マゲマイトナノ粒子はナノザイムとして機能し、セイヨウアブラナの成長と非生物的ストレス耐性を改善します

背景

食料安全保障は最も重要であり、変化する世界の差し迫った問題です。気候の変化と人口の増加により、植物科学者や農業エンジニアは、環境への影響を抑えながら食料生産を確保するための改善されたツールを革新するようになっています。ナノテクノロジーは、この長年の問題を解決するために探求できるそのような新しいツールの1つです[1,2,3]。ナノテクノロジーは、食品生産チェーンの重要かつ不可欠な部分になると予測されており、たとえば、作物保護[4,5,6]、肥料[7、8]、バイオセンサー、精密農業[9]、食品の包装と安全性[10]。ナノ粒子は本質的に遍在しており、植物はさまざまなナノ粒子にさらされて進化してきました[11]。酸化鉄ナノ粒子（ION）は、天然に存在するナノ粒子の重要な部分を構成します[12]。植物や土壌微生物がイオンを生成するという証拠があります[11、13、14]。人工イオンの植物への毒性に懸念を抱いている研究者もいれば[15、16]、肥料としてイオンを使用する可能性に焦点を当てている研究者もいます[17、18、19、20、21、22]。マグネタイトFe ₃ の磁性ナノ粒子 O ₄ およびマグヘマイトγ-Fe ₂ O ₃ 構造は、ペルオキシダーゼ模倣能力（低pH）とカタラーゼ模倣能力（中性pH）の両方の効果的なナノザイムであることが示唆されています[23、24、25]。特定の濃度では、ナノ酸化鉄は、キレート化された形で等量の第一鉄イオンを添加する場合と比較して、植物の成長を促進することが示されています[17]。ナノ酸化鉄の酵素能力は、単なる鉄施肥のそれ以上の植物の成長を刺激することができると仮定します。さらに、これは、カタラーゼとペルオキシダーゼが放出される活性酸素種（ROS）の除去に重要になる、干ばつなどの一般的な非生物的ストレスの間に植物を助けるはずであることを示唆します。ここでは、γ-Fe ₂ に関するこの仮説をテストするための調査を示します。 O ₃ 土壌と管理された環境で栽培されたナタネ。

結果

植物の形質に対する粒子の影響

イオンを追加することにより、適切な量のキレート鉄を追加する場合と比較して、ナタネの成長が増加しました。葉の長さは、対照と比較して統計的に有意な増加を示し、細胞分裂または細胞伸長のいずれかの増加を示唆しています（図1a）。植物が干ばつにさらされる前に、SPADメーターで測定したクロロフィル含有量の統計的に有意な増加があり、対照と比較してこれらの植物の適応度が増加したことを示唆しています（図1b）。

栄養素またはIONを含む栄養素で灌漑された土壌を備えた鉢で育てられた植物のさまざまな生理学的パラメータ。 a 個々の葉の長さは、ION処理の前から5日後まで増加します（ n =16、 p 値=0.053）。 b SPAD測定で測定された葉のクロロフィル含有量（ n =16、 p 値=0.000）。異なる文字は統計的に有意な差を示します

水分損失は統計的に有意な差を示しませんでしたが、IONによる処理では水分保持が大きくなる傾向がありました（図2a）。植物の成長も考慮した新鮮な重量は、常にION処理で高い値を示し（図2b）、場合によっては統計的に有意でした。たとえば、干ばつが長引いた実験の1つを図3に示します。

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干ばつストレス後の植物パラメータ。 a 水を構成する植物の重量のパーセント。 b 5日間の干ばつ後の植物バイオマス（ n =8、 p 値=0.127）。異なる文字は統計的に有意な差を示します

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干ばつの5日後に測定された植物の新鮮な重量。 15の生物学的複製と p との統計的に有意な差 値0.01

コントロールにも十分な量の鉄があることを考えると、新鮮な重量の大きな違いは例外的です。 IONで処理された植物は、干ばつ時に対照よりもうまく対処し、水をやり直した後によりよく回復することが観察されました（図4）。

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5日間の干ばつストレス後の水やり後の植物の写真。 a 養液で灌漑された植物を制御します。 b 0.8 mg / mlIONを含む養液で灌漑された植物。 c 2 mg / mlのイオンを含む養液で灌漑された植物

葉の過酸化水素濃度に対するIONの影響

旱魃後の葉の過酸化水素の量は、水やりに使用される養液にIONを加えると大幅に減少しました。 0.8 mg ml ^-1 では変動が大きかった 処理;したがって、他の治療法との違いは統計的に有意ではありません。ただし、コントロールと最高濃度の2 mg ml ^-1 の違い p で統計的に有意です 値は0.004で、対照治療では平均84％大きくなっています（図5）。

