妊娠中の二酸化チタンナノ粒子への曝露は、母体の腸内細菌叢を変化させ、ラットの血糖値を上昇させた

要約

二酸化チタンナノ粒子（TiO ₂ NP）は世界中で何十年も使用されており、妊娠中の女性はそれらにさらされることを避けられません。研究により、TiO ₂ NPは多くの種類の細菌を殺すことができますが、特に妊娠中に腸内細菌叢の組成に影響を与えるかどうかはほとんど報告されていません。また、妊娠中の女性にどのような悪影響がもたらされる可能性があるかも不明でした。この研究では、ラットの出生前暴露モデルを確立して、TiO ₂の影響を調査しました。腸内細菌叢のNP。我々は増加傾向を観察したが、通常の妊娠過程中の妊娠日（GD）10およびGD 17で、対照群と曝露群の間でアルファ多様性の有意な変化は観察されなかった。それぞれの異なる時点には、固有の腸内細菌叢の操作分類単位（OTU）の特性がありました。 Ellin6075の存在量はGD10とGD17で減少し、クロストリジウムはGD 10で増加し、DehalobacteriaceaeはGD17でTiO ₂後に減少しました。 NPの曝露。観察されていない状態の再構築（PICRUSt）予測によるコミュニティのさらなる系統学的調査は、2型糖尿病関連遺伝子が増強され、タウリン代謝が第2トリメスターで弱まったことを示しました。さらなる研究では、ラットの空腹時血糖値がGD 10（ P ）で有意に増加したことが示されました。 <0.05）およびGD 17（ P <0.01）曝露後。私たちの調査では、TiO ₂ NPは妊娠中に腸内細菌叢の変化を誘発し、妊娠中のラットの空腹時血糖を上昇させました。これにより、妊娠中の女性の妊娠糖尿病の潜在的なリスクが高まる可能性があります。

はじめに

二酸化チタンナノ粒子（TiO ₂ NP）は、最も広く使用されているナノ材料の1つであり、日焼け止め、塗料、インク、および食品に簡単に含まれています[1、2]。それらは、市販製品の使用中に容易に放出され、人体に入ることができます。特に、妊娠中の女性はそれらにさらされることを避けられません。動物実験では、卵巣および生殖器系の機能障害が観察され[3]、成体の雌マウスがTiO ₂に曝露されると、モノアミン作動性神経伝達物質も損なわれることが示されました[4]。 NP。さらに、妊娠中のマウスがTiO ₂に曝露された後も、妊娠の合併症と不利な出産の結果が観察されました。 NP [5]。上記のすべての研究は、TiO ₂ NPは、成体の雌動物と妊娠中の雌に有害でしたが、そのメカニズムは完全には理解されていませんでした。したがって、TiO ₂の安全性評価のために、相対的な研究を実施する必要があります。 NP。

TiO ₂ NPは一種の強力な抗菌剤として使用されます。 黄色ブドウ球菌を含む多くの種類の細菌を殺すことができます、サルモネラ菌、ストレプトコッカスミュータンス 、など[6]。抗菌効果は実際には非選択的でしたが、現在の研究のほとんどは主に有害な細菌を殺す効果に焦点を当てていますが、TiO ₂かどうかを報告したものはほとんどありません。 NPはプロバイオティクスや他の共生細菌を殺し、人間に悪影響を及ぼします。 TiO ₂かどうかに関する研究 NPは腸内細菌叢の正常な組成を変化させ、妊娠中の女性に不利益をもたらすでしょう。したがって、腸内細菌叢の観点からこの研究を実施しました。

最近、ますます多くの研究が、腸内細菌叢が2型糖尿病[7]や肥満[8]を含む人間の病気と密接に関連していることを示しました。プロバイオティクスは、妊娠糖尿病の妊婦の代謝に影響を及ぼし[9]、胎児の糖尿病関連遺伝子のメチル化を変化させる可能性があります[10]。研究によると、成体マウスがTiO ₂に曝露されると、血漿グルコースレベルが上昇した。 12週間のNP [11]。妊娠中の女性の血糖値が曝露後に増加するかどうか、および曝露期間が短縮されるかどうかは報告されていません。

