一対のアプタマーを使用したサンドイッチイムノフローストリップアッセイによるロンガライトの迅速な検出

要約

金ナノ粒子（AuNPs）で機能化された2つのアプタマーを使用したサンドイッチイムノフローストリップアッセイ（LFSA）は、農産物中のロンガライトの存在を評価するために設計されました。より具体的には、ストレプトアビジンでコーティングされた膜に固定化されたビオチン標識一次A09アプタマー、およびAuNPと結合した二次B09アプタマーが、それぞれ捕捉プローブおよびシグナル伝達プローブとして開発されました。このシステムにより、LFSAコントロールとテストラインの色の変化を観察するだけで、1μg/ mLという低濃度の食品サンプル中のロンガライトを正しく直接検出できます。

背景

ロンガライト（ヒドロキシメチルスルフィン酸ナトリウム）は、還元剤として建染[1]または乳化重合[2]に通常使用される工業用試薬です。ロンガライトは、ウォーターコンディショナー（塩素やクロラミンの還元など）[3]、ホルムアルデヒド（ヒトの発がん性物質として知られている）の生成にもかかわらず市販の化粧品のヘアカラーリムーバー、または抗酸化剤としての製剤にも含まれている可能性があります[4]。。この化合物は、いくつかの農産物に組み込まれた後、中国でも悪影響を及ぼしました[5]。この開発されたアッセイは、信頼性の高いオンサイトのロンガライト検出プラットフォームを提供し、食料安全保障の問題の解決に貢献できます。

アプタマー、一本鎖オリゴヌクレオチド、およびオリゴペプチドは、それらの高い特異性、容易で再現性のある生成、容易な修飾、および免疫原性応答が少ないため、抗体の完全な代替物と見なされてきました[6]。最近の研究は、薬物標的化、バイオセンシング、および新薬の開発のためのバイオプローブとしてのアプタマーの強力な可能性を明らかにしました[7]。いくつかのアプタマーを含む電気化学的[8]および酵素結合アプタマー[9]アッセイは、ロンガライト検出のための有望なツールとして開発されました。ただし、これらのメソッドは通常、長い分析時間と複雑な手順に悩まされており、アプリケーションの妨げになります[10]。

横方向フローストリップアッセイ（LFSA、ストリップテストとも呼ばれる）は、ラテックス凝集テスト技術の論理的拡張として1956年に最初に開発されました[11]。シングルステップアプローチとして、LFSAは、その使いやすいフォーマット、低い製造コスト、時間節約の使用、および幅広い条件での長期安定性により、複数の分析物のオンサイト検出で大きな注目を集めています[ 12]。これらの肯定的な特徴にもかかわらず、アプタマーベースのイムノフローストリッププラットフォームの実用的なアプリケーションはまだ商品化されておらず、食品サンプル中のロンガライトの検出について報告されているアプタマーベースのクロマトグラフィーストリップアッセイはごくわずかです[13]。。食料安全保障問題の発生率が高く、違法な食品添加物としてロンガライトが一般的に使用されていることを考慮すると、食品サンプル中のこの化合物を現場で迅速に検出するためのアプタマーベースのLFSAを開発する必要があります。

イムノクロマトグラフィーアプタマーセンサーには、競合型とサンドイッチ型の2種類があります[14]。サンドイッチタイプのプラットフォームは、特定のターゲット分子に2つのアプタマーが利用できる場合に非常に適しています。本研究では、アプタマーセンサー開発（例えば、物理化学的特性）のための最も有望なナノ材料であることが知られている特定の金ナノ粒子（AuNPs）を、横流サンドイッチストリップアプタマー検出プローブの開発に使用しました。一方、アプタマー結合プロセスは、化学吸着または物理吸着を介してAuNPで以前に実証されており、この研究で後でシグナル伝達プローブとして使用されたアプタマーセンサーにシンプルでありながら感度の高いプラットフォームを提供します[15]。 AuNPとアプタマーの使用に由来する利点により、食品サンプル中のロンガライトの分析のために、目に見える、迅速な、ワンステップのオンサイトイムノフローアッセイが開発されました。このサンドイッチ型アプタマーセンサーを実現するために、2つのアプタマープローブ（A09 / B09）をキャプチャおよびシグナリングプローブとして使用しました。このバイオセンサーの肯定的な結果は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によってさらに確認されました。