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イオンを含む養液で処理され、5日間干ばつにさらされたナタネの葉組織1グラムあたりの可溶性過酸化水素の量（ n =16、 p 値=0.004）

脂質過酸化に対するIONの影響

MDAレベルを代理として使用した脂質過酸化は、IONを追加することで減少し、200 mgのIONを追加した植物の葉のMDAの平均濃度は36％低くなりました。同じモル濃度の鉄（III）イオンでポジティブコントロールを追加しました。ただし、変動が大きすぎて結論を出すことができませんでした。低イオン濃度の平均も対照よりも低く、ナタネの葉の脂質過酸化が減少する傾向を示しています（図6）。

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イオンを含む養液で処理し、5日間干ばつしたナタネの葉の脂質過酸化生成物MDAの濃度（ n =8、 p 値=0.052）

植物粒子の取り込み

葉組織への粒子の取り込みを調査するために、誘導結合プラズマ原子発光分析（ICP-AES）を使用して葉の鉄含有量を測定しました。実際、マグヘマイトナノ粒子による処理では、統計的に有意な鉄の増加が観察されました。興味深いことに、余分な鉄（III）イオンで灌漑された葉では、鉄の濃度が低下しました（図7）。

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マグヘマイトナノ粒子で処理した後の真鍮植物の葉の鉄濃度は、同じ養液または1：1 Mの鉄（III）イオン比の同じ養液で対照と比較したものです。異なる文字は統計的に有意な差を示します（ n =15）

粒子の取り込みの証拠として鉄含有量の増加をさらに裏付けるために、同じ葉の低温磁化を測定しました。強い磁場下での制御では、より大きな磁化が観察されましたが、磁場がない場合、残留磁化は、マグヘマイトナノ粒子で処理された葉でより大きくなりました（図8および9）。サンプルサイズが小さく変動が大きいため、統計的に有意な差はありませんが、高磁場下での制御では磁化が高く、磁場がない場合は磁化が低くなるため、傾向は超常磁性IONの存在を明確に示しています。変動によって曇っていますが、特定のサンプルでは、​​IONの存在がはっきりと見えました（追加ファイル1：図S2）。一方では、十分に低い温度と十分に高い磁場では、鉄イオンの磁化はフェリ磁性イオンの磁化よりも大きくなります。一方、同じ低温で磁場がゼロの場合、ナノ粒子の磁気モーメントがブロックされるため、イオンの残留磁化は大きくなります。

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対照植物と比較した、マグヘマイトナノ粒子で処理された植物の灰の葉の低温（2 K）磁化。エラーバーは平均の標準誤差を示します（ n =6）

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さまざまな磁場下での灰の葉の低温（2 K）磁化。上記の10000Oeのプロットには、 p があります。 値は0.8で、ゼロフィールドでの以下のプロットには p があります。 0.08の値（ n =6）

材料の特性評価

Cuiらの方法によって生成されたION。 （2013）ゲルを形成し、約1〜10 snmのナノ粒子の生成が成功したことを示しています。乾燥したゲルを粉砕して粉末にした。低解像度のSEMは個々の粒子を表示できませんが、粉末の階層構造は明らかです。サンプルのEDSはYを検出せず、鉄のみを検出しました（図7）。

水に分散すると、粒子は最大500 nmの流体力学的サイズの凝集体を形成しますが、凝集した粒子の84％は300 nm未満であり、少なくとも11％は50nm未満です。 Nanosightの測定によると、絶対値には4.28×10 ⁶ があります。 20 nm ml ^-1 未満の粒子 、測定に必要な50倍希釈分散液（図8）。逆算すると、約2×10 ⁸ があることを意味します。 20 nm ml ^-1 未満の粒子 治療で。

AFMで作成された画像は、NTAとXRDビデオを組み合わせたものと同様のパターンを示しており、粒子サイズは数ナノメートルから数百ナノメートルの集合体まであります（図9）。

粒子のXRDは、製造から1年後に取得されましたが、マグヘマイト構造の明確なパターンを示しており、マグヘマイトの安定化が成功した証拠です（図10）。結晶子サイズは、Scherrerの式を使用して3.8nmと計算されました。構造は保存されていますが、もちろん、重量でYの13％を導入すると、原子の振動状態に影響を与えます（追加ファイル1：図S3）。