上記のすべての研究は、TiO ₂ NPは腸内細菌叢に影響を及ぼし、血漿グルコースレベルを上昇させる可能性がありますが、腸内細菌叢と母体の血糖値との関連を証明する直接的な証拠はなく、メカニズムも明確ではありませんでした。以前の研究は主に成体動物の研究とTiO ₂の効果に焦点を当てています妊娠中の女性のNPは、腸内細菌叢の観点から研究されただけです。この研究では、ラットの妊娠曝露モデルを確立して、母体の腸内細菌叢が変化するかどうか、および妊娠中の雌がTiO ₂に曝露した後にそれらがどのように変化するかを調査しました。 NP、そして私たちは、腸内細菌叢によって妊娠中の女性にどのような悪影響がもたらされるかという問題に、TiO ₂の後に変化するという問題に答えようとしました。 NPの曝露。私たちの研究は、TiO ₂の安全性に関する懸念を提起しました妊娠中の女性へのNPと私たちは潜在的なメカニズムを明らかにしました。

材料と方法

研究デザイン

Weir、A。と彼の同僚が人間で行った研究[12]に基づいて、ラットの暴露経路と暴露量が決定された。雌ラットに5mg / kg体重/日のTiO ₂を毎日強制経口投与した。妊娠5日から18日までのNP、および進行状況を図1aに示しました。経口暴露前に各ラットの体重を測定し、メチルセルロースの0.5％をビヒクル対照として投与しました。

動物

動物実験は倫理委員会の許可を得て実施されました。 Sprague-Dawley（SD）ラットは、Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.、Ltdから購入しました。雌ラット（ n =8、12週齢）は雄ラット（ n ）から分離されました =8、14週齢）、同じ性別のラットを大きなケージに入れて飼育しました。すべてのラットは、温度（22±2°C）および湿度制御（40〜60％）の条件で飼育され、12時間の明暗サイクルで1週間休憩しました。次に、雌ラットをランダムに対照群に分けた（ n =4）および曝露グループ（ n =4）、個々のケージで1：1の比率でオスと交配します。毎朝膣栓を観察し、膣栓の存在により妊娠を確認し、妊娠0。5日（GD 0.5）として記録し、妊娠したラットを別々のケージで飼育しました。

TiO ₂ NPの準備と管理

TiO ₂ NPは、Sigma-Aldrich（13463-67-7）から購入した市販製品です。 TiO ₂のストック溶液以前の研究[13]に従って、NPを5 mg / mlの濃度でメチルセルロース（0.5％）に溶解し、30分間超音波処理しました（100 W）。 TiO ₂の流体力学的直径メチルセルロース中のNPは、動的光散乱法（DLS）で測定されました。

糞便の収集と糞便の全DNA調製

各ラットの糞便は、妊娠の過程でそれぞれGD 0（交配前）、GD 10、およびGD17で収集されました。細菌の多様性を分析する前に、糞便を-80°Cで保存しました。 Power Soil DNAキット（Mo Bio Laboratories、Carlsbad、California、USA）を製造元のプロトコルに従って使用して、糞便の全DNAを抽出しました。そして、DNA濃度はNanoDrop分光光度計（NanoDrop™2000 / 2000C、米国）によって測定されました。

16SrRNA遺伝子シーケンシングとデータ分析

16S rRNA遺伝子の細菌配列決定は、Illumina MiSeqプラットフォーム（Hangzhou Guhe Information and Technology Co.、Ltd.、Zhejiang、China）を使用して実行されました。細菌の16SrRNAのV3およびV4領域は、前述のように特定のプライマーを使用して増幅されました[14]。そして、DNAは増幅および精製された後、イルミナMiSeqシーケンスにかけられました。シーケンシングデータは、以前の研究[15]に従って、微生物生態学（QIIME）への定量的洞察を使用して処理されました。データは元のDNAフラグメントから読み取られてマージされ、読み取られた長さは400〜500bpでした。キメラ配列は、発生した場合はQIIMEを使用してさらに調べました。