メソッド

材料と試薬

ロンガライトは東京化成工業株式会社から提供されました。HAuCl₄ （クエン酸三ナトリウム二水和物）はSigma Aldrich（USA）から購入しました。 NaCl、BSA、スクロース、ホルマリン、PEG20000、およびTween20は、Beijing Biotopped Science and Technology Co.、Ltd。から入手しました。

NCメンブレン（つまり、ポール90、ポール170、およびミリポア135）は、ポールコーポレーションとミリポアコーポレーションから別々に入手され、Jiening BiotechCompanyから購入されました。

食品サンプル、ersi（中国では薄切りの四角い餅）、麺、豆腐、グルコノ-δ-ラクトン豆腐は、近くの市場から購入しました。

指数管内進化法（SELEX）によるリガンドの系統的進化によるアプタマーの準備

SELEXプロセスは、次のステップで構成されます（図1）：（ i）ランダムDNAライブラリーを使用したターゲットのインキュベーション、（ii）ターゲットに結合したDNAの分離、（iii）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNA増幅、（iv）次のラウンドのライブラリー用の一本鎖DNAの準備、（v）非特異的ssDNAを除去するための非標的物質によるインターバルカウンタースクリーニングを含む5〜15サイクルのステップi〜ivの繰り返し、および（vi）濃縮されたライブラリーの最終的なクローニングとシーケンシング[16]。

アプタマーは、前述の手順に従ってスクリーニングされました。簡単に説明すると、各アプタマーの中央の40ベースの長いランダム化配列を持つ82-merヌクレオチドからなる最初のssDNAアプタマーライブラリーを合成しました（Tsingke BiologicalTechnology）。 ssDNAアプタマープールのランダム化された配列は5'-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N40-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3 'であり、NはA、G、C、またはTのいずれかのランダム化されたヌクレオチドを意味します。

この研究では、プライマー1（5'-GACATATTCAGTCTGACAGC-3 '）とプライマー2（5'-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3'）をライブラリーの増幅に使用しました。

ロンガライトに特異的に結合するアプタマーをスクリーニングするために、合成されたランダムssDNAライブラリーをロンガライトとともにプレートに添加しました。次に、結合していないssDNAを洗浄して除去しました。結合したssDNAを回収し、PCRで増幅しました。アプタマーの結合親和性は、選択ラウンドが増加するにつれて徐々に増加しました。

特異性と K _d 個々のアプタマーの値は、Tangの方法[17]と同様に決定されました。

この作業で使用されたアプタマー配列は次のとおりです。

一次アプタマーA09、

5'-ビオチン-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
二次アプタマーB09、

5'-ビオチン-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3 '

これらのアプタマー配列（A09およびB09）は、Tsingke BiologicalTechnologyから合成および購入されました。

AuNPの作成

AuNPは、HAuCl ₄のクエン酸還元によって合成されました。プロトコル[18]。適切なサイズのAuNPの単分散生成は、UV / Vis分光光度法（ThermoScientific™Evolution 60S）によって確認されました。球形（直径約40 nm）で深紅色のAuNPが合成されました。これらの未修飾AuNPのサイズは、530±2 nmのランベルトベールの法則と透過型電子顕微鏡（図2）（JEOL Ltd. JEM-1011）を使用して推定されました。

AuNPと結合した二次アプタマーB09は、報告されているプロトコル[18]に従って調製しました。簡単に説明すると、1 mLの調製したままのAuNPを4μLの二次アプタマーB09溶液（100μM）とインキュベートし、混合物を引き出しに室温で少なくとも16時間保存しました。続いて、混合物の最終濃度が0.1 Mになるまで、穏やかに手で振って1モルのNaClをバイアルに滴下しました。バイアルは、使用前に少なくとも1日間引き出しに保管されていました。非結合のチオール化アプタマーは、12,000 g での遠心分離によって除去されました。 4°Cで20分間。遠心分離機からチューブを取り外し、ナノ粒子がチューブの底にある透明な上澄み液が得られた。上澄みが赤色の場合は、混合物をさらに5分間遠心分離しました。上澄みを静かにピペットで取り除き、ナノ粒子を最終的に5％BSA、5％スクロース、1％PEG20000、および0.05％Tween20を含む1mLの0.01M PBS（リン酸緩衝生理食塩水）バッファー（pH =7.4）に分散させました。