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γ-Fe ₂ の走査型電子画像 O ₃ イットリウム指向のゾルゲル合成と同じ材料のEDSスペクトルによって合成された

ディスカッション

鉄肥料としてのIONの提案された使用は、他のシステムで以前に調査されました[17、18、19]。この調査では、重要な作物種に微量栄養素である鉄を供給する効果に加えて、同様の肥料の酵素効果があるかどうかを初めてテストしました。対照には適切な量のキレート鉄が与えられた。また、モル当量の鉄（III）イオンを、適切な量の植物が利用できる鉄で負のコントロールに追加したポジティブコントロールもテストしました。したがって、私たちの実験で見られたIONからのプラスの効果は、IONの特性から生じます。作用しているのは、イオンの既知の酵素効果であると示唆したい[23、25、26]。他のメカニズムを排除することはできません。IONはタンパク質、脂質、および他の生体分子と相互作用する可能性があります[27]。または、ナノ粒子が天然の鉄イオンを表面に吸収し、有害なフェントン反応を低減する可能性があります。葉の過酸化水素レベルがION処理で減少したという事実は、それ自体がナノ粒子の取り込みの間接的な証拠です。鉄の濃度の増加とマグヘマイトの磁化の変化とともに、画像はより完全になります。鉄（III）イオンによるポジティブコントロールでは、葉の鉄含有量が減少しました。これは、植物が防御メカニズムとして鉄イオンの取り込みを減少させる能力を持っていることを示しています。これはさらに、マグヘマイト処理における葉の鉄濃度の増加は実際にナノ粒子であり、高レベルの鉄イオンほど植物に毒性がないことを示唆しています。磁気測定は、非常に小さいγ-Fe ₂ に典型的な、低温での超常磁性挙動とブロックされたナノ粒子磁気モーメントを示しています。 O ₃ マグヘマイトで処理された葉[28]で、ナノ粒子の取り込みを明確に示しています。投与されるYのごくわずかな量は、植物に何の影響も与えないはずです。 Yが植物に及ぼす影響についてはほとんど知られていないが、Fu etal。 （2014）2 mg L ^-1 Yは、水耕栽培システムにおける半数致死量（LD50）であり、Maksimovic etal。 （2014）10 ^-5 で毒性作用が見られ始めました mol L ^-1 Y [29、30]。実験で使用した最高濃度では、およそ50 mg（5.6 10 ^-4 土壌への灌漑により、ポットごとに1モル）のYが添加され、そこからはほんの一部しか吸収されないと予想されます。取り込まれたものは、イオンとして容易に利用できるのではなく、マグヘマイト粒子に結合している必要があります。 Yを合成に導入する目的は、マグヘマイトナノ粒子の溶解度を低下させ、酸化鉄の酵素性の低い形態であるヘマタイトへの変換を防ぐことです。間違いなく、ストレス状態の全範囲がH ₂ の有毒な蓄積を引き起こすことが知られているので、ストレス状態の間にカタラーゼ活性を増加させることは有益です[31]。 O ₂ [32] _。 さらに、H ₂ O ₂ ストレスのシグナル伝達分子としても機能します[32、33]。バイオマス生産の増加はまだ裏付けられておらず、できれば油糧種子の収量と品質も調べています。葉の成長速度の向上、雑草との競争が重要な農業環境での非常に優れた特性などの他の特徴は、容易に考慮に入れることができます。 シロイヌナズナに表示されています そのナノゼロ価鉄粒子は、葉のアポプラストへのプロトンの押し出しを誘発し、それによって膨圧駆動の細胞壁拡張を可能にすることができます[34]。同じ効果が根でも観察され、干ばつストレスの際にも有益である可能性があります[35]。彼らはまた、水分損失につながる可能性のある葉の気孔開口部の増加を観察しましたが、彼らが測定したとき、対照と比較してわずかな違いしかありませんでした。気孔の開口部と水の蒸散量の関係が線形ではないことは、既知のパラドックスです[36]。この関係は、相対湿度や風などの環境にも大きく影響されます[37]。もちろん、ゼロ価のナノ粒子はマグヘマイトと同じとは見なされませんが、私たちの実験で見られた葉の伸長のメカニズムを調査する必要があります。 Ghafariyan etal。 （2013）私たちが行ったように、鉄をまったく含まないネガティブコントロールと比較して、IONの添加時に葉のクロロフィル濃度の増加を観察しました。キレート鉄と比較した場合、違いはありませんでした。ただし、イオンと同量のキレート鉄を追加すると、粒子の場合、鉄の大部分が結晶構造に保存されるため、植物が利用できる鉄が増えます。したがって、植物は実際に鉄欠乏に苦しんでいるイオンでのみ施肥された可能性があります。キレート鉄の補助としてIONを追加すると、葉に含まれるクロロフィルの量が多くなりました（SPAD測定によると、図1を参照）。また、IONを追加した場合、干ばつ後の葉の過酸化水素とMDAの量の減少を測定しました。 Rui etal。 （2016）過酸化水素を測定しませんでしたが、酸化ストレスに関連するMDAと酵素を測定しました。彼らは、イオンの添加によって酸化ストレスが発生しないことを示唆しました。実際、10 mg kg ^-1 では、キレート鉄と比較して、葉のMDAの量が減少していることもわかりました。 集中。根では、彼らはIONの濃度を増加させるにつれてMDAの減少を見ました。彼らはまた、キレート鉄と比較して減少した量のスーパーオキシドジスムターゼおよびペルオキシダーゼ活性を測定し、IONがinvivoで活性酸素スカベンジャーとして機能できるという我々の仮説が正しいかもしれないことを示唆している。活性酸素除去は、セイヨウアブラナの葉で測定された過酸化水素の減少によってさらに実証されました。 。これは、IONの追加時に観察される干ばつに対する耐性の増加を説明しています。