血液サンプルの収集と血糖値の測定

糞便を採取したときに、それに応じてすべての雌ラットの空腹時静脈血も採取した。血液サンプルは、GD 0、GD 10、およびGD17でそれぞれ12時間の飢餓後の朝に尾静脈から収集されました。次に、空腹時血糖値は、収集後、メーカーのプロトコルに従ってRocheACCU-CHEK®Performaメーターを使用して直ちに測定されました。

統計分析

統計分析はGraphpadPrism6を使用して実行されました。細菌の多様性に関するすべてのデータは、平均±SEとして箱ひげ図で示され、すべてのグループ間の有意性は、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定によって調べられました。 P <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果と考察

TiO ₂の特性 NP

TiO ₂の主な特徴 NPは、動物実験の前に測定および提示されました。図1bは、TiO ₂の視野を示しています。透過型電子顕微鏡下のNP。 TiO ₂の形態 NPはほぼ球形で、一次直径は約21nmでした。メチルセルロース溶液の平均流体力学的直径は約199.5nmでした（図1c）。 TiO ₂の純度 NPは≥です 99.5％、表面積は35〜65 m ² / gメーカーのレポートによると。最近の研究では、ナノグレードとファイングレードの両方のTiO ₂ 経口暴露後の成体動物の血糖値を上昇させる可能性があり[11、16]、妊娠中の雌の血糖値が影響を受けるかどうかは不明でした。この質問と根本的なメカニズムを明確にするために、妊娠ラットの曝露モデルを確立して、TiO ₂の毒性を評価しました。 NPと妊娠中のラットへの害を調査する。

ほとんどのTiO ₂ 製品中の粒子は主に60〜300 nmの範囲の一次サイズであり、少数派（〜20％）は<100 nm [17]でしたが、最近の研究ではTiO ₂ チューインガムなど、一部の食品のNPは、私たちが知っているよりもはるかに大きい（〜90％）[18]。知られているように、小さいナノ粒子は毒性が高く[19、20]、女性は妊娠中の有害な基質に対してより敏感であったため、TiO ₂の少数派の部分です。 NPは、大多数の微粒子よりも妊娠中の女性に無視できない影響をもたらす可能性があります。この研究では、妊娠中のラットモデルをナノサイズのTiO ₂に曝露しました。（〜21 nm）TiO ₂の潜在的なリスクを調査する妊娠中の女性へのNP。

通常の妊娠中の細菌の多様性の変化

妊娠中、妊娠中の女性は物理的および化学的曝露に対してより敏感になります。受精卵の着床に対する手動操作の影響を減らすために、胞胚が着床を終えた最初の曝露日として5日目を選択しました。 GD 17は出産前の最終日であり、GD10は妊娠中期です。妊娠中の腸内細菌叢の正常な動態は、対照群の3つの時点（GD 0、GD 10、およびGD 17）からの糞便サンプルを使用して調べられました。 Shannon、Simpson、Chao1のインデックスを計算することで、腸内細菌叢のアルファ多様性を経時的に観察しましたが、その差は有意ではありませんでした（図2a）。非計量的多次元尺度構成法（NMDS）分析に基づくと、異なる時点のサンプルにも顕著な違いは見られず（図2b）、これは以前の研究と一致していました[21、22]。ベン図（図2c）は、異なる時点のサンプルにおける共有および特定の運用分類単位（OTU）を示し、対照群の3つの時点（GD 0、GD 10、GD 17）の共有OTUは164でした。これらの結果は、特定のOTUの数が妊娠中の時間とともに増加したことを示しています。私たちの結果は、腸内細菌叢が正常な妊娠中に有意な変化を示さず、その変化が悪影響をもたらさず、母体にさえ有益であることを示しました。私たちの結果は、腸内細菌叢の変化は妊娠過程の結果である可能性があり、妊娠中の膣内細菌叢の変化[24]と同様に、妊娠中の女性のホルモン変化[23]によって引き起こされる可能性があることを示唆しました。また、それは正常な妊娠の前提条件かもしれません。

