター[1]と細胞イオンチャネル[2]に由来します。ナノポアは、それを通過する溶液中に存在する荷電分子を検出します。ナノポア内の分子の出現は、ポアのコンダクタンスを明らかに変化させ、その結果、電流信号を変化させる可能性があります。電流の変化は、細孔内の分子のサイズと濃度に関する情報を提供し、分子の移動挙動のダイナミクスプロセスを明らかにします[3]。ナノ粒子[4,5,6]、ウイルス[7,8,9]、タンパク質分子[10,11,12,13]、DNA配列[14,15,16]など、一部のナノスケールオブジェクトはナノポアを使用して検出できます。 、17]。ナノポアには2つのタイプがあります。生物学のナノポアと固体ナノポア。生物学のナノポアは、信号対雑音比（SNR）が低く、解像度が高くなっています。小さくて折りたたまれていないタンパク質は、生物学のナノポアを使用して検出できます[18、19、20、21、22、23]。固体ナノポアはサイズ調整可能で、安定性が高くなっています。固体ナノポアは通常、フィルムに穴をあけられます。このフィルムは、流体セルを2つの部分に分割します[24]。バイアスされた電圧がナノポアを含む薄い膜に印加され、あるセルから別のセルへのイオン電流が発生します[25]。折りたたまれた構造と折りたたまれていない構造を含むタンパク質分子は、固体ナノポアによって検出および分析されます[26、27、28、29]。タンパク質の相互作用は、固体ナノポアを使用して検出することもできます[30、31]。さらに、タンパク質の動態を検出する能力があります[32、33]。検出範囲の限界を解決するために、化学的に修飾された固体ナノポアが広く適用されており[34、35、36、37、38、39]、化学的に修飾された固体ナノポアが一本鎖DNAの検出に適用されています[40]およびタンパク質[41]。

H ₂ の検出には、すでに多くの定量的手法が適用されています。 O ₂ 、それらのほとんどは、分光分析[42,43,44,45]、化学発光[46,47,48,49]、アンペロメトリー[50,51,52,53]および電気化学[54,55,56,57]に基づいています。 。従来の分光分析および化学発光法は、一般に時間と費用がかかります。固体ナノポアセンサーは、消費量が少なく、構造が単純で、小分子の検出に使用できます。

ここでは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で修飾されたタイプの固体ナノポアを紹介します。 HRPは固体ナノポアの内面に固定化され、固定化されたHRPは、H ₂ の存在下で単一のナノポアチャネル内で発生したレドックス反応で活性を維持しました。 O ₂ [58]。 ABTS ^•+ 酸化還元反応で生成されたものは凝集し、次に凝集したABTS ^•+ ナノポアを通過した。転座イベントを検出できます。過酸化水素検出の場合、固体の構造は単純であり、凝集したABTS ^•+ を検出できます。 低試薬消費量を使用することによって。この西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）酵素修飾固体ナノポアは、過酸化水素（H ₂ O ₂ ）集約されたABTSを介して間接的に検知 ^•+ 検出。これは、単一分子の検出と分子アセンブリの内部固体ナノポアにとって有益な意味を持っています。

メソッド

化学薬品および材料

西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）分子（1mg mL ^-1 、Enzyme Commission No.1.11.1.7、44 kDa）は、Xiya Reagent（Chengdu、China）から購入しました。サンプル（HRP）を0.02μmのろ過した0.1 M PBSに溶解し、4°Cで保存し、調製から2日以内に使用しました。塩化カリウム（KCl）、N-（3-ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド（EDC）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）および2,2'-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）（（ABTS ）、98％）は、DiBo Chemical Technology Co.、LTD（上海、中国）から購入しました。過酸化水素（H ₂ O ₂ 、30％）はSinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd。から購入しました。（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（3-APTES）はSigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。実験は、Milli-Q水浄化システム（抵抗率18.2MΩ/ cm、25°C、Millipore Corporation、米国マサチューセッツ州ビレリカ）からのトラップされていない水を使用して実施し、FEI Strata 201 FIBシステム（FEI Co.、Hillsboro、OR、USA）、Zetasizer（Malvern Zetasizer Nano ZS）、およびAxopatch 700B（Molecular Devices、Inc.、Sunnyvale、CA、USA）。使用済みの楽器の写真が補足資料に追加されました（追加ファイル1：図S1を参照）。

