Fe₃O₄-Auコアシェルナノ粒子の取り込み最適化による大腸がん細胞への標的エンドサイトーシス

概要

磁性酸化鉄（Fe₃O₄）-金（Au）コアシェルナノ粒子（NPs）は独自の磁気的および光学的特性を持ちます。生物学的モエティと組み合わせると、これらのNPsは薬物送達や癌標的化などの医療応用に新たな戦略を提供できます。ここでは、生物学的モエティと組み合わせた磁性コアシェルNPシステムの制御可能な細胞取り込みの効果的な方法を提示します。構造タンパク質であるビメンチンは、生化学的に食作用に強力に影響することが確認されています。さらに、ビメンチンは複数の生物学的モエティの阻害下でも、外来物質の細胞内取り込みに影響を与えます。本研究では、生物学的モエティの組み合わせを用いた表面修飾Fe₃O₄-AuコアシェルNPsの細胞内取り込み性能を実証します。ビメンチン標識NPsの光蛍光は複数の阻害試験下でも影響を受けず、NPsがニスタチン、ダイナソア、シトカラシンD、さらにはMuc1抗体（Ab）によって最小限しか影響を受けないことを示しました。したがって、この結果はMuc1 Abが特定分子を標的とし、特定のエンドサイトーシスを制御できることを示しています。さらに、大腸がん細胞での制御可能な特定エンドサイトーシスの可能性を示しました。

はじめに

ナノ材料は臨床診断と治療に新たな道を開きました。特に、ナノ粒子（NPs）は最も重要なツールの一つであり、バイオセンサー[1, 2]、診断[3, 4]、標的薬物送達システム[5, 6]などの応用に使用されてきました。医療応用では、NPsは一般的にコア材料を取り囲む有機材料で構成されます[7,8,9]。磁性材料、半導体材料、その他の材料で構成されるコア材料は有用な物理化学的特性を持ち、外側の有機表面はNPsに化学的安定性と機能性を提供します。生物学的標的システムへの応用では、物理化学的特性だけでなく、標的化のためにバイオ機能化された外側の有機表面も重要なパラメータです。機能化のための標的モエティの例として、標的特異的な抗体やリガンドが挙げられます。外側表面のバイオ機能化材料に応じて、NPsのエンドサイトーシスメカニズムが決まります。NPsが細胞に入るメカニズムは、ナノ医療応用における重要性から多くの最近の研究の主題となっています[10,11,12,13,14,15]。

特に、磁性NPsは細胞分離[16, 17]、MRI[18]、DNA分離[19]、薬物送達[20]、高温療法[21]、癌標的化[22]など、多くの特定部位標的化応用で広く使用されてきました。様々な磁性NPsの中で、磁性酸化鉄ナノ結晶は生体適合性と化学的安定性により、医療応用で最も広く使用されています。磁性NPsを用いた医療応用に多くの努力が注がれてきましたが、水溶液中での良好な分散性、機能性、生体適合性など、依然としていくつかの重要な課題があります。これらの問題を克服するため、多くの研究がカルボキシル基やアミノ基など様々な官能基を用いたNPsの表面修飾に焦点を当ててきました[23]。しかし、磁性酸化鉄NPs表面への官能基付着は時間と労力を要するプロセスです。この事実を踏まえ、コアシェル型Au被覆磁性NPsは、Au表面が生体分子や有機材料と容易に結合できるため魅力的です。

特に、磁性コア-AuシェルNPsの磁気特性は磁気分離を可能にし、MRI画像の分解能を向上させ、高温療法に応用できます。さらに、金の優れた化学結合特性は、特定の癌標的化のための受容体媒介型送達システムの構築に有利です[24,25,26]。

