効率的な光線力学癌治療のためのセラノスティックナノエージェントとしてのカーボンドット@プラチナポルフィリンコンポジット

要約

光増感剤は疎水性の高い感光性分子であり、光線力学療法への使用に課題があります。したがって、PSの配信用のキャリアを開発するためにかなりの努力が払われてきました。ここでは、テトラ白金化ポルフィリン錯体（PtPor）と負に帯電したCQDの間の静電相互作用を介して、新しいセラノスティックナノエージェント（CQDs @ PtPor）を合成しました。準備されたままのCQDとCQDs @ PtPorのサイズと形態は、XRD、TEM、XPS、FTIR分光法などの一連の方法によって特徴づけられました。 CQDs @ PtPorコンポジットは、CQDの光学特性とポルフィリンの抗がん機能を1つのユニットに統合します。スペクトル結果は、CQDs @PtPor複合材料におけるCQDからPtPorへの効果的な共鳴エネルギー移動を示唆しました。印象的なことに、CQDs @ PtPor複合材料は有機分子PtPorよりも強いPDT効果を示し、¹ の効率の向上により、CQDs @PtPorが従来の製剤よりも有利であることを示唆しています。 O ₂ CQDによるPtPorの生産。したがって、このCQDベースの薬物ナノキャリアは、腫瘍抑制効果の向上とin vitroでの副作用の低さを示し、癌治療における重要な応用の可能性を示しています。

背景

光線力学療法（PDT）は、皮膚のいくつかの状態、加齢に伴う黄斑変性、および癌を含む多くの人間の病気の治療のための有望な非侵襲的治療法として広く実践されてきました[1]。 PDTは、単独で使用することも、手術、化学療法、または電離放射線と組み合わせて使用することもできます[2]。光線力学療法では、光増感剤（PS）に特定の波長の光が照射され、細胞内酸素から活性酸素種が生成され、その結果、細胞死と近位組織の壊死が引き起こされます[3,4,5,6]。光増感剤は通常、光がなくても無害であるため、腫瘍治療は選択的照明によって正確に標的化でき、周囲の健康な組織への損傷を制限します[7、8、9]。ポルフィリンやフタロシアニン誘導体などの活性化可能な光増感剤は、癌の画像化と治療の同時機能を備えていることが実証されており、これらの光増感剤のいくつかは臨床使用が承認されています[10、11]。しかし、それらの多くは、水溶性が低く、皮膚の感光性が長く、選択性が不十分であり、皮膚が最も透明な領域（> 700 nm）で吸収されないために制限されています。これは、多くの伝統的な臨床応用で遭遇します。化学物質。したがって、PSをリポソーム[12]、高分子ナノ粒子[13、14]、金ナノ粒子[15、16、17]、カーボンナノチューブ[18]、グラフェン[19]、炭素などの担体に組み込むための多くのアプローチが提案されています。ナノドット[20,21,22]。

最近、新しいタイプのカーボンナノ材料としてのカーボン量子ドット（CQD）は、優れた光学特性、優れた水溶性、低毒性、優れた生体適合性、優れた細胞透過性、容易な調製などの独自の特性により、大きな注目を集めています。と変更。したがって、CQDは、オプトエレクトロニクス、センシング[23、24]、セラノスティック[25、26、27]、およびバイオイメージングの分野で多くの有望なアプリケーションとして実証されています。過去数年の間に、水熱法、マイクロ波法、熱処理法、電気化学的方法など、さまざまなCQDを合成するための多くの方法が開発されてきました[28]。その中で、CQDを生成するために天然の前駆体を使用する熱水法は、そのグリーンケミストリーの性質のために広く報告されています[29、30]。

