ショウガとニンニクからグリーン合成した酸化ニッケルナノ粒子が強力な抗菌性と触媒性能を示す

概要

化学毒性を低減した植物合成ナノ粒子（NP）が世界的に注目され、最近ではナノテクノロジーの不可欠な構成要素となっています。我々は、繊維工業における合成殺菌剤および触媒剤に置き換えるため、植物化学的に（ショウガとニンニク）還元されたNiO-NPを調製しました。NPを紫外可視分光法（UV-Vis）、X線回折（XRD）、X線光電子分光法（XPS）、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）、エネルギー分散型X線分光法（EDS）、走査型電子顕微鏡（SEM）、透過型電子顕微鏡（TEM）で特性評価しました。NPの合成はXRDとUV-Visにより確認され、350 nmに強い吸収を示し、サイズはショウガで16-52 nm、ニンニクで11-59 nmの範囲でした。走査型および透過型電子顕微鏡により、立方体形とより球形に近いNPの多形性が確認されました。さらに、NiO-NP合成に用いられたニンニクとショウガエキスの正確な量（1:3.6 ml）がFTIRにより成功裏に確認されました。ニンニクにより植物化学的に還元されたNPは、濃度依存的に（0.5、1.0 mg/50 μl）多剤耐性Staphylococcus aureusに対する殺菌活性を増強し、メチレンブルー（MB）染料も効率的に分解しました。結論として、グリーン合成NiO-NPは薬剤耐性解決と環境に優しい触媒剤として、産業規模での採用が期待される迫り来る活性剤です。

はじめに

ナノテクノロジーは、少なくとも1次元のサイズが1-100 nmの物質を扱い、そのサイズを制御することで材料を設計する能力を提供します[17]。NPは、医学を含む様々な分野で独自の化学的、物理的、生物学的特性により大きな注目を集めています。それらの特性はナノメートルスケールでのサイズ変更により容易に変化させられます[47]。

ニッケル（Ni）と酸化ニッケル（NiO）NPは、エネルギー技術、磁性、生物医学、電子工学において特異な磁気的、触媒的、電子的特性により重要です[9, 26, 35]。3.6-4.0 eVの幅広いバンドギャップと立方晶格構造を持つNiOは、p型半導体として潜在能力を有します。これらのNPは高い化学的安定性、超電容特性、電子移動能力、電気触媒性を持ち、生物医学、光触媒、抗炎症、抗菌活性に利用されています[8, 10, 11, 45]。感染症の出現、特に抗生物質耐性（MDR）菌は、世界中の公衆衛生を蝕んでいます。一般に、病原性グラム陽性（G+）およびグラム陰性（G-）細菌株は主要な公衆衛生上の脅威です。

酪農業では、牛乳房炎はミルクの化学的、微生物学的、物理的変化、乳腺腺組織の病理的変化を特徴とする、経済的影響の大きい主要な問題疾患です[6, 19]。乳房炎の病因には、細菌、ウイルス、真菌などの感染性因子が含まれ、最も重要なのは細菌で、主要病原体（Streptococci、Staphylococcus aureus、Corynebacterium pyogenes、Coliform）と軽微病原体（Corynebacterium bovis、凝固酵素陰性< i>Staphylococci）の2群に分けられます[25]。多剤耐性グラム陽性およびグラム陰性細菌株の出現は、公衆衛生に重大な脅威を与えています[23, 32]。

Zingiber officinale（ショウガ）はアーユルヴェーダとユナニ、中国漢方医学において重要な成分であり、ジンギベロール、モノテルペン、セスキテルペン、セスキテルペン炭化水素などの揮発性油の多様性により、抗吐き気、消化助け、リウマチ、出血障害など様々な疾患の治療に用いられます[12, 13, 43]。一方、Allium sativum（ニンニク）はアリル硫化物群、アリイン、アジョエン、アリルシステイン、アリシンなどの有機硫黄成分、ビタミン、リン脂質、フラボノイド、アミノ酸、脂肪酸などを含み、それらが薬理特性を規定しています[14, 24]。我々は、牛乳房炎分離株であるMDR（S. aureus）に対する植物化学的に還元されたNi金属酸化物NPの殺菌作用を評価することを目的とし、これは獣医学研究分野において上記物質についてパキスタンからの最初の報告となります。

方法

本研究は、牛乳房炎分離株であるMDR（S. aureus）に対する植物化学的に還元されたNiO-NPの殺菌作用を調査することを目的としました。

材料

硝酸ニッケル[Ni(NO₃)₂]、水酸化ナトリウム（NaOH）、メチレンブルー（MB）、ホウ化ナトリウム（NaBH₄）の分析グレードをSigma-Aldrich®から購入し、新鮮なショウガとニンニクの根を地元市場から収集しました。根は日陰で乾燥させ、恒量達成後さらに加工しました。抗生物質ディスクはBioanalyse®（トルコ）から購入しました。細菌培養培地はTM Media（Titan Biotech Ltd、インド）の分析グレードを使用しました。