TiO ₂に曝露した後の細菌の多様性の変化妊娠中のNP

研究によると、腸内細菌叢は正常な免疫状態を維持するために重要であることが示されています[25]。通常の妊娠中の腸内細菌叢の自然な変化は、受精卵の着床を受け入れるように免疫系を調節する可能性があります[26]。一方、正常な妊娠中の腸内細菌叢の自然な変化は、妊娠中の女性が妊娠中の代謝変化に適応するのにも役立つ可能性があります。腸内細菌叢の変化が「適切な程度」を超えると、妊娠に悪影響を与える可能性があります。そこで、TiO ₂後の微生物相の変化を分析しました次の部分でのNPの露出。 TiO ₂の効果妊娠中の細菌多様性に関するNPは、女性がナノ粒子に曝露された後のGD 0、GD10、およびGD17でのアルファ多様性とベータ多様性を分析することによって評価されました。結果は、アルファ多様性がシャノンで増加傾向を示し、シンプソン指数（ P ）に有意な変化を示したことを示しました。 <0.05）通常の妊娠と比較した場合、Chao1に違いはありません（図3a）。 NMDS分析（図3b）でも、通常の妊娠の場合とは異なり、TiO ₂に曝露した後では、有意差は示されませんでした。 NP、サンプル中の特定のOTUは、妊娠中期および後期に減少しました（図3c）。通常の妊娠中、腸内細菌叢の多様性に明らかな変化はありませんでしたが、雌マウスがTiO ₂に曝露された後、母体の糞便中の細菌多様性の増加傾向が観察されました。妊娠中のNP。これはTiO ₂が原因である可能性があります。 NPは非常に効率的な抗菌剤であり、多くの種類の細菌を殺すことができます。それらは腸内の優勢なバクテリアを抑制し、元々抑制されていたバクテリアはこの条件下で繁殖することができました。研究によると、腸内細菌叢は、糖尿病、肥満、高血圧[27]、癌[28]などの多くの病気に関連していることが示されています。腸内細菌叢と妊娠糖尿病との関連も確認されています[29]。曝露後にGD0、GD10、GD17の間に有意な変化が観察されなかった理由は、TiO ₂である可能性があります。 NPは「比較的安全」であるか、TiO ₂によってマイクロバイオータの変化が誘発されました NPの曝露は、妊娠に関連する微生物叢の変化によってカバーされる可能性があります。

TiO ₂に曝露された後の第2トリメスターにおける腸内細菌叢の変化 NP

妊娠の影響を除外し、TiO ₂の独立した影響をさらに調べるため腸内細菌叢のNPについては、第2トリメスター（GD 10）から収集したサンプルを使用して、対照群と治療群の腸内細菌叢の違いを比較しました。 Shannon、Simpson、Chao1のインデックスによると、アルファダイバーシティの有意差は見つかりませんでした（図4a）。 NMDS分析に基づいて、2つのグループの間に顕著な違いが観察されました（図4b）。図4cは、TiO ₂の曝露を示しています NPは、コントロール（Venn）と比較して治療グループのいくつかの特定のOTUの変化をもたらしました。これらの結果は、TiO ₂ NPは比較的安全であり、明らかな腸内毒素症を誘発することはありません。しかし、植物相の構成、すなわち特定の属の豊富さは、それぞれ妊娠後期と妊娠後期に変化しました。妊娠中に起こった変化の潜在的なリスクをさらに見つけ、どのような悪影響がもたらされる可能性があるかを調査するために、バイオインフォマティクスで腸内細菌叢の機能的変化を特定しました。結果は、2つの優勢なバイオマーカーであるEllin6075とClostridialesがLefSe分析（線形判別分析（LDA）> 2）によって発見されたことを示しました。 Ellin6075の存在量は減少し、クロストリジウムはTiO ₂後に増加しました。それぞれNP曝露（図4d）。 Ellin6075はオーストラリアの農場から分離されましたが、その表現型の特徴や機能に関する情報はほとんど入手できなかったため、妊娠への影響についてはさらに調査する必要があります。 Yanと彼の同僚は、クロストリジウムが肥満SDラットで有意に増加したことを示しました[30]。これは、クロストリジウムが高レベルの血糖と共存しているという我々の発見と一致していました。腸内細菌叢の変化が妊娠に及ぼす影響を明らかにするために、観察されていない状態の再構築（PICRUSt）によるコミュニティの系統発生学的調査を使用して糞便サンプルの遺伝子の違いを予測し（図4e）、2型真性糖尿病に関する遺伝子が機能と脂質生合成タンパク質は治療群で強化されたが、タウリンとヒポタウリンの代謝は弱まった。研究者たちは、腸内細菌が酢酸やプロピオン酸などの短鎖脂肪酸を生成し、宿主の血糖値を調節できることを実証しました[31]。また、タウリンとヒポタウリンの変化は、タウリンが母体の血糖値をダウンレギュレーションする可能性があるという事実にも一致していました[32]。