さらに、CQDは、その豊富な表面グループと妥当な生体適合性により、さまざまな分子のローディングプラットフォームになる可能性があります[31、32]。特に、さまざまな化学基で官能化された場合、CQDは、薬物分子、タンパク質、アプタマーなどのさまざまな機能要素を使用して、共有結合または非共有結合の相互作用により、さまざまな生物医学的用途に対応できます[33]。たとえば、2012年には、Huang etal。光増感剤共役カーボンドットに基づく新しいセラノスティックプラットフォームを設計しました。照射すると、調製されたCQD-Ce6は、Ce6単独と比較してより強い蛍光発光とより高い光線力学的効果を示しました[34]。 2014年、Choi etal。 ZnPcをロードしたFA結合CQDに基づいて同様のセラノスティックプラットフォームを開発しました[3]。同じ年に、王等。 TMPyPを無毒のCQDと静電的に接続することによってコンジュゲートを開発しました[35]。 2015年、Beack etal。 CQDs-Ce6-HAコンジュゲートを合成しました。これは遊離Ce6およびCQDs-Ce6よりもはるかに高い光線力学的効果を示しました[36]。

より最近では、新しいテトラ白金化ポルフィリン複合体がNaik etalによって報告されました。結果は、プラチナポルフィリンが暗闇でわずかな細胞毒性を示したが、IC ₅₀ 420nmのレーザー照射で19nMまで低下する値は、テトラ白金化ポルフィリン複合体が癌治療のための有望な抗癌剤であることを示唆しています[37]。しかし、合成されたテトラ白金化ポルフィリンは、低い生体適合性と水溶性を示したため、臨床使用が制限されていました。この目的のために、ここでは、テトラ白金化ポルフィリン錯体（PtPor）と負に帯電したCQD（スキーム1）の間の静電相互作用を通じて、新しいセラノスティックナノエージェント（CQDs @ PtPor）を開発します。 CQDs @ PtPorコンポジットは、CQDの光学特性とポルフィリンの抗がん機能を1つのユニットに統合します。スペクトル結果は、CQDs @PtPor複合材料におけるCQDからPtPorへの効果的な共鳴エネルギー移動を示唆しました。印象的なことに、CQDs @ PtPorは、PtPor単独の場合よりも強いPDT効果を示しました。これは、¹ のより高い効率に割り当てられている可能性があります。 O ₂ CQDによるPtPorの生成。さらに、CQDs @ PtPorのサイズが小さいと、EPR効果によって腫瘍部位に選択的に蓄積できる可能性があります。したがって、調製されたままのナノアグネット（CQDs @ PtPor）は、癌治療において大きな応用可能性を示しました。

メソッド

Trans-platinum diammine dichloride（transplatin）はAladdin®から購入しました。 1,3-ジフェニルイソベンゾフラン（DPBF）は、Sigma-Aldrichから入手しました。すべての溶媒はTianjinFu Chen ChemicalReagentsから購入しました。その他の化学薬品は、Sinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd。から購入し、受け取ったままの状態で使用しました。

[Trans-PtCl（NH ₃ ）₂ ] ₄ -5,10,15,20-テトラ（4-ピリジル）-硝酸ポルフィリン

トランスプラチン（0.193ミリモル、58mg）および硝酸銀（0.193ミリモル、33mg）を5mLのDMFに溶解した。２４時間のストリングの後、形成された白色の塩化銀を、遠心分離によって得られた濁った溶液から除去して透明な溶液を得、次にこれを５，１０，１５，２０－テトラ（４－ピリジル）ポルフィリンの懸濁液に加えた。（0.487 mmol、30 mg）3 mLDMF中。 50℃で48時間撹拌した後、混合物を室温まで冷却した。次に、１０ｍＬのジエチルエーテルを加えて赤色の沈殿物を得、これを次にメタノール、ジクロロメタン、およびジエチルエーテルで洗浄した。最後に、サンプルを真空下で乾燥させて、81mgの生成物を得た。収率86％。 ¹ H NMR（400 MHz; DMSO-d ₆ ）：δ9.45（d、8H）、9.14（s、8H）、8.52（m-ピリジル、d、8H）、4.70（NH ₃ 、s、24H）、− 3.04（s、2H）; MS（ESI）： m / z =1209 [M-3（NO ₃ ）-2 {PtCl（NH ₃ ）₂ }] ⁺ 、1074 [M-4（NO ₃ ）-2 {PtCl（NH ₃ ）₂ } -2NH ₃ -Cl-2H] ⁺ 、883 [M-4（NO ₃ ）-3 {PtCl（NH ₃ ）₂ }] ⁺ 、866 [M-4（NO ₃ ）-3 {PtCl（NH ₃ ）₂ } -NH ₃ ] ⁺ 、812 [M-4（NO ₃ ）-3 {PtCl（NH ₃ ）₂ } -Cl-2（NH ₃ ）] ⁺ 、574 [M-4（NO ₃ ）-2 {PtCl（NH ₃ ）₂ }] ²⁺ 。