過去数十年間、多くの研究者が癌標的化のための受容体媒介型送達システムを報告してきました[27,28,29]。

癌細胞の受容体媒介標的化は能動標的化の一形態です。標的の選択は効果的な能動標的化の鍵であり、標的は細胞外膜で過剰発現している必要があります。多くの研究者が単クローン抗体を癌治療に使用してきましたが、単クローン抗体療法を従来の化学療法と組み合わせると治療効果が大幅に向上します[30]。単クローン抗体療法の成功にもかかわらず、癌標的化にはいくつかの制限があります。大きなサイズ（約150 kDa）は腫瘍浸透の主要な障害となり[31, 32]、低安定性と低溶解性が広範な使用を妨げています[33]。標的キャリアへの不均一な結合方向も非特異的結合の障害と見なされています。腫瘍浸透性を改善した抗体を作るため、幅広い抗体フォーマットが設計・試験されてきました[34]。古典的抗体とは別に、ラクダ科動物に特有の抗体フォーマットが存在します。いわゆる重鎖抗体（HCAbs）は、これらの種の末梢血と乳に自然に存在します。このようなHCAbsの抗原結合フラグメントは、ラクダ科HCAbの重鎖可変領域（VH）である単一ドメイン（VHH）で構成されます。クローニングとバクテリアや菌類での発現後に組み換えで得られるVHHをナノボディと呼びます。分子量11〜15 kDaで、全単クローン抗体中最小です[35,36,37]。小さなサイズは孤立した場所の抗原に対する標的プローブとして潜在的に適しているだけでなく、容易に修飾可能な末端も癌標的化応用に魅力的です。

適切な標的化と細胞内部化によるNPsの効率的な送達も、送達システムの重要な要素です。ビメンチンが病原体付着と細胞内侵入経路の構成要素として重要な役割を果たすことが報告されています。ビメンチン遺伝子発現の沈黙は食作用を阻害し[38]、切断されたビメンチンは食作用を著しく増加させるシグナルとなります[39]。したがって、細胞表面のビメンチンによる食作用抵抗を中和することは、効率的なナノ粒子送達に重要です。

本研究では、異なる長さのPEG（ポリエチレングリコール）スペーサーで修飾されたナノボディ標識Fe₃O₄-AuコアシェルNPsのエンドサイトーシス経路を調査します。生化学実験で食作用に強い影響を持つことが知られるビメンチン[39]を対照として比較し、NPsの細胞内取り込みに効果的に作用することを確認しました。また、膵臓、乳房、肺、胃癌など様々な癌で過剰発現する細胞表面糖タンパク質であるMuc1を、癌標的化バイオマーカーとして利用しました。結腸細胞でのMuc1受容体媒介エンドサイトーシス経路を通じて、Fe₃O₄-AuコアシェルNPsの効率的な内部化と癌細胞への制御可能な標的化手法を確認しました。

材料と方法

材料

酢酸金(III)（Au(OOCCH₃)₃、99.9%）はAlfa Aesarから入手。その他の化学薬品として、アセチルアセトン酸鉄(III)（Fe(acac)₃、99.9%）、1,2-ヘキサデカンジオール（C₁₄H₂₉CH(OH)CH₂(OH)、90%）、ポリ(エチレングリコール)-ブロック-ポリ(プロピレングリコール)-ブロック-ポリ(エチレングリコール)（PEG-PPG-PEG）、オクチルエーテル（C₈H₁₇OC₈H₁₇、99%）をSigma-Aldrichから購入し、そのまま使用。α-ピリジル-2-ジスルフィド-ω-カルボキシコハク酸イミドエステルポリ(エチレングリコール)（OPSS-PEG-NHS）（2K、5K、10K）はNanocsから購入。重炭酸ナトリウム、WST-1、クロルプロマジン、ニスタチン、シトカラシンD、ダイナソア、ブレフェルジンA（BFA）、モネンシン、トリパンブルーをSigma-Aldrichから購入。Cy3とCy7.5をLumiprobeから購入。抗Muc1 AbをAbcam Inc.（Cambridge, MA）から購入。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、ダルベッコ改変イーグル培地、胎仔牛血清をInvitrogen Corp.から購入。