TiO ₂に曝露した後の妊娠後期における腸内細菌叢の変化 NP

妊娠後期の腸内細菌叢は、GD17で収集された糞便サンプルによって調べられました。アルファダイバーシティに有意差は見られませんでした（図5a）。これらのサンプルは、NMDSモデルの対照群と治療群によって有意に分類されました（図5b）。図5cに示すように、観察されたOTUの数の減少が治療群で見られました。また、Lefseを使用して潜在的なバイオマーカーを特定しました。特に、図5dに示すように、Ellin6075の存在量は、妊娠後期（LDA> 2）の治療群で減少し続け、Dehalobacteriaceaeの存在量はTiO ₂への曝露によって減少しました。 NPも同様です（LDA> 2）。この段階では、糖尿病関連の遺伝子変化は観察されませんでした。これは、後期ではなく、後期がTiO ₂の敏感なウィンドウであることを示唆しています。母体の血糖値を上げるためのNP。その結果は、妊娠後期（約26週目）に妊婦の妊娠糖尿病をスクリーニングするために、医師がヒト妊娠糖尿病の一般的な診断である経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）を実施したという臨床認識と一致していました。妊娠中の女性）。結果は、妊娠中のラットがTiO ₂に曝露された後、GD10で空腹時血糖が上昇したことを示しました。 NPであり、成体動物で報告された以前の結果（〜12週間）よりも前であり[11]、これは妊娠中の雌が成体よりも敏感であるという事実を証明しました。

TiO ₂の影響出生前暴露後の血糖値のNP

PICRUSt予測の結果を証明するために、ラットの空腹時血糖をそれぞれGD10とGD17で測定しました。妊娠中のラットがTiO ₂に曝露された後 12日間のNP（GD5〜GD17）、空腹時血糖値を測定しました。図5eに示すように、対照群と比較して、ラットの空腹時血糖値は両方のGD10で有意に増加しました（ P <0.05）およびGD17（ P <0.01）TiO ₂にさらされた後 NPは、以前の報告に準拠しており、TiO ₂ NPは成体動物の血糖値を上昇させる可能性があります[11、33]。しかし、対照群とGD 17の間の値の増加は比較的小さく（〜0.5 mM）、妊娠糖尿病の基準に達しませんでした[34]。結果は、母体の孤独がTiO ₂にさらされたことを示唆しました妊娠中のNPは妊娠糖尿病を誘発するのに十分ではありませんが、血糖値の上昇は妊娠中の女性とその子孫に悪影響を与える可能性があります。また、妊娠中に高血糖にさらされた母親は、胎児の肥満や耐糖能異常のリスクを高める可能性があると報告されており[35]、これもTiO ₂ NPは子孫に潜在的なリスクをもたらす可能性があります。