骨芽細胞様3T3-E1細胞におけるジルコニアナノ粒子誘発毒性効果

要約

ジルコニア（ZrO ₂ ）は、その高い機械的強度と毒性の低さから、バイオセンサー、癌治療、インプラント、歯科などの潜在的なバイオアプリケーションに広く使用されている金属酸化物の1つです。それらの広範な用途のために、これらのナノ粒子（NP）への潜在的な曝露が増加しており、これは大きな注目を集めています。したがって、ZrO ₂の毒物学的プロファイルを調査することが急務です。 NP。二酸化チタン（TiO ₂ ）は、毒性が弱いことが知られているもう1つの広く使用されているナノ材料です。この研究では、TiO ₂ NPは、ZrO ₂の生体適合性を評価するためのコントロールとして機能しました。 NP。 TiO ₂の細胞毒性を検出しましたおよびZrO ₂ 骨芽細胞様3T3-E1細胞のNPは、活性酸素種（ROS）がTiO ₂で重要な役割を果たしていることを発見しました。およびZrO ₂ 濃度依存的にNPが誘導する細胞毒性。 TiO ₂も示しましたおよびZrO ₂ NPは、高濃度の3T3-E1細胞で培養した後、アポトーシスと形態変化を誘発する可能性があります。さらに、TiO ₂ およびZrO ₂ 高濃度のNPは、低濃度のNPと比較して、細胞の骨形成分化を阻害する可能性があります。結論として、TiO ₂ およびZrO ₂ NPは、濃度依存的にin vitroで細胞毒性反応を誘発する可能性があり、これも骨形成に影響を与える可能性があります。 ZrO ₂ NPは、TiO ₂よりも強力な毒性効果を示しました NP。

はじめに

過去数十年の間に、工学的ナノ粒子（NP）のアプリケーションは、電子機器、生物医学的アプリケーション、および医薬品などのさまざまな分野で拡大してきました。ジルコニア（ZrO ₂ ）NPは、耐火物、鋳物砂、セラミックの合成に使用される主要なナノ材料の1つです。機械的強度が好ましいため、この材料は、バイオセンサー、癌治療、インプラント、関節内部人工器官、歯科などの生物医学分野でも使用されています[1、2]。しかし、粒子の幅広い適用は、健康と環境への潜在的なリスクへの懸念を引き起こしており、その中で職業上および消費者の安全を確保することは本質的な懸念です。これまでのところ、ZrO ₂に関する毒物学的研究 NPは限られており、結果は物議を醸しています。

いくつかの研究では、ZrO ₂ NPは、酸化鉄、二酸化チタン（TiO ₂）を含む他のナノ材料と比較した場合、より優れた生体適合性を示しました。）、および酸化亜鉛（ZnO）[3,4,5,6]。これらの結果と一致して、他の人はZrO ₂を報告しました NPは軽度の細胞毒性効果を誘発するか[3、7]、または細胞毒性効果を誘発しない[8,9,10]可能性があり、軽度の細胞毒性の可能性を示した研究はごくわずかでした。ただし、Stoccoro etal。 [11] ZrO ₂の毒性作用を開発しました NPとTiO ₂ コーティングされているかどうかにかかわらず、彼らはすべての種類のNPがさまざまな程度で毒性効果を示すことを発見しました。さらに、ZrO ₂後の別の研究では、細胞の形態が変化し、細胞表面に亀裂が見られました。赤血球中の最大1mg / mLの濃度でのNP治療[12]。したがって、この研究では、ZrO ₂の細胞毒性効果を評価しました。 NPは、invivoでの将来のアプリケーションに役立つ洞察を提供します。その間、細胞をTiO ₂で処理しました毒物学的プロファイルが十分に開発されている対照群としてのNP [13]。