Fe₃O₄-AuコアシェルNPsの合成

Fe₃O₄-AuコアシェルNPsはナノエマルジョン法で合成しました。コアシェルNPsの合成プロセスは2ステップで構成されます。(1) Fe₃O₄コアNPsの形成、(2) 磁性NPsへのAuシェル被覆。第1ステップでは、Fe(acac)₃（0.1766 gまたは0.5 mmol）、1,2-ヘキサデカンジオール（0.6468 gまたは2.5 mmol）、ブロックコポリマー（ポリ(エチレンオキシド)-ポリ(プロピレンオキシド)-ポリ(エチレンオキシド); PEO-PPO-PEO）（0.4〜1.2 g）をオクチルエーテル中の混合溶液からFe₃O₄NPsを調製しました。混合溶液を300℃で加熱し、Fe前駆体を還元しました。加熱溶液を冷却してFe₃O₄コアNPsの形成を完了しました。第2プロセスは、磁性コア形成後、精製プロセスなしで連続して実施しました。Au前駆体（0.2338 gまたは0.62 mmol）と1,2-ヘキサデカンジオール（0.88 g、3.4 mmol）をFe₃O₄NPsからなるエマルジョンに添加し、混合溶液を230℃で加熱しました。室温まで冷却後、エマルジョンを遠心分離で沈殿させ、コアシェルNPsを分離しました。

組換え抗Muc1-VHH 5-24 K10発現ベクターの構築

フォワードプライマー5'-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3'とリバースプライマー5'-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3'を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施しました。PCR産物をEcoRIとXhoIで消化し、QIA quick Gel Extraction Kit（QIAGEN, Valencia, CA, USA）でゲル精製しました。精製PCR産物をEcoRI/XhoI消化済みpET-23a（Novagen, Darmstadt, Germany）にクローニングしました。大腸菌（E. coli）DH5α（RBC Bioscience, Xindian, Taiwan）を熱ショックで形質転換し、アンピシリン100 μg/mL含有LB寒天プレートで選択しました（Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands）。

組換えタンパク質の発現と精製

組換え抗Muc1-VHH 5-24 K10タンパク質を発現・精製するため、pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10でE. coli BL21株（RBC Bioscience, Xindian, Taiwan）を形質転換しました。バクテリアをアンピシリン（100 μg/mL）含有LB培地で培養しました。イソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG）（Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands）を最終濃度0.4 mMで添加し、37℃で5時間誘導しました。バクテリアペレットをライシスバッファー（50 mM NaH₂PO₄、pH 8.0; 300 mM NaCl）に再懸濁し、氷上で10分間超音波処理しました。超音波処理溶解液を4℃で20,000×g、20分遠心分離し、Ni-NTA His·Bind Resin（Peptron, Daejeon, Korea）にかけました。レジンに結合したHisタグタンパク質を洗脱バッファー（50 mM NaH₂PO₄、pH 8.0; 300 mM NaCl; 150 mMイミダゾール）で洗い出しました。精製タンパク質を15% SDS-PAGEゲルで分離しました。

コアシェルFe₃O₄-Au NPsの修飾

様々な長さ（2、5、10 K）のOPSS-PEG-NHSを0.1 M重炭酸ナトリウムに溶解し、チオール基を活性化しました。活性化OPSS-PEG-NHSを合成コアシェルFe₃O₄-Au NPs溶液に添加し、4℃で12時間撹拌しました。活性化OPSS-PEG-NHSのチオール基がコアシェルNPsのAu表面と共有結合しました。その後、ナノボディ溶液（0.25 mg/mL）をPEG化Fe₃O₄-AuコアシェルNPsに添加し、4℃で12時間反応させました。ナノボディ末端の10個のリシン（K）テールのアミノ基が、pH 8.3でOPSS-PEG-NHSのNHS基と共有結合しました。Cy3とCy7.5をナノボディの残存アミノ基に標識しました。