結論

私たちの実験は、植物でナノザイムとして作用するIONのメカニズムの証拠を提供しました。 、セイヨウアブラナの葉の過酸化水素含有量の減少の間の結合を明らかにする とIONの導入。したがって、IONの添加時に観察される干ばつに対する耐性の増加は、酸化ストレスの緩和に関連している可能性があります。

メソッド

実験条件と設計

セイヨウアブラナ 春の菜種Larissa（Scandinavian Seed AB、Lidköping、スウェーデン）の種子を寒天プレート上で3日間滅菌および発芽させた後、同様のサイズの苗を滅菌S-Soil（Hasselfors garden、スウェーデン、オレブロ）のポットに移しました。 。これは、すべてのマクロ栄養素とミクロ栄養素が少量で、通気用のパーライト、成長を刺激するフミン酸、pH 6の苗木の専門的な成長のための土壌です。植物は、脱イオン剤で灌漑され、7日間ポットに定着させられました。水。処理が開始される前に、植物はトレイの間に分配されたので、植物のサイズは可能な限り一貫していました。 7日目から、鉢に移した後、植物を養液、余分なFeCl ₃ を含む養液で灌漑しました。 またはγ-Fe ₂ の濃度が異なる栄養溶液 O ₃ イオン。各ポットは毎日40mlで灌漑されました。植物は、16時間の光（180μEm ^-2 ）を備えた成長チャンバーで成長しました。 s ^-1 ）と8時間の暗闇。温度は、照射中は25°C、暗闇では22°C、相対湿度は65％に設定されました。植物は、それぞれ8つの鉢を収納するトレイの8×8cmの鉢で育てられました。すべての処理には、2つのトレイと16の生物学的複製がありました。トレイは、チャンバー内の変動を補正するために、毎日回転する順序で移動されました。治療は5日間続けられ、合計200 mlの0.5、0.8、1、または2 mg ml ^-1 が追加されました。 、植物ごとにそれぞれ合計100、160、200、または400mg。 IONを追加してから5日後、4日間の干ばつが始まる前に、さらに5日間、すべての処理に養液を与えました（追加ファイル1：表S1）。 4日間の干ばつの後、過酸化水素と脂質過酸化の測定を行い、植物に同じ養液を3日間再度与えて、回復を調べました。実験は4回繰り返されました。

ナノ粒子の合成と特性評価

マグヘマイト粒子は、[38]の方法に従って、約13％の重量のイトリウム（Y）を使用して生成され、X線回折（XRD）、走査型電子顕微鏡（SEM）、ナノ粒子追跡分析（NTA）、赤外分光法によって特徴付けられました。 （FTIR）、熱重量分析（TGA）、および原子間力顕微鏡（AFM）。 SEM画像は、Hitachi TM1000とOxfordμDeX電子分散型X線分光計（EDS）を使用して取得しました。流体力学的サイズは、Nanosight 300のナノトラッキング分析（NTA）によって測定されました（図11）。 Perkin-Elmer Spectrum 100を使用して、臭化カリウム（KBr）ペレットでフーリエ変換赤外分光法（FTIR）を実行しました。熱重量分析（TGA）には、Perkin-Elmer Pyris 1を使用し、原子間力顕微鏡（AFM）には、Bruker FastScanを使用しました（図12）。 XRDは、モリブデン源を備えたBruker SmartApexII多目的回折計で実行されました。結晶子サイズは、Originソフトウェアのピークファインダー関数によって計算された半値全幅（FWHM）1.01358489355378で、2θ°の角度16,197で最大ピークを使用してシェラー方程式で計算されました（図13）。乾燥したIONを、3.4 mg L ^-1 の栄養溶液に懸濁しました。 対照として使用されるのと同じキレート鉄。すべての栄養素の完全なリストについては、追加ファイル1：表S1を参照してください。