以前の研究では、NPは組織工学材料として広く使用されており、骨芽細胞の骨形成分化を改善する能力があることが示されています[14、15、16、17]。ある報告によると、シリカ（Si）NPは、おそらくSi NPによって誘発される骨形成のために、マウスの加齢に伴う骨量減少を逆転させる可能性があります[16]。 Liu etal。 [14]は、銀（Ag）NP /ポリ（DL-乳酸-co-グリコール酸）でコーティングされたステンレス鋼合金が強力な抗菌能力を持ち、MC3T3-E1細胞の骨芽細胞の増殖と成熟をinvitroで促進できることを発見しました。さらに、カーボンナノチューブは骨の石灰化を誘発することが報告されており、おそらく細胞内小器官のサイズに類似したナノサイズの構造に起因する可能性があります[18]。

ZrO ₂ NPは、その生体適合性と生体腐食に対する耐性のために、バイオセラミックインプラントの主成分として適用されてきました[19]。研究の大部分はZrO ₂の有利な特性に焦点を合わせていますが NP、生物学的悪影響を無視することは不可能です。したがって、この研究では、TiO ₂を使用しました。、同様の物理化学的特性を示した従来のナノ材料である対照群として。 TiO ₂の効果を調査することを目的としましたおよびZrO ₂ 共培養後のMC3T3-E1骨芽細胞の細胞生存率、酸化ストレス、細胞形態、および骨形成反応に関するNPにより、TiO ₂の骨誘導性が明らかになります。およびZrO ₂ NP治療。

材料と方法

材料の準備と特性評価

TiO ₂ NP（CAS番号637262）およびZrO ₂ NP（CAS番号544760）はSigma-Aldrich（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入し、透過型電子顕微鏡（TEM、MFP-3D-S、Asylum Research、サンタバーバラ、カリフォルニア州、米国）で特性評価しました。、ゼータ電位、および動的光散乱（DLS）粒子サイズ分析測定（Zetasizer Nano ZS、Malvern、UK）。ＮＰは、ＴＥＭ検出のためにアルコールに分散され、これは、ＮＰの形態および粒子サイズをより明確に示すことができた。さらに、粒子の凝集サイズはDLSを介して検出され、完全培地を使用して、細胞培養に適用された粒子の特性と一致させました。細胞処理の前に、ストック溶液を超音波細胞破壊システム（Ningbo Xinzhi Biotechnology、中国）で30分間分散させ、氷冷させ、細胞実験の前に完全培地でさまざまな濃度に希釈しました。

3T3-E1細胞培養

3T3-E1細胞株（中国医科学アカデミーの公共研究開発のための上海インフラストラクチャーのセルバンク、上海、中国）は、最小必須培地アルファ（α-MEM、Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州）で培養されました。、米国）10％ウシ胎児血清（FBS、Thermo Fisher Scientific、米国）および1％抗生物質/抗真菌剤（Thermo Fisher Scientific、米国）を含みます。細胞を37°Cで5％CO ₂とともにインキュベートしました。 95％加湿雰囲気で、培地は1日おきに交換しました。

細胞増殖アッセイ

細胞生存率は、CCK-8アッセイ（Dojindo Molecular Technologies、熊本市、日本）を使用して検出されました。細胞を96ウェルプレートにウェルあたり5000細胞で播種しました。 TiO ₂ NPとZrO ₂ 次に、NPを0、10、20、40、60、80、100、および150μg/ mLの連続濃度で96ウェルプレートに添加し、続いて5％CO <で37°Cで24時間および48時間インキュベートしました。 sub> 2 、 N を伴う -アセチル-1-システイン（NAC）かどうか。これは、ROSの生成を阻害するために使用されました。対照群は未治療のままにした。次に、110μLの検出試薬を各ウェルに添加してCCK-8テストを実施し、96ウェルプレートを37°Cでさらに2時間インキュベートしました。 NPがこの分析アッセイに干渉するのを防ぐために、96ウェルプレートでテストする試薬を2時間の反応時間後に新しい96ウェルプレートに移しました。沈着したNPと細胞を一次プレートに残した。各ウェルの光学密度（OD）は、マイクロプレートリーダー（SpectraMax M5、Molecular Devices、米国カリフォルニア州サニーベール）を使用して450nmの単一波長で測定しました。各治療は6回繰り返して行われました。