内部化曲線

CT26細胞をクリアボトム96ウェルプレートに5×10³ cells/wellで播種し、250 μL培養液で37℃、5% CO₂、暗所で24時間培養しました。培地を除去し、50 μg/mL Cy3標識Fe₃O₄-Au NPs、PEG-Cy3またはPEG-ナノボディ-Cy3標識NPsを含む250 μL新鮮培地を各ウェルに添加しました。さらに、異なる期間（0、10、20、30、60、120、360分）培養しました。その後、PBSで3回洗浄して遊離NPsを除去し、膜不透過性蛍光クエンチャーとしてトリパンブルーを用いてSpectraMAX GEMINI（Molecular Devices, CA, USA）で各ウェルの蛍光を測定しました。各実験は同量のNPs（50 μg/mL）で実施し、3回繰り返しました[40]。

阻害試験

CT26細胞をクリアボトム96ウェルプレートに5×10³ cells/wellで播種し、250 μL培地で37℃、5% CO₂、暗所で24時間培養しました。培地を除去し、20 μg/mLクロルプロマジン（CPZ）、50 μg/mLニスタチン、20 μg/mLシトカラシンD、25 μg/mLダイナソア、20 μg/mL BFA、140 μg/mLモネンシン、または5 μM抗Muc1 Abを含む250 μL新鮮培地を添加し、1時間培養しました。

培地を再度除去し、50 μg/mL Cy3標識Fe₃O₄-Au NPs、PEG-Cy3標識NPs、PEG-ナノボディ-Cy3標識NPs、またはビメンチン-Cy3標識NPsを含む250 μL培地を添加しました。

37℃、5% CO₂で1時間後、PBSで3回洗浄して遊離NPsを除去し、トリパンブルーを膜不透過性蛍光クエンチャーとしてSpectraMAX GEMINI（Molecular Devices, CA, USA）で蛍光を測定しました。各実験は同量のNPs（50 μg/mL）で実施し、4回繰り返しました。

結果と考察

コアシェルNPsは公表手法[16, 17]で合成しました。図1a、bの透過電子顕微鏡（TEM）観察で、Fe₃O₄-AuコアシェルNPsが平均直径13.5 nmの球形で、狭いサイズ分布を持つことが示されました。

コアNP（Fe₃O₄）の約8.5 nmからの増加は、コア表面への約2.5 nm厚のAuシェル被覆によるもので、コアシェルNPが形成されました。Fe₃O₄-AuコアシェルNPの高分解能TEM像と高速フーリエ変換（FFT）解析は補足情報Fig. S1に含まれています。

有機溶媒で製造された生成物は磁気分離で精製し、水相へ移しました。

コアシェルNPsは、NPs上に残存するブロックコポリマーにより、表面修飾なしで水中に良好に分散し安定していました。

図1c、dに水溶液中のNPsの外部磁場印加前後の様子を示します。外部磁場下では、コアシェルNPsが均一分散状態（図1c）から透明な溶液（図1d）へ急速に変化しました。

コアシェルNPsの吸収バンドをUV-Vis分光光度法で調べました。図1eに示すように、約530 nmに吸収ピークが現れ、NPs表面にAuが存在することを示しました（補足情報Fig. S2にFe₃O₄-AuコアシェルNPsのEDXデータ結果を含む）。試料が精製されていたため、光学結果はコアシェル構造の形成を実証しました。

磁気ヒステリシスループを振動試料磁力計測定で取得し、Fe₃O₄コアとコアシェルNPsの磁気特性を調べました。両NPsとも室温で矯顽力約0 Oeの超常磁性挙動を示しました（図1f）。