CQDの準備

一般的に、クエン酸（0.45 g）とエチレンジアミン（500μL）をDI-水（10 mL）に溶解しました。次に、溶液をポリ（テトラフルオロエチレン）（テフロン）で裏打ちしたオートクレーブ（30 mL）に移し、200°Cで5時間加熱しました。反応後、反応器を水または自然に室温まで冷却した。褐色黒色の粗生成物を遠心分離機で30分間精製して凝集粒子を除去し、次に脱イオン水に対して透析してCDを得た。

CQDs @PtPorコンポジットの準備

ピリジン環に4つの正電荷を持つPtPor分子は、静電相互作用によって負に帯電したCQDの表面に結合し、CQDs @PtPor複合体を得ることができます。一般に、3mLのDMSOに溶解した20mgのPtPorを12mLの水に分散させました。溶液をCQD懸濁液にゆっくりと加えた（5mgのCQDを15mLのH ₂に溶解した。 O）超音波処理中。室温で24時間撹拌した後、溶液を遠心分離機で30分間精製して凝集粒子を除去し、次にDI水に対して2日間透析した。 CQDs @ PtPorの水溶液を4°Cで凍結乾燥し、目的の生成物を得ました。

CQDの量子収率の計算

CQDの量子収率は、硫酸キニーネを基準として測定されました（0.1 M H ₂ SO ₄ 水溶液、蛍光量子収率〜54％）次の式で：

$$ \ upvarphi \ kern0.5em =\ kern0.5em {\ upvarphi} _ {\ mathrm {st}} \ left（I / {I} _ {\ mathrm {st}} \ right）\; {\ left（ \ upeta / {\ upeta} _ {\ mathrm {st}} \ right）} ^ 2 $$

Φが蛍光量子収率である場合、 I は曲線の傾き、ηは溶媒の屈折率です。下付き文字「st」は、既知の量子収率（0.1 M H ₂中の硫酸キニーネ）の参照を示します。 SO ₄ ）。再吸収を最小限に抑えるために、360nmの励起波長で吸収を0.1未満に維持しました。

一重項酸素の生成

サンプルの溶液と3-ジフェニルイソベンゾフランをガラスキュベット（3 mL）で、室温で照射しました。 415 nmでのDPBFの吸収減衰は、3分から30分の照射間隔で測定されました。一重項酸素の生成は、一重項酸素クエンチャーであるDPBFを介して定性的に評価されました。 ¹ の生成に比例するDPBF吸収減衰のパーセンテージ O ₂ 、初期吸光度と所定の照射期間後の吸光度の差によって評価されました。各実験は3回繰り返されました。

CQD、PtPor、およびCQDs @PtPorの細胞毒性アッセイ

ヒト子宮頸癌（HeLa）細胞は、5％ウシ胎児血清（FCS）、100 U / mLペニシリン、100μg/ mLストレプトマイシンを37°C、6％CO 2 。メチルチアゾリルテトラゾリウム（MTT）生存率アッセイは、標準的な方法に従って実施されました。簡単に言うと、HeLa細胞（3×10 ³ /ウェル）を96ウェルプレートに24時間播種した後、薬物に曝露しました。細胞を暗所で一晩サンプルで処理した。細胞毒性は、MTT還元アッセイによって決定されました。細胞単層をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回リンスし、50μLのMTT溶液（0.5 mg / mL）と37°Cで3時間インキュベートしました。培地を除去した後、100μLのDMSOを加えた。溶液を30分間振とうして、形成されたホルマザン結晶を生細胞に溶解させた。 Labsystem Multiskanマイクロプレートリーダー（Merck Eurolab、スイス）を使用して、540nmと690nmの2波長で吸光度を測定しました。各投与濃度は3つのウェルで実行され、MTTアッセイのために2回繰り返されました。