フローサイトメトリーによるアネキシンVアポトーシス分析

コンフルエンシーのために、細胞を12ウェルプレートで30,000細胞/ウェルの密度で培養しました。 TiO ₂の後 NPおよびZrO ₂ 48時間のNP処理、細胞をPBSで洗浄し、EDTAフリートリプシンバッファーを使用して収集しました。細胞を25,000細胞/ mLの濃度のPBSバッファーで再懸濁し、1000× g で遠心分離しました。。次に、細胞をFITCアネキシンVおよびPI（Invitrogen™、USA）で室温で露光せずに染色しました。最後に、細胞を400μLの結合バッファーと混合し、フローサイトメトリー（BD FACSAria III、BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）で直ちに分析しました。

ROS生成分析

細胞内ROSの形成は、活性酸素種アッセイキット（Beyotime、上海、中国）を使用して決定されました。簡単に説明すると、PBSで洗浄した後、細胞を6ウェルプレートに20,000細胞/ウェルで2 mLの培地に播種し、TiO ₂で処理しました。 NPとZrO ₂ 0、10、50、および100μg/ mLの濃度で48時間のNP、NACを伴うかどうか。 TiO ₂で処理した後 NPとZrO ₂ NP、細胞を収集し、10μMのDCFH-DAとともに37°C、5％CO ₂で30分間インキュベートしました。。蛍光強度は、BD FACSAria III（BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）で分析されました。

共焦点顕微鏡

細胞の大部分がアポトーシス状態になっているため、この研究では細胞の細胞骨格構造の変化を観察する時点として24時間を選択しました。 3T3-E1細胞をガラスカバースリップに播種し、TiO ₂の存在下で培養しました。 NPとZrO ₂ 24時間のNP。 PBSバッファーで3回処理した直後に細胞を洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、0.1％Triton X-100で透過処理し、5％BSAを含むPBSでブロックしました。次に、細胞をα-チューブリン（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国、1：4000）について、4°Cで一晩インキュベートし、翌日、37°Cで1時間FITC結合二次抗体をロードしました。 PBSで3回洗浄します。その結果、細胞骨格はローダミン-ファロイジン（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA、1：1000）で暗所で1時間染色され、核はHoechst 33342（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）で20分間染色されました。 FV10i共焦点顕微鏡（オリンパス、東京、日本）を使用してカバースリップを検査しました。

鉱化作用の検出

3T3-E1細胞を15,000細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種しました。細胞をTiO ₂で処理しました NPとZrO ₂ 10および100μg/ mLの濃度のNP、およびナノマテリアルを含む培地は1日おきに交換されました。すべての培地を交換する前に、細胞をPBSで穏やかに洗浄して、残留ナノ材料を除去しました。 TiO ₂の存在下で7、14、21日間培養した後 NPとZrO ₂ NP、細胞をアリザリンレッドSで染色しました。簡単に説明すると、細胞を4％パラホルムアルデヒドで4°Cで30分間固定し、アリザリンレッドS溶液（40 mM、pH 4.1）で周囲温度でさらに20分間染色しました。蒸留水で3回洗浄した後、光学顕微鏡（オリンパス、日本）で鉱化した小結節を観察しました。