先行研究で報告されているように、コアシェルNPsの感受性は磁性酸化鉄NPsより高く、これは近接効果と独自の空間配置に部分的に起因する可能性があります[41, 42]。また、コアNPsとコアシェルNPsの飽和磁化は、それぞれ10 kOeで約37 emu/gと約21 emu/gでした。Msの差は、コアシェルNPsに非磁性成分（Au）が存在することに起因します。

VHH 5-24 K10遺伝子がPCR増幅後、インフレームでクローニングされpET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10が作製されました（図2a）。組換えタンパク質は、pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10で形質転換したE. coli BL21でIPTG誘導後発現し、Ni-NTA His·Bind Resinで精製されました。組換え抗Muc1-VHH 5-24 K10は、E. coliで可溶性18 kDaタンパク質として容易に発現しました。1 L培養から1±0.5 mgの精製組換え抗Muc1-VHH 5-24 K10を得ました。

精製タンパク質を15% SDS-PAGEゲルで検証しました。精製タンパク質のコマッシーブルー染色で95%以上の純度であることが確認されました（図2b）。合成Fe₃O₄-Au NPsは、PEG化、抗体標識、染料標識の3ステップで修飾しました（図2c）。各修飾ステップ後、ゼータ電位を測定して修飾成功を確認しました。表1に修飾が対応するゼータ電位に及ぼす影響を示します。裸コアシェルNPsのゼータ電位は-19.8±6.68 mVでした。NPsのPEG化にはOPSS-PEG-NHSを使用しました。異なるサイズのナノコンプレックスシリーズを作製するため、様々な長さ（2K、5K、10K）のOPSS-PEG-NHSを使用しました。

PEG化後、ゼータ電位は低下しました（2K、5K、10Kでそれぞれ-44.9±8.19 mV、-40.7±7.88 mV、-39.6±8.74 mV）。

興味深いことに、ナノボディ標識後、ゼータ電位は明確に上昇しました（2K、5K、10Kでそれぞれ-38.5±5.61 mV、-23.3±8.61 mV、-31.8±7.37 mV）。

染料標識後もゼータ電位は上昇しました（2、5、10Kでそれぞれ-12.5±7.25 mV、-17.7±3.94 mV、-10.6±4.72 mV）。

裸Fe₃O₄-AuコアシェルNPsのゼータ電位は-19.8±6.68 mVでした。PEG化後、ゼータ電位は約-40 mVまで低下しました。これらの結果は、PEG分子が負に帯電したN-ヒドロキシコハク酸イミド官能基を持つため、コアシェルNPsのAuシェルに共価結合で良好に結合したことを示します。一方、ナノボディへの染料標識後、ゼータ電位が上昇しました（NP-PEG2K-ナノボディで-38.5±5.61 mV、NP-PEG2K-ナノボディ-染料で-12.5±7.25 mV）。これは組換えナノボディが末端に10個のリシンテールを持つため妥当な結果です。各タイプのナノボディをゼータ電位測定で分類し、ナノボディへの抗体結合を決定するため、各ナノボディタイプの蛍光を測定しました。

図3に示すように、阻害剤がない条件下では、すべてのタイプのナノ粒子とナノボディがCT26粘液細胞に良好に取り込まれ内部化することを確認しました。50 μg/mL Cy3標識Fe₃O₄-Au NPs、PEG-Cy3標識NPs、PEG-ナノボディ-Cy3標識NPsを培地に添加した細胞を、異なる期間（0〜360分）培養後、培地除去、遊離NPs洗浄、トリパンブルーで細胞総蛍光測定により細胞内部化曲線を取得しました（図3）。

蛍光強度測定結果によると、NPsは1時間以内に細胞内に取り込まれました（図3a）。NPの蛍光強度は1時間以内に最大に達し、定常状態到達後は徐々に減少しました。Abの有無によるわずかな時間差はありますが、単位培養時間あたりの蛍光強度は裸NPsの結果と有意に異なりませんでした（図3b）。図3cに示すように、Muc1とビメンチンの異種抗体を用いた場合、NPsの細胞取り込みと内部化へのAbの効果は無視できるレベルでした。