固体ナノポアの製造と電気的測定

まず、Si ₃ の薄い膜 N ₄ （厚さ１００ｎｍ）は、厚さ３００μｍのＳｉ基板上に堆積された。フォトリソグラフィーが続きます（開いているウィンドウのサイズは500×500μm ² ）。次に、FEI Strata 201 FIBシステム（FEI Co.、Hillsboro、OR、USA）を使用して、30 kVの加速電位で、電流を1 pAと測定しながら、膜の表面にGa +イオンを照射しました。スポットモードでの粉砕時間は1.5秒でした。最後に、固体ナノポアチップを取得し、新たに調製したピラニア溶液で80°Cで30分間洗浄した後、超純水ですすいだ。洗浄後、チップは、チップの2つの側面を分離するために2つのViton Oリングを備えた特注のテフロンセルに組み立てられ、ナノポアを通るイオン電流の唯一の経路を確保するために2つのリザーバーを形成しました。使用した装置の写真を補足資料に追加しました（追加ファイル1：図S2を参照）。電極（Ag / AgCl）を流体セルとパッチクランプ増幅器（Axopatch 700B、Molecular Devices、Inc.、Sunnyvale、CA、USA）に接続し、定電圧下でイオン電流を測定可能にし、信号のサンプリングレートを100kHzにしました。 。増幅器の内部ローパス8極ベッセルフィルターは10kHzに設定されました[3]。機器全体が二重ファラデーケージエンクロージャーに配置されました。

結果と考察

HRPによるナノポアの固定化

直径約50nmの選択したナノポアを、80°Cのピラニア溶液に30分間浸漬しました。ピラニア溶液で処理した後、ナノポアの内面はシリコンヒドロキシル基をとることができました。続いて、薄膜全体を（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（3-APTES）で活性化した。 3-APTESで処理した結果、アミノ（-NH ₂ ）グループはフィルムの表面に生成されました。

（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（3-APTES）で活性化した後、ナノポアチップをN-（3-ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド（EDC）（10 mM）とN-ヒドロキシスクシンイミド（10 mM）の0.1 MPBS溶液に入れました。 NHS）（20 mM）。その後、ナノポアチップを西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（10 ng / ml）に導入しました。私たちのグループの以前の研究結果[3]によると、0.1から2 M KCl、pH 7.0までの異なる塩濃度では、HRPは凝集しませんでした。 pI のため 西洋ワサビペルオキシダーゼの値は4.3±0.2であり、HRPが0.1 M KCl pH6.0およびpH7.0で凝集しないことも証明しました。 EDC試薬は、HRPのカルボキシル（-COOH）基を活性化して反応性の高いo-アシルイソ尿素中間体にしました。さらに、NHSの存在下で中間体はさらに安定なスクシンイミジルアミン反応性エステルに変換されました[58]。その結果、中間体と（-NH ₂ ）安定したアミド結合を形成するためにナノポアの内面に生成されます（図1）。

単一の固体ナノポアチャネルで修飾プロセスを実行します。 a カルボジイミドカップリング化学を介した単一のナノポアチャネルへの西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の共有結合の概略図。 HRPのカルボキシル（-COOH）基はEDC溶液によって活性化され、HRPが（-NH ₂ ）ナノポアチップの表面に生成されます。 b 固定化されたHRP過酸化水素センサーのスキーム、センサーの内面はHRPで変更されました。 H ₂ の場合 O ₂ そしてABTSが発生し、ABTS ^•+ 生産。 HRPの結晶構造は著者の許可を得て使用されました[3]

これらのプロセスにより、単一のナノポアの内面にHRPを固定化することができます。機能化プロセスの実現は、電流-電圧（ I-V ）を測定することによって確認されました。 ）変更前後の単一ナノポアの（図2）。

典型的な電流-電圧（ I-V ）0.1 M KCl中の未修飾（元の）および修飾ナノポアの曲線、0.1 MPBSでpH7.0で緩衝化。 黒い線 I-V です 未修飾のナノポアの曲線、および赤い線 I-V です HRPを使用した修飾ナノポアの曲線。 挿入 単一のナノポア（直径約50 nmシス）の走査型電子顕微鏡（SEM）とナノポアセンサーです。 100nmはスケールです

HRPで修飾された固体ナノポアの特性評価

ここでは、単一のSi ₃ の形状 N ₄ ナノポアチャネルは円筒形です。図2は、一般的な電流-電圧（ I-V ）を示しています。 ）0.1 M KCl中の未修飾（元の）および修飾ナノポアの曲線、0.1 MPBSでpH7.0で緩衝化。ナノポアの内面をHRP酵素で修飾した後、ポアサイズは小さくなりました。