RNA抽出とRT-PCR

全RNAはTRIzol試薬（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）を介して抽出されました。次に、紫外分光光度計を使用してRNA濃度を評価した。単離されたRNAは、RT試薬キット（タカラバイオ、大連、中国）を使用してcDNAに逆転写されました。リアルタイムPCRは、SYBRグリーン試薬（タカラバイオ、大連、中国）を使用して実施しました。ラント関連転写因子2（RUNX2）、コラーゲン1α1（Col1α1）、アルカリホスファターゼ（ALP）、オステオポンチン（OPN）、オステオカルシン（OC）、骨シアロタンパク質（BSP）などの骨形成関連遺伝子が検出されました。データは2 ^-ΔΔ を使用して分析されました CT法。使用したプライマーを表1に示します。

<図>

統計分析

結果は平均±SEMとして表された。すべてのデータは、ANOVA検定によって統計的に分析されました。等分散性検定が実行され、等分散性が仮定された場合と等分散性がなかった場合に、それぞれボンフェローニ検定とダネットのT3検定が使用されました。 p 0.05未満の値は、統計的に有意であると見なされました。

結果

TiO ₂の特性評価およびZrO ₂ NP

最初に、TiO ₂の特性を評価しました NPおよびZrO ₂ 透過型電子顕微鏡（TEM）および動的光散乱（DLS）によるNP粉末（図1a、b、表2）。 TEMおよびSEM画像は粒子の形状とサイズを明らかにしました。 TiO ₂ NPは、平均サイズが25.4±2.8nmの小さな棒状の球体でした。 ZrO ₂ NPは、平均サイズが31.9±1.9nmの小さな棒状の球体でした。 TiO ₂のサイズを測定するには NPとZrO ₂ 溶液中のNP、DLSを使用し、TiO ₂の粒子 NPとZrO ₂ NPはそれぞれ81.2nmと93.1nmに拡大し、凝集効果を示しました。 TiO ₂のゼータ電位 NPとZrO ₂ NPはそれぞれ32.9±5.4mVと42.4±7.4mVでした。

<図>

次に、TiO ₂後の3T3細胞の写真を観察しました。 NPおよびZrO ₂ さまざまな濃度でのNP曝露。 NPが細胞上に均一に分布しているか、周囲に広がっていることがわかりました。 NPは、マイクロスケールで観察されたNPのごく一部のため、高濃度で強力な凝集能力を示しましたが、NPの大部分はナノスケールでは小さく、おそらく見えにくい細胞に移動します（図1c）。さらに、TiO ₂後の細胞のTEM結果およびZrO ₂ 1時間のNP治療が得られました。私たちのデータは、NPが細胞小胞に移動する可能性があることを示しました。一方、ミトコンドリアの腫れや液胞の発生など、細胞小器官の損傷も見られます。

TiO ₂ およびZrO ₂ 3T3-E1細胞におけるNP誘発毒性効果

TiO ₂後の細胞生存率を評価しました NPおよびZrO ₂ 一連の濃度（10、20、40、60、80、100、150μg / mL）でのNP処理。 TiO ₂の場合 NP（図2a）、24時間のインキュベーション後、TiO ₂ NPは低用量（≤20μg/ mL）では無毒でしたが、高濃度（>20μg/ mL）では細胞生存率の明らかな低下が観察されました（ p <0.001）。 20μg/ mLの処理グループでは、48時間のインキュベーション後に細胞生存率のより劇的な低下が観察されました。 TiO ₂ 20μg/ mLの濃度のNPは、細胞生存率の低下を引き起こしました（ p <0.01）。さらに、高用量のTiO ₂ NP（>20μg/ mL）は、48時間で細胞生存率の有意な低下を示しました（ p <0.001）。ただし、10μg/ mLのTiO ₂で処理した場合、細胞の生存率は安定したままでした。 48時間のNP。さらに、ZrO ₂の場合 NP（図2b）、TiO ₂と比較した場合に同様の結果が観察されました NP; 150μg/ mLの濃度で48時間、より高い毒性効果が観察され、細胞生存率は50％未満に低下しました。これらの結果は、TiO ₂ およびZrO ₂ NPは低用量で生体適合性がありました。ただし、これら2つのナノ材料は、高毒性濃度でわずかな細胞毒性を示しました。