横方向フローストリップの設計

LFSAは、図3に示すように設計されました。簡単に説明すると、ストリップには、バッキングカードサンプル（GF-08、20×300 mm）、金コンジュゲート、ニトロセルロース（NC）メンブレン（ポール90、60×300）にいくつかの重なり合うパッドが含まれていました。 mm）、および吸収（H-5076、20×300 mm）パッド。オーバーラップの長さは2mmでした。サンプルパッドを、3％BSAと0.05％Tween20を含む0.01 M PBSバッファー（pH =7.4）に浸し、37°Cで2時間乾燥させました。金コンジュゲートパッドは、5％BSA、5％スクロース、1％PEG20000、0.05％Tween20を含む0.01 M PBSバッファー（pH =7.4）で処理しました。続いて、機能的なAuNPを、処理された金コンジュゲートパッドに噴霧器（XYZ3010-1429）で噴霧しました。 1マイクロリットルのビオチン-A09アプタマー（10μM）を10μLのストレプトアビジン（1 mg / mL）と4°Cで1時間インキュベートしました。続いて、アプタマー結合ストレプトアビジンをNCメンブレン上でディスペンサー（XYZ3010-1429）でライニングしてテストラインを形成し、ストレプトアビジン（1 mg / mL）を機器でライニングしてコントロールラインを形成しました。その後、処理したNCメンブレンを37°Cで2時間乾燥させ、固定化しました。最後に、ストリップを組み立て、LFSAを40 mm幅のストリップにカットし、使用するまで37°Cで一晩保存しました。

特異性テスト

組み立てたストリップのサンプルパッドに、80マイクロリットルのロンガライト溶液（10μg/ mL）を追加しました。このステップは、特異性テスト用のホルマリンと脱イオン水を含む他のカウンターターゲットに対して繰り返されました。対照として脱イオン水を使用した。予想される線で囲まれた領域に赤い線が表示されます。各コントロールを2回繰り返しました。

用量依存性テスト

特定のテストと同様に、さまざまな濃度（0.8、1、5、および10μg/ mL）のロンガライト溶液を調製しました。組み立てられたストリップのサンプルパッドに、80マイクロリットルのロンガライト溶液を加えた。テストラインで15分以内に赤色が観察されたことが、検出限界を決定するための基準と見なされました。

食品サンプルテスト

この新しいLFSAの実用性と精度を評価するために、追加されたロンガライトを含む可能性のある5つの食品サンプルが研究所周辺の市場から収集されました。 1グラムのサンプルを10mLの水で抽出しました。次に、80μLの各サンプル抽出液をアプタマーベースのイムノフローストリップにアプライして、ロンガライトを検出しました。これらの結果は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって確認されました。

結果と考察

特異性と解離定数（ K _d ）選択されたアプタマーの

異なる濃度のA09およびB09アプタマーを一定量のロンガライトとともにインキュベートしました。対応する入力アプタマー濃度に対して450nmで測定された吸光度をプロットした飽和曲線を図4aに示します。 K には、非線形回帰分析が使用されました。 _d 値の計算。 K _d A09の値は61.12±16.36nMで、B09の値は39.81±12.73nMです。図4bに示すように、A09 / B09とロンガライトの間の結合親和性は高いです。

特異性と感度

ビオチンで標識されたアプタマーA09（アプタマーを捕捉）は、最初に膜に裏打ちされたストレプトアビジンに結合しました。このラインがテストラインとして選択されました。その間、ストレプトアビジンはコントロールゾーンに配置されました。

図5aに示すように、AuNP二次アプタマー（シグナル伝達プローブとして）がロンガライトに結合すると、テストゾーンに並ぶ一次アプタマーはこの化合物の別の部位に結合します。陽性分析の場合、AuNPによって生成された赤い線がテストゾーンに表示されます。対照実験に関しては、対照ゾーンのストレプトアビジンは、ビオチンで修飾された残りのAuNP標識B09アプタマーを捕捉し、それによって常に対照シグナルを提供します。