Wanunu et alによると、ナノポアの外部コンダクタンスを考慮に入れることにより、固体ナノポアの直径は次の式で計算できます。

ここで、 d および l は細孔の直径と長さ、 G ナノポアのオープンポアコンダクタンス、σ はイオン溶液の導電率です。

幾何学的効果を考慮して、HRP酵素で固体ナノポアを修飾した後、有効サイズを計算できます。単一のナノポアの直径は、式（1）に基づいて計算できます。ここで、コンダクタンスの値（ G _変更なし ）は〜15 nSは、 I-V から取得できます。 未修飾の固体ナノポアの曲線。導電率（σ ）イオン溶液0.1 M KCl（25°C）の場合、0.1 MPBSでpH7.0に緩衝化すると、約1.28 S / mになります。したがって、未修飾のナノポアの直径は約51 nmであり、測定された直径と同様です。同じ方法を使用して、コンダクタンス（ G _変更 ）は〜7.5 nSであり、修飾されたナノポアの直径（〜34 nm）を計算できます。直径の縮小は、次の2つの理由により可能です。1つは、ナノポアの内面を（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（3-APTES）で処理し、ナノポアの表面に（-NH ₂ > ）アミノ基。 2番目の理由は、流体力学的直径（ D _h ）HRP酵素の約8 nm [3]である場合、固定化されたHRPは細孔の直径を小さくする可能性があります。ここでは、過酸化水素検出チャネルとして、直径が約34nmのHRPで修飾された固体ナノポアが使用されています。

レドックス反応の原理

レドックス反応は単一の修飾ナノポア内で行われ、以下に示す反応プロセスは提案されたレドックス反応とよく一致しています[58]。 H ₂ の存在下 O ₂ （0.5 mM）、ナノポアの内面に固定化されたHRP酵素はすぐに化合物1に変換されました。次に、化合物1は還元基質分子ABTS（1.5 mM）から1つの電子を受け取り、化合物2を生成しました。続いて、化合物2は、別の基質分子ABTSからの1つの電子移動を介して、休止酵素に還元されました。

カチオン性生成物（ABTS ^•+ ）のレドックス反応は単一のナノポアに蓄積されました。ナノポアチャネルから蓄積された分子の転座は、コンダクタンス（ G ）、したがって電流の変化（ΔI _b ）を見つけることができます。

転座イベントの検出

実験は、0.1 M KCl中、0.1 MPBSでpH7.0に緩衝化された、修飾された細孔径（〜34 nm）の西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）修飾ナノ細孔を使用して行われました。 2,2'-アジノビス-（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホネート（ABTS）（1.5 mM）および過酸化水素（H ₂ O ₂ ）（0.5 mM）をナノポアのトランスコンパートメントに添加しました。 ABTSとH ₂ を追加した後 O ₂ 、-100〜-800 mVのバイアス電圧を使用した実験を実行し、100kHzでサンプリングしました。電圧が-400mVに上昇するまで、転座イベントはありませんでした。図3は、0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0で、-400〜-800mVのさまざまな電圧での転座イベントの代表的なイオン電流トレースを示しています。さまざまな電圧の長期間の転座イベントの実験データが補足資料に追加されました（追加ファイル1：図S3を参照）。

a – e -400〜-800mVのさまざまな電圧での転座イベントの概略図。印加電圧が-400mVから-800mVに増加すると、転座イベントの頻度が増加しました。 f 電流振幅は電圧とともに直線的に増加します。 h 指数関数的に減衰する関数（ t _d 〜e ^{−v / v0} ）印加電圧に依存する滞留時間を適合させるために採用されました

ミリ秒の電流遮断イベントが観察され、0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH7.0で実施されました。試薬H ₂ を追加する O ₂ トランスコンパートメントへのABTS、単一ナノポアチャネルの内面に固定化されたHRP酵素、およびレドックス反応が発生しました。豊富なABTS ^•+ 分子が生成され、単一の小分子ABTS ^•+ システムの分解能により、固体ナノポアを使用して検出されない場合があります[3]。ただし、これらの分子は、生成後に凝集します。したがって、ABTS ^•+ を検出することが可能です。 分子。ここでは、負の電圧が保持され、ABTS ^•+ が集約されました。 分子はナノポアを通過しました。負の電圧が印加されたとき、電気泳動および電気浸透流があった。 HRPは0.1M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0で負に帯電し[3]、その結果、二重の電気層が生成され、電極浸透は負の電極方向になります。このため、電気泳動と電気浸透は同じ方向を向いていました。集約されたABTS ^•+ 単一のナノポアチャネルでは、固体ナノポアを通って輸送され、負極方向に流れます。