TiO ₂に対するNAC阻害効果およびZrO ₂ NPによる細胞毒性

次に、ROSスカベンジング剤であるNACの阻害効果を検出しました。結果は、NACが潜在的にTiO ₂を阻害したことを示しました（図2a）、およびZrO ₂ NP（図2b）は、24時間および48時間の処理後に細胞生存率を誘導しました。 NAC阻害後、細胞生存率はすべての濃度のTiO ₂で24時間維持されました。およびZrO ₂ 最高濃度（150μg/ mL）を除くNP処理。高濃度のTiO ₂で処理した細胞では、抑制効果はわずかに低下しましたが（100および150μg/ mL）およびZrO ₂ 48時間の時点でNP（80、100、および150μg/ mL）、80μg/ mL未満の濃度では強力な細胞生存率の変化は観察されませんでした。細胞生存率はNACなしの場合よりも有意に高かったです。

TiO ₂ およびZrO ₂ 3T3-E1細胞におけるNPs誘発性ROS生成

さらに、TiO ₂後のROS生成を検出しましたおよびZrO ₂ 3T3-E1細胞でのNP曝露（図3）。私たちの結果は、TiO ₂ およびZrO ₂ NPは24時間後にROS生成を誘発しました。これは、100μg/ mLの濃度で最も顕著でした。 TiO ₂の有意なROS生成はありませんでした NPは10μg/ mLの濃度で、ZrO ₂ NPは同じ濃度で強力なROS生成を誘発しました。一方、NACはTiO ₂を大幅に阻害する可能性がありますおよびZrO ₂ すべての濃度での3T3-E1細胞におけるNP誘導性ROS生成。

TiO ₂ およびZrO ₂ 3T3-E1細胞におけるNPs誘発性アポトーシスおよび壊死

細胞のアポトーシスと壊死は、さまざまな濃度のTiO ₂の後に検出されました。およびZrO ₂ 48時間でのNP曝露（図4）。第3象限にある赤い点は正常細胞を表し、第1象限と第4象限にある赤い点はそれぞれ初期アポトーシス細胞と後期アポトーシス細胞または壊死細胞を表しています。興味深いことに、私たちの結果は、TiO ₂ およびZrO ₂ NPは、濃度および時間に依存する方法でアポトーシスを誘導する可能性があります。 TiO ₂に続いて 48時間のNP曝露では、10μg/ mLの濃度で有意な細胞アポトーシスは検出されませんでした。ただし、50および100μg/ mLの濃度では、後期アポトーシス細胞または壊死細胞の割合が高レベルに達しました。 ZrO ₂に続く 48時間のNP曝露では、10μg/ mLの濃度でも細胞アポトーシスは検出されませんでしたが、後期アポトーシス細胞または壊死細胞の割合は、50μg/ mLグループで43.7％でした。最も興味深いことに、48時間の処理後、100μg/ mLの濃度で有意な初期アポトーシス（34.1％）が観察されました。 TiO ₂の初期アポトーシスレベルが NPはZrO ₂よりも大幅に高かった NP;しかし、後期のアポトーシスまたは壊死のレベルは詩でした。

TiO ₂ およびZrO ₂ 3T3-E1細胞におけるNP誘発性の形態学的変化

TiO ₂への曝露後の3T3-E1細胞の形態学的変化を研究することおよびZrO ₂ NPについては、蛍光染色とそれに続く共焦点顕微鏡検査を実施しました（図5および6）。未処理のコントロール細胞と比較して、10μg/ mLのTiO ₂の後に形態学的変化はありませんでした。およびZrO ₂ 24時間でのNP処理、100μg/ mLのTiO ₂の後、細胞は丸くなり、小さくなりました。およびZrO ₂ NP治療。最も興味深いことに、50μg/ mLのTiO ₂の後に、わずかな細胞面積の減少が観察されました。およびZrO ₂ NP処理、ここでTiO ₂ より強力な細胞面積の減少を示した。一貫して、定量的な結果により、100μg/ mLのTiO ₂の後に細胞面積の有意な減少が確認されました。およびZrO ₂ NP治療（図5）。