サンプルの光細胞毒性は、同様のプロトコルによって評価されました。一般的に、HeLa細胞（3×10 ³ ウェルあたり）を96ウェルプレートで24時間インキュベートした後、薬物に曝露しました。細胞を暗所で一晩サンプルで処理した。その後、細胞を、遮熱フィルターと500nmロングパスフィルターを備えた50Wキセノンランプに10分間さらしました。フルエンス率は6mW / cm ² 。細胞生存率は、MTT還元アッセイによって決定されました。

CQDs @PtPorのバイオイメージングアプリケーション

細胞イメージングは、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して評価されました。 HeLa細胞（5×10 ⁴ ウェルあたりの細胞）を6ウェル培養プレートに播種し、12時間接着させました。次に、細胞をCQDs @ PtPor（0.25 mg / mL）で37°Cで1時間処理しました。その後、上澄みを注意深く除去し、細胞をPBSで3回洗浄した。続いて、スライドをマウントし、ZEN 2009ソフトウェア（Carl Zeiss）を使用して共焦点顕微鏡（Zeiss Laser Scanning Confocal Microscope; LSM7 DUO）で観察しました。

結果

CQDs @PtPorの準備

CQDは、スキーム1に示すように、文献[38]に記載されている方法に従って、ワンポット水熱反応によって調製されました。PtPorは、置換トランスプラチンと5、10、15、20-テトラ（4-ピリジル）との錯体形成によって合成されました。）報告された方法[37]によるポルフィリン。 PtPor分子はピリジン環に4つの正電荷を持っているため、静電相互作用によって負に帯電したCQDの表面に結合し、目的のCQDs @PtPor複合体を生成します。

CQDs @PtPorの特性評価

透過型電子顕微鏡（TEM）画像（図1左）は、準備されたままのCQDとCQDs @PtPorが均一なサイズで均一に分布していることを示しています。図1の右側に示されている粒子サイズは狭く（1〜9 nm）、ヒストグラムで決定された平均サイズは、CQDとCQDs @PtPorでそれぞれ2.5nmと7.6nmです。 CQDs @ PtPorの平均サイズはCQDのサイズよりも大きく、おそらく静電相互作用によるCQDの表面へのPtPor分子の吸着が原因です。

図2aは、合成されたままのCQDのX線回折（XRD）パターンを示しています。 CQDの広いXRDピークは23°付近に現れ、CQDの無秩序な構造を示しています[39]。 CQDの官能基は、FTIR分光法によって特徴づけられました。図2bに示すように、3000〜3500 cm ^-1 の広いピーク O-HおよびN-H伸縮振動に起因し、ヒドロキシル基とアミノ基の存在を示します。 1150および1230cm ^-1 のピークそれぞれC-OとC-Nの伸縮振動に起因します。アミド結合は、1678および1392 cm ^-1 の典型的なピークによって確認されます。、それぞれアミドのC =OとC-Nの振動に起因します。最後に、1600 cm ^-1 のピーク C =C / C =N結合として識別されます。クエン酸のFTIRの結果と比較すると、CQDはクエン酸（CA）の有意な特徴的な吸収を示さず、CAは加水分解の過程でほとんど炭化されるべきであることを示しています。さらに、1700 cm ^-1 に新しい鋭いピークがあります。、アミド結合に起因することが見出され、エチレンジアミンが-CONH-結合を介してCQDの表面で官能化されるべきであることを示している。 CQDおよびCQDs @ PtPorの平均直径および粒子サイズ分布は、DLS測定によって決定されました（追加ファイル1：図S1および図2c）。図2cに示すように、CQDs @PtPorの平均サイズは約9.2nmであり、TEMテストの結果と一致しています。ゼータ電位測定は、CQDとPtPorの間の結合を確認するためにさらに実施されました。図3dに示すように、自由CQDのゼータ電位は、表面の負電荷のために-15.6mVです。 PtPorと結合した後、CQDs @PtPorコンポジットのゼータ電位は4.5mVに変更され、PtPor分子によるCQDのカバレッジが成功したことを示しています。