NTAで測定したγ-Fe ₂ の水中の流体力学的粒度分布 O ₃ イットリウム指向のゾルゲル合成によって合成されます。値は4回の繰り返し測定から平均され、細い線内の領域は平均誤差を表します

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イットリウム指向のゾルゲルを介して合成され、シリコンウェーハ上に分散され、AFMで画像化されたマグヘマイトナノ粒子。同じ画像が3Dと2Dで表されます

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生成されたマグヘマイトナノ粒子の粉末回折図。ピークは、データベースの標準的なマグヘマイトの位置と一致しており、図の下部にドロップラインのあるポイントとして表示されます。結晶子サイズは、16.197 2 θの最大ピークから計算されました。 角度

植物の形質の測定

処理を開始する前に、各植物の最も長い葉、最初の本葉の長さを測定しました。その後、養液または養液のみのIONで5日間連続して灌漑した後、同じ葉を再度測定しました。結果はパーセンテージの増加として報告されます。葉のクロロフィルは、ミノルタSPADメーターを使用したSPAD測定により、処理前と処理後、およびその後の干ばつ後に評価されました。植物ごとに2枚の葉で、16回の生物学的複製のそれぞれについて3回の測定値を平均しました。最後に、すべての植物の地上部バイオマスを計量し、アルミホイルに入れて110°Cで72時間乾燥させました。

鉄含有量と磁気測定

5日間の干ばつの後、実験は終了し、地上の植物組織はすべて450°Cで24時間灰化されました。灰を均質化した後、サンプルごとに10 mgを秤量し、シェーカーで36％塩酸3mlに一晩溶解しました。次に、サンプルをMilli-Q水中の10％エタノール44.74 mlで希釈し、続いて238.204nmでICP-AESを使用して鉄を測定しました。磁気測定では、同じ灰をサンプルホルダーに入れ、各サンプルの正確な重量を精密天秤で計量しました。次に、サンプルを2 Kに冷却し、超伝導量子干渉計（SQUID）磁力計で10,000から0エルステッドまでの磁場掃引を実行しました。サンプルホルダーによる磁気モーメントは、サンプル中の鉄の重量で正規化する前に、測定された磁気モーメントから差し引かれました。

過酸化水素の測定

葉の過酸化水素は[39]によって報告されたeFOX法によって測定されました。 16の植物は、それぞれ4つの植物を持つ4つの生物学的複製にプールされました。各植物の最も若くてまだ新鮮な葉から50ミリグラムを採取しました。次に、200 mgの葉の材料を、液体窒素で予冷した乳鉢で粉末化しました。粉末に、4mlの100mMリン酸緩衝液（pH 6.9）を加え、氷をモルタルで均一な液体にしました。この均質な液体から、1900μlを2 mlのエッペンドルフチューブに移し、20μlの25 mM硫酸第一鉄アンモニウム（モール塩）、20μlの10 mMソルビトール、20μlの10 mMキシレノールオレンジ、20μlの99を加えました。 ％エタノール、および20μlの250mM硫酸。各サンプルの完全な可視吸収スペクトルを取得しましたが、過酸化水素の定量には550nmと800nmの差を使用しました。 R を使用して、2〜40μMの過酸化水素の検量線を作成しました。 ² 0.9946の値。

脂質過酸化

脂質過酸化反応は[40]の方法で測定した。サンプルは、過酸化水素測定の場合と同じ方法で収集されましたが、4 mlの0.1％ w で均質化された点が異なります。 / v トリクロロ酢酸（TCA）。 532 nmで吸光度を測定し、600nmでの吸光度を差し引くことで非特異的な濁度を補正しました。 155 mM cm ^-1 の吸光係数 マロンジアルデヒド濃度（MDA）の計算に使用されました。

統計分析

すべての統計はMinitab17ソフトウェアで実行されました。すべてのデータは、グループ化のためのフィッシャーの直接確率検定を使用した一元配置分散分析を介して実行されました。学生の t 特定の p を見つけるためにテストが実行されました 統計的に有意な差があることがわかったグループ間の値。