アプタマー・サンドイッチ法による食品中ロンガライトの迅速現場検出ストリップアッセイ

概要

食品添加物として不正使用される有害試薬ロンガライト（次亜硫酸ナトリウム）を検出する、迅速かつユーザーフレンドリーなラテラルフロー・ストリップアッセイ（LFSA）を提案します。金ナノ粒子（AuNPs）で標識した2種の高特異性アプタマー（A09、B09）を用います。ビオチン標識A09アプタマーをストレプトアビジン固定化ニトロセルロース膜に捕獲プローブとして固定化し、AuNPs共役B09アプタマーをシグナルプローブとして使用します。本アッセイは、ロンガライト濃度1 µg mL⁻¹でテストゾーンに明確な赤線を呈し、肉眼で15分以内に観察可能で、農産物・食品の現場スクリーニングに最適です。

背景

ロンガライトは工業染色とポリマー化学で還元剤として広く使用されています。しかし、食品への偶発的または意図的な混入が、ホルムアルデヒド放出などにより中国で深刻な健康被害を引き起こしています[5]。食品安全と公衆衛生を守るため、信頼性が高く迅速な検出法が不可欠です。

アプタマー（一本鎖DNAまたはRNA）は抗体に比べて明確な利点があります：化学合成による高いロット間一貫性、低免疫原性、多様なセンシングプラットフォームへの容易な修飾[6]。ロンガライト向け電気化学的および酵素連結アプタマーアッセイは存在しますが、複雑な装置と長い分析時間を要することが多い[10]。対照的に、ラテラルフロー・ストリップアッセイ（LFSA）は、ワンステップ、携帯可能、低コストでポイント・オブ・ケア検査に適したソリューションを提供します。

これまで、ロンガライトを標的としたアプタマー・ベースのクロマトグラフィー・ストリップアッセイはごく少数です[13]。規制強化と不正添加物の蔓延を受け、2種のアプタマーの特異性とAuNPsの光学的明確性を活用したサンドイッチ型LFSAを開発し、多様な食品マトリックス中のロンガライトを迅速かつ現場で検出可能にしました。

方法

材料と試薬

ロンガライトは東京化成工業株式会社製。四塩化金(III)酸三水和物（HAuCl₄）とクエン酸三ナトリウムはSigma‑Aldrich（米国）製。補助試薬（NaCl、BSA、スクロース、PEG₂₀₀₀₀、Tween‑20）は北京バイオトップド科学技術有限公司製。ニトロセルロース（NC）膜（Pall 90、Pall 170、Millipore 135）はPall CorporationとMillipore Corporation製をJiening Biotech Company経由で入手。食品サンプル（餅、麺、豆腐、グルコノ-δ-ラクトン豆腐）は地元市場で採取しました。

SELEX法によるアプタマー調製

ロンガライトに対する高親和性アプタマーを分離するため、リガンドの指数関数的増殖による系統的進化（SELEX）プロトコルに従いました。初期82-mer ssDNAライブラリ（5′‑GACATATTCAGTCTGACAGCG‑N₄₀‑GATGGACGAATATCGTCTAGC‑3′）をロンガライトとインキュベートし、非結合配列を洗浄除去、結合アプタマーをPCRで増幅。構造関連化合物に対するカウンター選択を含む12サイクルの濃縮後、クローンシーケンシングにより2種の高親和性アプタマーA09とB09を同定しました。配列は以下の通りで、Tsingke Biological Technologyで合成しました。

• 一次アプタマーA09（ビオチン標識）：5′‑Biotin‑GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
• 二次アプタマーB09（ビオチン標識）：5′‑Biotin‑GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC‑HS‑3′

AuNPsの調製

標準プロトコル[18]に従い、HAuCl₄のクエン酸還元により金ナノ粒子（~40 nm径）を合成しました。サイズと単分散性はUV/Vis分光（λ_max ≈ 530 nm）と透過型電子顕微鏡（TEM）で確認しました（図2）。二次アプタマーB09をAuNPsに共役化するため、1 mL AuNP溶液に4 µLの100 µM B09をインキュベートし、塩析沈殿、遠心分離、再懸濁（1 mL PBS、pH 7.4、5% BSA、5% スクロース、1% PEG₂₀₀₀₀、0.05% Tween‑20含有）を行いました。