WST-1アッセイで、Fe₃O₄-AuコアシェルNPsの濃度と表面修飾に依存するCT26粘液細胞の生存率（%）を、様々な曝露時間後に推定しました（図4a、b）。CT26細胞の生存率は、24時間と48時間曝露後、用量変化やNPs表面修飾の有無にかかわらず有意な差は見られませんでした。細胞生存率は、裸Fe₃O₄-Au NPs（図4a）と表面修飾NPs（図4b）の両方で90%以上でした。

図5は、NPsがCT26粘液細胞に様々なエンドサイトーシス経路（クラスリン媒介、カベオラ媒介、食作用/マクロピノサイトーシス経路）で入ることを示しています。興味深いことに、図5bでは抗Muc1 Abも主にPEG-ナノボディ-Cy3標識NPsのエンドサイトーシスに影響を与えました。NPs内部化経路を理解するため、特定の化学阻害剤でエンドサイトーシス経路を阻害してみました（図5）。エンドサイトーシス経路はよく知られているように、クラスリン媒介、カベオラ媒介、マクロピノサイトーシス/食作用の3タイプに分類されます。

本研究では、阻害剤を用いてナノボディ標識NPsの内部化を調査する第一アプローチとしました。CPZ（クラスリン媒介エンドサイトーシス阻害剤）、ニスタチン（カベオラ媒介エンドサイトーシス阻害剤）、ダイナソア（ダイナミン阻害剤）、シトカラシンD（食作用/マクロピノサイトーシス阻害剤）、BFA（ゴルジ体破壊剤）、モネンシン（リソソーム阻害剤）、抗Muc1 Ab（受容体/トランスポーター特異的競合相手）を細胞と1時間インキュベートしました。CPZ、ニスタチン、ダイナソア、シトカラシンDがNPsのエンドサイトーシスに影響を与えました（図5a）。

標的モエティは癌標的化の成功の鍵であり、癌治療において極めて重要です。標的化には、治療効率を高め副作用を制限する効果的な表面修飾が非常に重要です。ナノボディ標識Fe₃O₄-AuコアシェルNPsは、合成NPsと組換えナノボディから無事に作製されました。表1は各修飾ステップが成功裏に実施されたことを明確に示しています。

細胞生存率はナノ材料の生物学的応用における必須要素の一つです。細胞生存率は裸コアシェルNPsと修飾NPsの両方で90%以上でした（図4a、b）。これらの結果は、裸Fe₃O₄-Au NPsと修飾NPsが濃度依存性および修飾依存性の細胞毒性を有意に引き起こさず、修飾NPsが生物学的応用に適していることを示唆します。

内部化効率と阻害剤効果の研究は、NPsが細胞に入るメカニズムを理解する上で重要な情報を提供します。PEG化NPsは裸NPsより相対的にゆっくり内部化しましたが、ナノボディ標識NPsは裸NPsよりわずかに速く内部化しました（図3a、b）。PEG化はNPsの内部化を防ぐよく知られた表面修飾法であるため、PEG化NPsの内部化傾向は容易に説明できます。さらに、ナノボディがNPsのエンドサイトーシスを誘導しました。ナノボディの特異性を確認するため、ビメンチンAb標識NPsの内部化率を確認しました。興味深いことに、ビメンチンAb標識NPsは細胞内部化を促進しませんでした（図3c）。