転座イベントの統計分析

バイアスされた電圧は、集約されたABTSの転座において重要な役割を果たしたため ^•+ 、集約されたABTSの現在の封鎖の影響 ^•+ HRPを通過することで修飾されたナノポアと印加電圧が議論されました。電圧の上昇に伴い、転座イベントの発生頻度が大幅に向上しました（図3f）。電圧が増加すると、電流の振幅も増加します。ただし、バイアス電圧が-300 mV未満に保たれると、転座イベントは徐々に消失しました。これは、集約されたABTS ^•+ を示唆しています。 HRP全体で、変更されたナノポアには-300mVのしきい値電圧が必要でした。図4は、集約されたABTS ^•+ について測定された転座イベントの平均電流振幅のヒストグラムを示しています。 異なる電圧で。フィッティング曲線に基づいて、現在の閉塞のピーク値（ΔI _b ）は308.4±27.795 pA、419.1±20.354 pA、478.8±32.857 pA、528.1±36.98 pA、606.9±40.916 pA、それぞれ-400、-500、-600、-700、-800mVです。電流の減少は、集約されたABTS ^•+ によって引き起こされます。 異なる電圧でナノポアを通過する分子。電流振幅の値は、-0.706の傾きと49.262の切片を生成する1次多項式関数に適合しました。ただし、フィッティング曲線に基づくと、滞留時間の値は、-400、-500、-600、-で54.5±21.374ms、42.8±20.181ms、10.3±3.05ms、6.0±1.744ms、4.0±1.441msです。 700、および-800mV。図3hは、指数関数的に減衰する関数（ t _d 〜e ^{−v / v0} ）を使用して、印加電圧に依存する滞留時間を適合させました。転座イベントの滞留時間のヒストグラムが補足資料に追加されました（追加ファイル1：図S4を参照）。

集約されたABTS ^•+ について測定された転座イベントの平均電流振幅のヒストグラム 0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0で、さまざまな電圧（-400、-500、-600、-700、-800 mV）で。すべてのヒストグラムはガウス分布に適合しました

集約された各ABTSの現在の封鎖とイベントの滞留時間 ^•+ 異なる電圧での2次元散布図に適合しました（図5）。集約されたすべてのABTS ^•+ -400〜-800 mVのイベントのクラスターを表示します。主なイベントクラスターは、集約されたABTS ^•+ によるものです。 HRPで修飾された固体ナノポアを通過します。

集約された各ABTSの現在の閉塞とイベントの滞留時間の2次元散布図 ^•+ 異なる電圧で。対応するヒストグラムは、右上に配置されています。すべてのヒストグラムはガウス分布に適合しました

さらに、すべての電圧での単一の転座イベントが分析され、電流遮断は同じサイズと帯電した物質によって引き起こされました。したがって、すべての転座イベントは、単一の集約されたABTS ^•+ によって誘発されたと見なされます。 。集約されたABTSの転座時間を分析するには ^•+ 私たちの実験では。現在の封鎖期間 t _d 単一の集約されたABTSの滞留時間と見なされます ^•+ それが生成された場所からナノポアの出口まで。ここでは、別の条件が考慮されました。ナノポアの入口に固定化されたHRP酵素がいくつかある可能性があり、それがレドックス反応を触媒する可能性があります。したがって、酸化還元反応が入口ではなく単一のナノポアの内面で起こったことを確認するために、他の実験が行われた。検証のために、HRPによる変更なしが適用され、分析されました。これらのナノポアは3-APTESで活性化されました。また、同じ濃度のHRP（10 ng / ml）、ABTS（1.5 mM）、およびH ₂ O ₂ （0.5 mM）をナノポアのトランスコンパートメントに添加し、負のバイアス電圧を0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0に印加しました。電気泳動力により、HRPはナノポアを通過できませんでした。酸化還元反応により、凝集したABTS ^•+ 生成されましたが、転座イベントは見つかりませんでした。集約されたABTS ^•+ HRPで静電効果を引き起こし、ABTSの凝集を防ぎます ^•+ ナノポアを通過します。