さらに、アクチンフィラメントと微小管レベルの両方における細胞骨格の変化を調べました（図6）。同様に、対照群と10μg/ mLのTiO ₂の間に有意差は示されませんでした。およびZrO ₂ NP処理、および両方のグループの細胞は、アクチンフィラメントと微小管システムの明確な構造を明らかにしました。対照的に、100μg/ mLのZrO ₂ NP処理は、核濃縮のような核と凝縮した不明瞭なアクチンフィラメントと微小管構造とともに、3T3-E1細胞の収縮を誘発しました。 TiO ₂の場合 NP、非常に多くのアクチンドットが観察され、細胞膜にあるアクチンフィラメントは霧状で粗いものでした。 ZrO ₂の場合 NP、より強力な細胞骨格破壊が検出され、アクチンと微小管の構造は粗く欠陥がありました。

TiO ₂ およびZrO ₂ 3T3細胞におけるNP誘導鉱化作用

次に、アリザリンレッド染色により3T3細胞の石灰化状態を検出し、光学顕微鏡下で石灰化結節の形成を観察しました（図7）。さまざまな濃度のTiO ₂の存在下で、7、14、および21日間の骨形成誘導後、細胞を染色しました。およびZrO ₂ NP。鉱化した小結節は、14日と21日の誘導後に見えるようになりました。対照群とTiO ₂の間で、14日後と21日後の鉱化作用に有意差はありませんでした。およびZrO ₂ 10μg/ mLでのNP処理。ただし、鉱化作用の減少は、おそらくTiO ₂の後に観察されました。およびZrO ₂ 鉱化した小結節が小さくぼやけたため、100μg/ mLでのNP処理。

TiO ₂ およびZrO ₂ 3T3細胞における骨形成関連遺伝子のNP誘導性発現

TiO ₂のメカニズムを調べるためにおよびZrO ₂ 3T3細胞におけるNP誘発性骨化、TiO ₂後の3T3細胞における骨化関連遺伝子のレベルを検出しましたおよびZrO ₂ 初期に優先的にアップレギュレートされた遺伝子を含むNP治療（ Runx2 、Col1α1 、および Alp ）および遅い（ Opn 、 Ocn 、および Bsp ）骨化の段階（図8）。 10μg/ mLのTiO ₂ およびZrO ₂ NPは Runx2 の最高の発現レベルを誘導しました 3日間の治療後、7日目は Runx ZrO ₂の後に最低レベルに減少しました 100μg/ mLでのNP処理。 Col1α1 10μg/ mLのTiO ₂の後に増加およびZrO ₂ 3日目と7日目の両方でNP処理を行い、100μg/ mLのTiO ₂で処理した細胞の場合およびZrO ₂ NP、Col1α1 最初は3日目に大幅にアップレギュレーションされましたが、7日後には劇的に減少しました。 Alp の大幅な減少も検出されました TiO ₂後の式およびZrO ₂ 100μg/ mLで3日間のNP治療。

骨形成誘導の後期にアップレギュレーションされた遺伝子の場合、 Opn の発現レベル、 Ocn 、および Bsp 10μg/ mLのTiO ₂の後に大幅に増加しましたおよびZrO ₂ 14日間のNP治療、および Opn 21日目に継続的に高いレベルにアップレギュレーションされました。これらの結果は、 Ocn と比較して示唆されましたおよび Bsp 、 Opn TiO ₂の後期マーカーでしたおよびZrO ₂ NP誘発性骨化。興味深いことに、100μg/ mLのTiO ₂ およびZrO ₂ NPは Opn の発現を高めることができませんでした、 Ocn 、または Bsp 14日目;さらに、これらの遺伝子は21日目に有意なダウンレギュレーションを示しました。