これらの結果は、ナノボディがCT26粘液細胞へのナノ材料内部化を効果的に誘導でき、NPs外膜の特定修飾により内部化傾向を制御できることを示唆します。また、ナノボディ標識NPsのエンドサイトーシスメカニズムは、阻害試験と共焦点顕微鏡イメージングで明確に示されました。ナノボディ標識NPsと非標識NPsの両方で、CPZ、ニスタチン、ダイナソアと培養した場合、光蛍光値が同様に減少しました（図5a、b）。CPZ、ニスタチン、ダイナソアはそれぞれ、クラスリン媒介エンドサイトーシス、カベオラ媒介エンドサイトーシス、親膜から新生小胞の芽生えと切り離しに関与する大型GTPアーゼであるダイナミンを阻害する役割を果たします。したがって、ダイナミンがクラスリン媒介とカベオラ媒介エンドサイトーシスの両方の小胞生成に密接に関与しているため、両ケースで光蛍光値が急速に減少しました。図5aに示すように、非標識NPs（図5a）とナノボディ標識NPs（図5b）の両方で光蛍光の急速な減少が見られました。

特に、ナノボディ標識NPsはCPZ、ニスタチン、ダイナソアで有意に低い光蛍光値を示しました。さらに、非標識NPsは、食作用のためのアクチンフィラメント重合をブロックする細胞透過性毒素であるシトカラシンDを適用した場合、ナノボディ標識NPsより強く影響を受けました[43]。これらの結果は、非標識NPsがクラスリン媒介エンドサイトーシス、カベオラ媒介エンドサイトーシス、食作用など複数のメカニズムで内部化されることを示唆します。結果として、ナノボディ標識NPsの細胞内部化はクラスリン媒介とカベオラ媒介エンドサイトーシスに依存します。さらに、Muc1抗体で細胞を培養した場合、ナノボディ標識NPsの細胞取り込み量が大幅に減少しました（図5b）。この結果は、遊離Muc1抗体が修飾NPs上のナノボディの競合相手としてCT26細胞膜への付着に働き、Muc1抗体が修飾NPsの細胞内部化で重要な役割を果たすことを示しています。特筆すべきことに、ビメンチンAb標識NPsは阻害能力の点でナノボディ標識NPsと明確な違いを示しました。ビメンチン標識NPsの光蛍光は複数の阻害試験下で影響を受けず、NPsがニスタチン、ダイナソア、シトカラシンD、さらにはMuc1 Abによって最小限しか影響を受けないことを示しました。この現象は、ビメンチンが生化学的に食作用に強力に影響することが確認されていることの証拠となり得ます[39]。したがって、この結果はMuc1 Abが特定分子を標的とし、特定のエンドサイトーシスを制御できることを示しています。

図6に示すように、裸コアシェルNPsとPEG-ナノボディ標識NPsをCy7.5標識で処理した場合、ダイナソア阻害がない条件下で両者とも類似した細胞取り込みを示しました。ダイナソア阻害により、PEG-ナノボディ標識NPsの細胞内部化が裸NPsと比較して明確に低下しました（図6b、下段）。これらの結果は、裸NPsの非特異的エンドサイトーシスと、ダイナミン分子を介したナノボディ標識NPsの制限付きエンドサイトーシスという2つのエンドサイトーシスメカニズムが存在することを示唆します。一度ナノボディが細胞外膜に付着すると、クラスリン媒介とカベオラ媒介メカニズムの同時活性化により、ナノボディ標識NPsが容易に細胞膜を通過できるようになります。したがって、CT26粘液細胞でのナノボディ標識NPs内部化の主メカニズムは、クラスリン媒介とカベオラ媒介エンドサイトーシスの両方であると推測されます。

結論

癌標的化と薬物、遺伝子、ペプチドなどの外来物質の制御可能な挿入のためのナノ材料は、医療応用における重要な進歩です。これらの馴染み深いが創造的な概念は、新たな治療法の戦略を提供できます。本論文では、Muc1抗体によるPEG化後のFe₃O₄-AuコアシェルNPsの細胞取り込み向上を実証しました。ナノボディ標識NPsの主なエンドサイトーシスメカニズムを実証し、大腸がん細胞での制御可能な特定エンドサイトーシスの可能性を示しました。これらの知見は、ナノボディ標識NPsと大腸がん細胞間の標的化に関する洞察を提供し、高効率標的キャリアの設計を支援します。