図5bに示すように、結果は、ロンガライトが1μg/ mLという低い濃度で肉眼で簡単に検出されたことを示しています。

これらの食品サンプルは、ここで開発されたLFSAを介して分析され、結果は表1に示されています。

<図>

興味深いことに、コントロールラインは各LFSAの後に維持されませんでした。ロンガライトまたは塩イオンの濃度が高いと、コントロールゾーンで信号が弱くなる可能性があります。したがって、再懸濁バッファーの組成は、ストリップテストのパフォーマンスに重大な影響を及ぼします。得られた結果によると、5％BSA、5％スクロース、1％PEG20000、0.05％Tween20を含む0.01 M PBSバッファー（pH =7.4）を再懸濁バッファーとして選択しました。

さまざまなパッドの組成は、ストリップアッセイのパフォーマンスに劇的な影響を及ぼします。さまざまな選択肢の中で、NCメンブレンが核酸の吸着とハイブリダイゼーションに最も適した固体支持体であることがわかりました。 NCは、十分な流量を提供するため、横方向フローストリップの信号パッドとして広く使用されています[19]。これらのアッセイには、それぞれの流量の異なるサイズタイプのNCメンブレンが適しています。この作業では、Jiening Biotech Companyから購入した3つの一般的に使用されるNCメンブレン（つまり、ポール90、ポール170、およびミリポア135）をテストしました。ここでは、LFSAに最も適したNC膜としてポール90が選択されました。

ロンガライト検出のために多くの技術が開発されてきました。ただし、主に関連する高コストと、日常のオペレーターにとって面倒なGCやHPLCなどの複雑なプロトコルのために、オンサイト検出に広く適用されているものはほとんどありません。シングルステップアプローチであるLFSAは、そのユーザーフレンドリーなフォーマット、低い製造コスト、および利便性により、完璧なプラットフォームになりました。クロマトグラフストリップよりも感度が悪いにもかかわらず、LFSAはポイントオブケア検査の分野で有望な方法です。

LFSAは、クロマトグラフストリップよりも感度が低くなります。さらに、アプタマーを使用するLFSA技術は、この分野の最近の進歩に関係なく、イムノクロマトグラフィー（LFIA、抗体ベースの方法）に比べていくつかの固有の利点を示しています。同様のアッセイは抗体を使用して設計することもできますが、アプタマーセンサーは安定性と低コストの利点を提供します。さらに、アプタマーは、分子内および分子間ハイブリダイゼーション、酵素複製、および容易な配列決定特性を有する核酸で構成されているため、さまざまなフォーマットを開発するためにより柔軟です。これらの肯定的な特性のおかげで、マルチプレックスアッセイ用に多数のアプタマーセンサーが開発されました。

さらに、LFSAは、最近開発された量子ドット[20]やアップコンバートリン光物質[21]などのさまざまなラベルを使用できます。ただし、報告されているすべてのラベルの中で、AuNPはLFSAに最も広く使用されています。 Auラベルの最も顕著な特性は、肉眼で直接観察できるNCメンブレンを着色できることにあります。この特性により、LFSAは現在の高価な実験方法とは異なり、このテクノロジーは便利な分析ツールになっています。

ポイントオブケア検査（POCT）は、これらのアッセイのコストを削減するための理想的なツールとして提案されています。最も広く知られているアッセイであるLFSAバイオセンサープラットフォームは、現在POCTに使用されています[22]。 LFIAバイオセンサープラットフォームには、主にサンドイッチ形式と競合（または抑制）形式が含まれています。一般に、サンドイッチ形式のアッセイは、少なくとも2つのエピトープを持つ標的分子の場合に設計されます。サンドイッチ型フォーマットで組み立てられた捕捉およびシグナル伝達プローブを含む、2つの異なる結合部位でロンガライトに結合したデュアルアプタマーが本明細書で開発された。

結論

サンドイッチ形式の簡単で低コストのLFSAは、ロンガライトの現場での迅速な検出のために開発に成功しました。このアッセイには、AuNPと結合した2つのアプタマーが含まれていました。いくつかの重要なパラメータを最適化した後、開発されたアッセイは、1μg/ mLという低い検出限界値で高感度を提供しました。この技術は、ロンガライトによる食品サンプルの汚染を研究するために簡単に使用できます。このアッセイは、信頼性の高いオンサイトのロンガライト検出プラットフォームを提供し、食料安全保障の問題の解決に貢献できます。