ラテラルフロー・ストリップ設計

LFSA組み立て（図3）は、サンプルパッド、金共役パッド、NC膜（Pall 90）、吸収パッドをバッキングカード上に配置。サンプルパッドはPBS + 3% BSA + 0.05% Tween‑20で前処理し、37 ℃で2時間乾燥。金共役パッドにB09‑AuNPsを塗布。NC膜上のテストラインは、ビオチン‑A09（10 µM）1 µLとストレプトアビジン（1 mg mL⁻¹）10 µLを混合し、4 ℃で1時間スポッティングして作製。コントロールラインはストレプトアビジン単独で構成。乾燥後、ストリップを40 mm幅に切断し、37 ℃で一晩保管しました。

特異性試験

テストストリップに、10 µg mL⁻¹ロンガライト、ホルマリン、または脱イオン水80 µLを挑戦させました。明確な赤色テストラインの出現で特異性を確認、コントロールラインは全条件で可視化されました。

濃度依存性試験

ロンガライト濃度（0、0.8、1、5、10 µg mL⁻¹）をPBSで調製し、各80 µLをサンプルパッドに適用。15分以内に可視赤線が出現した濃度を検出限界とし、1 µg mL⁻¹で観察されました。

食品サンプル試験

ロンガライト混入が疑われる5食品サンプルを抽出（1 g + 10 mL水）。ろ過後、各抽出液80 µLをLFSAで検査。結果を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で相互検証しました。

結果と考察

アプタマーの親和性と特異性

飽和曲線の非線形回帰（図4a）により、A09の解離定数61.1 ± 16.4 nM、B09の39.8 ± 12.7 nMが得られ、ロンガライトへの強力かつ特異的な結合が確認されました（図4b）。

図4. （a）A09とB09の結合曲線（Kd決定）。（b）アプタマーとロンガライトの高親和性相互作用。

アッセイ性能

サンドイッチLFSAは、AuNP‑B09がロンガライトと結合し、固定化A09によって捕獲されると赤色テストラインを生成します。余分なAuNP‑B09がストレプトアビジンと結合して形成されるコントロールラインがアッセイの完全性を確認します（図5）。ホルマリンと脱イオン水に対する特異性試験では偽陽性はなく、検出限界は1 µg mL⁻¹で確立されました。これは汚染食品サンプルで報告されるレベルより十分低い値です[5]。

図5. LFSAの特異性（a）と感度（b）。（a）10 µg mL⁻¹ロンガライト80 µL；（b）標準溶液（0–10 µg mL⁻¹）をテスト。

食品サンプル解析では、複数製品でロンガライトの存在が確認され、HPLCで裏付けられました（表1）。アッセイの堅牢性は、最適化バッファ（PBS pH 7.4 + 5% BSA + 5% スクロース + 1% PEG₂₀₀₀₀ + 0.05% Tween‑20）と、最適な流れと最小非特異的結合を提供するPall 90 NC膜の選択に起因します。

クロマトグラフィー法（GC、HPLC）と比較して、LFSAは同等の感度を提供しながら、高度な装置と長時間の処理を不要とします。低コスト、ワンステップ操作、目視判定により、現場食品安全検査と規制遵守に最適です。

結論

ロンガライトを食品マトリックス中で検出限界1 µg mL⁻¹で検出する、信頼性が高くコスト効率に優れたサンドイッチ型LFSAを開発しました。本アッセイは二重アプタマーの特異性とAuNPsの光学的明確性を活用し、即時現場スクリーニングを可能にします。このプラットフォームは、食品由来ロンガライト汚染の軽減と公衆衛生の保護に重要な役割を果たすことができます。

略語

AuNPs:

金ナノ粒子

HPLC:

高速液体クロマトグラフィー

LFIA:

ラテラルフロー免疫アッセイ

LFSA:

ラテラルフロー・ストリップアッセイ

NC membrane:

ニトロセルロース膜

POCT:

ポイント・オブ・ケア検査

SELEX:

リガンドの指数関数的増殖による系統的進化

TEM:

透過型電子顕微鏡