図6は、コンダクタンスの変化（ΔG）の2次元散布図を示しています。 ）対イベントは、集約された各ABTSの滞留時間 ^•+ 異なる電圧で。コンダクタンスの変化（ΔG ）主に0.8nSに集中。転座イベントの形はほとんど同じです。 ΔGの平均値 さまざまな電圧で約0.8nSです。すべての集約されたABTSの体積排除 ^•+ 分子はほとんど同じです。凝集したABTSの静電効果と立体効果 ^•+ 分子はイオン電流を変える可能性があります。分析後、正に帯電した凝集ABTS ^•+ を使用した電流トレースの2つの典型的な形状 転座が観察されました（図7）。代表として-700mVでの転座イベント。 2つのタイプのイベントの割合を分析したところ、電圧の増加に伴ってタイプ1のイベントの割合が増加したのに対し、タイプ2のイベントの割合は減少したことがわかります。より高い電圧は、より低い電圧よりも転座を速くすると考えられていました。

ΔGの2次元散布図の概略図 集約された各ABTSの対イベント滞留時間 ^•+ 異なる電圧で。対応するフィットカーブは上に配置されました。 挿入 は、さまざまな電圧（-400〜-800 mV）の転座イベントです

a -700mVの電圧での2つのタイプの転座イベントの概略図。 b 異なる電圧（-400、-500、-600、-700、-800 mV）での2つのタイプのイベントのパーセンテージ

現在の封鎖信号は、集約されたABTSのサイズ、コンフォメーション、および相互作用を明らかにしました ^•+ 単一のナノポアチャネルを通過します。現在の形の変化については、変化の過程が推測されました。イベント1の場合、電流信号には、強度が深く滞留時間が短い典型的な変動部分があります。集約されたABTS ^•+ それが生成された場所からナノポアを通過しました。集約されたABTSの場合 ^•+ ナノポアを通過すると、ナノポアのイオン電流は元のレベル（ベースライン）に戻ります（ I ₀ ）。イベント2の場合、電流信号は強度の深い変動部分を持ち、その後水平ステージを持ちます。この信号の形状は、集約されたABTS ^•+ の静電相互作用に起因する可能性があります。 ナノポアの出口にHRPがあり、電流はゆっくりとベースラインに回復しました。現在の変化をよりよく理解するには、オープンポアコンダクタンスの変化（ G ）から始める必要があります。 _ポア ）塩濃度（0.1 M KCl）で。以前の研究で説明したように、直径 d の負に帯電したナノポアのオープンポアコンダクタンスの方程式 と l の長さ 低塩濃度では次のように説明できます

ここでμ _K およびμ _Cl K ⁺ の電気泳動運動度です およびCl ⁻ 、 n _KCl K ⁺ の数密度です およびCl ⁻ 、電気素量は e、σ _p はナノポア表面の表面電荷密度です。この実験では、固体ナノポアを化学的に修飾し、ナノポアの直径を変更しました。ナノポア表面の表面電荷密度（σ _p ）正確に取得することはできません。したがって、オープンポアコンダクタンス（ G _ポア ）は式（1）に基づいて計算されました。式（1）により、オープンポアコンダクタンス（ G _ポア ）は〜7.5nSです。コンダクタンスの変化は2つの理由に起因すると推測されます[15]。最初の理由は、ナノポア内のイオンの体積排除が、凝集したABTS ^•+ によって占められていたことです。 分子。その結果、固体ナノポアのコンダクタンスが低下しました（ΔG ^- ）。 2番目の理由は、一部のイオンが凝集したABTS ^•+ によってナノポアからもたらされたことです。 固体ナノポアのコンダクタンスを増加させる分子。これらの実験では、ABTS ^•+ ナノポア内で生成され、イオンは持ち込まれませんでした。したがって、固体ナノポアのコンダクタンスの変化（ΔG ）は、体積排除によってのみ誘導されました。したがって、コンダクタンスの全体的な変化は次のように説明できます

固体ナノポアのコンダクタンスの低下は、体積排除によって引き起こされ、次の式で計算できます

ここで、γ は、球形と粒子の同じ体積の表面積比である粒子形状係数です。この作業では、集約されたABTS ^•+ 分子はグローバルオブジェクトに簡略化されたため、γの値 は1でΛ ボリュームの除外です。バルク溶液の導電率σ は1.28S / m、0.1 M KCl（25°C）です。