X線光電子分光法（XPS）を実行して、CQD（図3）およびCQDs @ PtPor（追加ファイル1：図S2）の化学組成をさらに調査しました。図3aのCQDの調査スペクトルは、表面上の存在元素がC、N、およびOであり、関連する信号がそれぞれ535、402、および283eVであることを示しています[40]。図3bに示すC1s信号には、284.4 eV、286.3 eV、および288.2 eVに3つの異なるピークがあり、それぞれC-C結合、C-O結合、およびC =O結合に割り当てられています。図3cに示す高分解能XPSN 1には、3つのピークがあり、結合エネルギーは395.3、399.1、および402.2 eVであり、それぞれピリジン様N、ピロリックN、および第4級Nに対応します[41]。 O 1のデコンボリューションは、C-OおよびO-Hピークを示し（図3d）、CQDの表面に大きなカルボキシル基が存在することを示しています。

CQDs @PtPorの光物理的特性

複合材料の光物理的特性を調査するために、UV-Vis吸収および蛍光スペクトルを実行しました。図4aに示すように、CQDs @ PtPor複合材料は、CQDとポルフィリンからの特徴的なピークを示しました。たとえば、360 nm付近の有意な吸収ピークは、おそらくCQDからのn→π*遷移に割り当てられました[42]が、425 nm、520 nm、および580 nm付近のピークは、ポルフィリンのソーレー帯とQバンドに起因していました。、それぞれ。 CQDの水溶液は、365 nmの紫外線（UV）ランプの照射下で青色の発光を示します。さらに、CQDは励起依存のPL挙動を示し、図4bに示すように、励起波長が280から500 nmに変化すると、発光ピークが460から552nmにシフトしました。調製されたままのCQDの蛍光量子収率は、参照として硫酸キニーネを使用して36％でした。

ディスカッション

CQDs @ PtPor複合材料の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）効果は、CQDs @PtPorの蛍光強度をCQDsおよびPtPorと比較することで調べることができます。同じ濃度のCQD、PtPor、およびCQDs @ PtPorの蛍光スペクトルと強度を、360 nmの励起下で測定しました（図4c）。 CQDは360nmで非常に強い吸収を示し（図4a）、PL量子収率は36％と高いため、非常に強い蛍光を発します。逆に、360 nmでのPtPorの吸収は非常に低く、そのPL量子収率は1％未満であるため、PtPorは非常に弱い発光を示します。注目すべきことに、CQDs @ PtPorの青色発光（500 nm）の強度は、遊離CQDと比較して明らかに減少しましたが、赤色発光（660 nm）は、PtPor単独の場合と比較して大幅に増強されており、CQDs @PtPorコンポジットでの効率的なエネルギー移動を示しています。。図4dに示すように、CQDs @ PtPor複合材料のCQDの蛍光寿命は、遊離CQDの蛍光寿命と比較して減少しました。ドナー寿命のこのような明らかな減少は、CQDs @PtPor複合材料におけるCQDからPtPorへの効果的な共鳴エネルギー移動をさらに示しています。