ディスカッション

ZrO ₂ NPは、難治性食品、セラミック、およびインプラント、関節内部人工器官、歯科材料などの生物医学機器の重要なコンポーネントでした。これまで、TiO ₂ 同様の物理化学的特性を持つ他のNPの1つとしてのNPは、多くの研究がその毒物学的データに焦点を合わせています。彼らは、TiO ₂ NPは細胞に移行する可能性があり、さまざまな物理化学的特性により潜在的な細胞損傷を示しました[20、21]。一方、ZrO2NPの毒物学的データは不足していました。私たちの研究では、TiO ₂と見なしました対照群としてのNPと、TiO ₂の毒性学的影響の調査およびZrO ₂ 3T3-E1細胞上のNP。 NPの物理化学的特性、特にサイズと形態は、バイオセーフティに効果的に影響を与えることが知られています。いくつかの研究は、ナノスケールの粒子がマイクロスケールの粒子よりも著しく毒性が高いことを示しています[22、23]。ほとんどの場合、粒子の形態も毒性に影響を与えることが報告されています[24、25、26]。私たちの研究では、TiO ₂ およびZrO ₂ NPは棒状の球体でした。以前のレポート[5、27、28]と比較して、私たちのTiO ₂ およびZrO ₂ NPは、粒子が81.2および93.1 nmのサイズに拡大した水中での凝集効果が比較的弱かった一方で、濃度依存的にNP曝露後の培地でいくつかのマイクロスケールの物質を観察することもできました。これにより、この研究でも凝集効果が確認されました。超音波分散技術を使用した後。しかし、強力なNPが細胞内小胞で検出されたため、凝集効果は細胞質へのNP転座を阻害できませんでした。ミトコンドリアのような細胞小器官は、おそらく1つの主要な標的でした。

さまざまな濃度のTiO ₂で3T3-E1細胞の生存率を検出しましたおよびZrO ₂ NP治療。結果は、10μg/ mLのTiO ₂ およびZrO ₂ NPは、3T3-E1細胞のバイオセーフティ濃度です。細胞の生存率は時間および濃度に依存して減少しました。これは、TiO ₂ およびZrO ₂ NPは、二酸化ケイ素やZnOなどの他の酸化物金属ナノ粒子と比較して高用量の長時間暴露後に細胞毒性を示す可能性がありました[4、28、29]。さらに、ZrO ₂ NPは、TiO ₂よりも強力な毒性効果を示しました高毒性濃度での我々の研究におけるNP。

酸化ストレスは、ROS生成のペースを上回り、抗酸化因子の減少の副産物であり、ナノマテリアルによって誘発される細胞毒性の重要な要因の1つとして知られており、異なるメカニズムによって細胞アポトーシスを引き起こすことが報告されています[30、31]。さらに、Kozelskaya etal。 [12]はZrO ₂ NPは、酸化ストレスにより、膜の微小粘度の増加、細胞形態の変化、および赤血球の表面亀裂を誘発しました。これらの研究と一致して、TiO ₂後の3T3-E1細胞でROSレベルを検出しました。およびZrO ₂ NP処理により、TiO ₂ およびZrO ₂ NPは、濃度依存的に有意なROS生成を誘発する可能性があり、ZrO ₂ NPはより強力な酸化ストレス効果を誘発しました。さらに、上昇したROSレベルは、ROSスカベンジャーであるNACによって排除することができます。これらの結果は、TiO ₂におけるROSの重要な役割を示唆しています。およびZrO ₂ NPによる細胞毒性。