ボリューム除外の場合（Λ ）、他のいくつかの分子の転座イベントから推測することができます。コンダクタンス変化（ΔG）を接続するため ）分子の物理的性質に対して、オームの法則は、固体ナノポアに基づく電解質溶液の体積変化に適用できます[59]。円筒形の固体ナノポア内の分子の転座イベントが発生すると、電流は瞬時に減少しました。固体ナノポアの抵抗が回路全体の抵抗である場合、コンダクタンスが変化します（ΔG ）は次の式で表すことができます

この式では、 A _p H _eff =V _p は固体ナノポアの体積、 f （ d _m / D _p 、lm / H _eff ）は補正係数です（表面電荷の影響は無視されます）。実験では、集約されたABTS ^•+ を簡略化しました。 グローバルオブジェクトへの分子;したがって、補正係数は1です。 d _m / D _p は分子の直径とナノポアの直径の比率、 lm / H _eff は分子の有効長とnaoporeの有効長の比率です。式（5）は次のように簡略化できます

コンダクタンスの平均値（ G _ポア ）転座イベントの分析されています。式（5）から、排除体積の平均値（Λ ）さまざまな電圧（-400、-500、-600、-700、-800 mV）で取得できます。一方、使用されるナノポアのサイズ、ナノポアの体積（ V _p ）は〜90746 nm ³ 。式（4）により、コンダクタンスの値は変化します（ΔG ^- ）は〜0.6nSとして計算できます。さまざまな電圧（-400、-500、-600、-700、-800 mV）での転座イベント実験から得られたコンダクタンス変化の平均値は約0.784nSです。計算値が実験値に近いことがわかります。

以前のいくつかの調査では、過酸化水素分子がさまざまな技術で検出されることが達成されています。しかし、ナノチャネルで過酸化水素を検出することはまれです。タンら。 [3] HRPがナノポアにねじ込まれたときの差別化された異種イベント信号には、ABTSとH ₂ がありました。 O ₂ KCl溶液中。 HRP転座を伴う異なるタイプの信号はABTS ^•+ と見なされました ナノポアを通過します。酵素触媒基質の生成物の転座の6つの典型的なイベントが分析されました。彼らはあらゆるタイプのありそうなプロセスを推測しました。しかし、証言するのに十分な証拠はありません。ムバラク・アリ他単一の円錐形ナノチャネル内のレドックス反応生成物を検出することを達成しました[58]。彼らは、カチオンラジカルABTS ^•+ 円錐形ナノチャネル内のイオンの電圧依存性濃度と一致して、電圧依存的にHRPナノチャネル内のイオン電流を減少させました。現在の閉塞の大きさはH ₂ と相関していた O ₂ 溶液中の濃度。

結論

結論として、Si ₃ を作成しました N ₄ FIBをうまく利用したナノポア、共有結合したHRP酵素で表面が修飾された単一のナノポアシステム。過酸化水素（H ₂ ）としての単一の固体ナノポアに固定化されたHRP酵素の効果 O ₂ ）センサーは、製品を調査することによって確認されました（ABTS ^•+ ）基質H ₂ の存在下で発生するレドックス反応の O ₂ およびABTS。凝集したカチオンラジカルABTS ^•+ 固体ナノポア内で生成され、HRPで修飾された固体ナノポアのイオン電流が減少したことは、電圧依存性と一致しています。現在の封鎖傾向は、印加されたバイアス電圧に対して線形依存性を示しました。滞留時間と印加されたバイアス電圧の関係は、指数関数的に減衰していました（ t _d 〜e ^{−v / v0} ）。一方、集約されたABTS ^•+ HRPを通過した修飾ナノポアには、-300mVのしきい値電圧が必要でした。コンダクタンスの変化（ΔG） 分析的に計算され、測定された実験値と比較されています。転座イベントは、特定のサイズの凝集カチオンラジカルABTS ^•+ によって生成されました。 。固体ナノポアを使用することで、検出限界を下げ、システムの感度を向上させることができると期待しています。私たちの固体ナノポアシステムの場合、構造は単純です。汚れの影響を受けにくく、複数回使用できます。

略語

3-APTES：

（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン

ABTS：

3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸

EDC：

N-（3-ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド

FIB：

集束イオンビーム

HRP：

西洋ワサビペルオキシダーゼ

KCl：

塩化カリウム

NHS：

N-ヒドロキシスクシンイミド

SEM：

走査型電子顕微鏡

SNR：

信号対雑音比