一重項酸素の生成はPDTの重要な要素であるため、¹ O ₂ 生成は、¹ として1,3-ジフェニルイソベンゾフラン（DPBF）を使用する化学的方法によって決定されました。 O ₂ スカベンジャー。一般に、DPBFの吸収強度は、一重項酸素の存在下で徐々に減少します。したがって、DPBFの吸収強度の減少率を使用して、一重項酸素の相対収量を評価できます。この実験では、CQD（5 mg / mL）、PtPor（5 mg / mL）、またはCQDs @ PtPor（5 mg / mL）をそれぞれDPBF（10 mM）と混合した後、キセノンランプを照射しました。図5aに示すように、CQDの添加後、DPBFの吸収は照射時間の延長に伴う変化を示さず、CQDには有意な一重項酸素の生成がなかったことを示しています。さらに、CQDs @ PtPorコンポジットは、DPBFに対して非常に明らかな劣化を示しました。これは、PtPorの劣化よりもはるかに高く、¹ O ₂ ポルフィリンの収量は、CQDの役割の下で高めることができます。一方、¹ の制作 O ₂ ジクロロフルオレセイン（DCFH）試薬を使用してさらに定量しました。緑色の蛍光（λ_em =525 nm）のDCFHは、¹ と反応すると定量的に増加することが知られています。 O ₂ 光増感剤から生成されます。図5bに示すように、CQDs @PtPorコンポジットは¹ のより高い効率を示しました。 O ₂ 純粋なPtPorよりも生産量が多い。この結果は、DPBF法で得られた結果と非常に一致しています。

HeLa細胞に対するCQD、PtPor、およびCQDs @ PtPorの細胞毒性は、メチルチアゾリルテトラゾリウム（MTT）アッセイによってテストされました。図6aに示すように、3つのサンプルはすべて、暗所で24時間処理した後、HeLa細胞に対してごくわずかな細胞毒性を示しました。癌細胞の90％以上がまだ生存しており、濃度は50μg/ mLに増加しました。これは、3つのサンプルすべてが暗闇の中で癌細胞に悪影響を及ぼさなかったことを示唆しています。さらに、3つのサンプルの光細胞毒性は、同様の方法を使用してさらに評価されました。図6bに示すように、癌細胞をCQDs @ PtPorで24時間処理した後、光を照射すると、サンプル濃度の増加に伴って細胞生存率が徐々に低下しました。 CQDs @PtPorの濃度が50μg/ mLの場合、癌細胞の生存率はわずか8％であり、PtPor単独（18％）およびCQD（90％）よりも明らかに低かった。つまり、CQDs @ PtPor複合材料は、PtPor単独よりも強力な治療効果を示し、CQDs @ PtPorが従来の製剤よりも有利であることを示唆しています。これは、おそらくCQDによるPtPorの一重項酸素生成の効率の向上によるものです。

純粋なCQD、PtPor、およびCQDs @ PtPorの細胞への取り込みは、405nmレーザーの励起下で共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して研究されました。図7に示すように、CQDs @PtPorコンポジットは主にHeLa細胞の細胞質に分布しています。さらに、CQDからの青色蛍光イメージングは、CQDs @ PtPorコンポジットのPtPorからの赤色発光とほぼ重なっており、CQDs @PtPorコンポジットが細胞に入った後もCQDとPtPorが結合状態のままであることを示しています。これらの結果は、CQDs @ PtPor複合材料が細胞環境で安定しており、細胞内で蛍光共鳴エネルギー移動を実行できることを証明しています。

結論

新しいセラノスティックナノエージェント（CQDs @ PtPor）は、テトラ白金化ポルフィリン錯体（PtPor）と負に帯電したCQDとの間の静電相互作用により、設計および開発に成功しました。調製されたままのCQDs @ PtPor複合材料は、高い水分散性、優れた安定性と生体適合性、および強化された光増感剤の蛍光検出を示しました。 CQDs @ PtPorのPDT効果は、PtPor単独の効果と比較して大幅に強化されており、¹ の効率が向上するため、CQDs @PtPorが従来の製剤よりも有利であることを示唆しています。 O ₂ CQDによるPtPorの生成。したがって、このCQDベースのナノエージェントは、癌細胞に対する治療効果の向上とin vitroでの副作用の低さを示し、近い将来、癌患者を治療するための診療所での応用に大きな可能性を示しています。