アポトーシスは、細胞の生物学的機能を維持するために、老化した細胞や異常な細胞を取り除く細胞死の一種です[32]。いくつかの研究は、アポトーシスが、TiO ₂などの酸化物金属ナノ材料で処理した後の主な毒性反応の1つであると報告しています。、ZnO、Si、およびAg [33,34,35,36]。私たちの研究では、TiO ₂ およびZrO ₂ NPは、時間/濃度依存的に3T3-E1細胞のアポトーシス/壊死体形成を誘導する可能性があり、これは以前に示した細胞生存率の低下と相関していました。さらに、ZrO ₂の後に、後期アポトーシス細胞または壊死細胞の大部分が観察された場合、 NP処理、TiO ₂のセルステータス NPは主に初期アポトーシスでした。これらの現象は、ZrO ₂ NPはより迅速で強力なアポトーシス効果を誘発しました。同様に、他の研究でもZrO ₂ NPは、MSTO細胞で有意なアポトーシスおよび壊死プロセスを誘発しました[4、11]。

細胞骨格代謝は、重合と解重合を伴う動的な生物学的プロセスであり、細胞の形態を維持し、細胞の機能を促進する可能性があります。いくつかの研究は、ナノマテリアルが細胞の形態と細胞骨格系に影響を与える可能性があることを示しています[37、38、39]。 TiO ₂の高用量群では、3T3-E1細胞が小さくなり丸みを帯びていることがわかりました。およびZrO ₂ NP（100μg/ mL）、および細胞骨格の破壊による細胞面積の減少。これらの調査結果は、ZrO ₂という以前のレポートによっても裏付けられました。 NP処理は、高濃度でMSTO細胞の細胞形態変化を誘発する可能性があります[4]。別の研究では、ZrO ₂後の血球形態の崩壊が示されました NP治療[12]。

アリザリンレッド染色は、骨形成反応の重要な指標です。私たちの研究では、骨形成誘導への影響はTiO ₂によって示されていません。およびZrO ₂ 細胞毒性用量のTiO ₂で処理された細胞を除いて、NP処理（10μg/ mL）およびZrO ₂ NP（100μg/ mL）では、骨誘導特性が阻害される可能性があるため、石灰化した結節が大幅に減少しました。さらに、骨形成関連遺伝子の発現レベルは重要なバイオマーカーでした。私たちの結果は、低濃度（10μg/ mL）のTiO ₂ およびZrO ₂ NPは骨形成関連遺伝子の発現を促進しました。ただし、TiO ₂ およびZrO ₂ 高濃度（100μg/ mL）のNPは、鉱化作用の初期段階と後期段階の両方で遺伝子発現を有意に阻害する可能性があり、TiO ₂ およびZrO ₂ 高濃度のNPは確かに骨誘導特性を阻害しました。他の研究でも同様の結果が得られました。彼らは、TiO ₂ NPは、骨芽細胞の骨形成をサイズ依存的に阻害する一方で、破骨細胞形成プロセスを促進する可能性があります[33]。 Sengstock etal。 [40]は、亜毒性濃度のAg NPおよびAgイオンが、ヒト間葉系幹細胞の骨形成分化を著しく損なう可能性があることを発見しました。より進行中または新たに開始された研究は、invivoでの適用のためのオッセオインテグレーションを促進するための許容可能なバイオセーフティと骨形成の可能性を備えたナノ粒子の開発に焦点を当てています[18、41]。

結論

結論として、私たちのデータは、ZrO ₂ NPは、TiO ₂と同様に、優れた生体適合性を備えたナノ粒子でした。 NPは、3T3-E1細胞に高毒性濃度で毒性作用を誘発する可能性があります。 ROSはTiO ₂で重要な役割を果たしましたおよびZrO ₂ 細胞生存率、アポトーシスおよび壊死、ならびに細胞形態の変化を含む、NPによって誘発される細胞毒性。さらに、TiO ₂ 高濃度のZrO2NPは、3T3-E1細胞の骨形成分化に対して阻害効果を示しました。私たちの調査結果は、ZrO2NPの生体適合性と潜在的なアプリケーションに関する深い洞察を提供する可能性があります。