水抽出液の調製

ショウガとニンニクの根を電動グラインダーで微粉末に粉砕し、プラスチック容器に保存しました。粉末根を蒸留水-DIW（1:10）で制御量混合し、70℃で30分間激しく攪拌しました。抽出液を冷却し、Whatman No.1濾紙で濾過し、4℃で保存しました（図1）まで使用しました。

ショウガとニンニクの抽出および植物化学的還元NiO-NPの合成スキーム

NiO-NPのグリーン合成

様々な比率（1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.2 ml）のショウガとニンニク水抽出液を、連続攪拌下で硝酸ニッケル（0.1 M）に添加しました。撹拌溶液のpHをNaOH（2 M）で12に維持し、90℃で2時間反応させました。生成した沈殿物を10,000 rpmで10分間遠心分離し、DIWで洗浄し、90℃の熱風乾燥機で一晩乾燥させました（図1参照）。

特性評価

合成NPの吸収極大値（λ_max）をUV-Visible分光光度計（Genesys 10 S）で200-800 nm波長範囲で走査しました。相組成と構造情報をX線回折（XRD）BUNKER D2フェイザーで分析し、2θ範囲（10-80°）、Cu Kα1放射（λ=1.540 Å）を装備しました。グリーン合成NiO-NPの官能基をフーリエ変換赤外分光法（ATR-FTIR）で記録しました。NPのサイズ、形状、元素分析を電界放出型電子顕微鏡（FESEM）と透過型電子顕微鏡Hitachi H7100FA（TEM）で分析しました。試料組成と対応するバンドギャップをX線光電子分光法（XPS）で調査しました。

MDR S. aureus の分離と同定

S. aureus の分離

パキスタン、パンジャブ州の民間および公立獣医病院と農場から採取した臨床陽性牛乳サンプルを、5%羊血液寒天培地で培養し、37℃で24-48時間培養しました。得られた特徴的コロニーを、マンニトール食塩寒天（MSA）TM Media（Titan Biotech Ltd、インド）でトリプレットでさらに継代培養し、純粋なS. aureusを分離しました。

MDR S. aureus の同定

細菌コロニーの同定は、形態学的特性、グラム染色、生化学的手順（凝固酵素試験とカタラーゼ試験）により、バージェイの確定細菌学マニュアルの記述に従って実施しました。

特徴的コロニーの抗生物質感受性を、多剤耐性S. aureus分離のために、国立臨床検査基準委員会（NCCLS）のガイドラインに基づくディスク拡散法で評価しました。オキシテトラサイクリン（30 μg）、チロシン（30 μg）、ゲンタマイシン（10 μg）、シプロフロキサシン（5 μg）、トリメトプリム+スルファメトキサゾール（1.25 μg+23.75 μg）を含む抗生物質ディスクを、Mueller-Hinton寒天（MHA）TM Media（Titan Biotech Ltd、インド）1×10⁸ CFU/ml上で無菌的に適用し、37℃で24時間保持しました[7]。最低3つの抗生物質に耐性を示した細菌をMDRと宣言しました[28]。

抗菌活性

乳房炎ミルクから採取したMDR S. aureusの10代表分離株に対して、寒天ウェル拡散法により植物化学的に還元されたNiO-NPの体外抗菌作用ポテンシャルを評価しました。ペトリ皿をMSA上で1.5×10⁸ CFU/ml（0.5 McFarland標準）MDR S. aureusで塗布しました。無菌コルクボーラーで直径6 mmのウェルを形成しました。ショウガ、ニンニクの個別水抽出液とグリーン合成（植物化学的還元）NiO-NPの様々な濃度を適用しました。水抽出液は（10 mg/100 μl）と（50 mg/100 μl）、NiOは（0.5 mg/50 μl）と（1.0 mg/50 μl）の濃度で使用しました。シプロフロキサシン（0.005 mg/50 μl）を陽性対照、DIWを陰性対照（50 μl）として使用しました。

統計解析

抗菌効力を阻害ゾーン（mm）サイズで計算し、阻害ゾーン直径をSPSS 20を用いた一元配置分散分析（ANOVA）で統計的に解析しました。

触媒活性

合成抽出液NiOの触媒評価のため、新調した水性ホウ化ナトリウム（300 μl）をメチレンブルー（0.03×10⁻³ M）溶液3 mlと混合しました。その後、所望濃度のコロイド試料300 μlを溶液に添加しました。メチレンブルー染料（MB）の薄青色が消失し、ロイコメチレンブルーへの染料分解を示しました（図2参照）。吸収をUV-Vis分光光度計で200-800 nm間で測定しました。

グリーン合成NPによるMBからLMBへの触媒的還元の概略図

結果と考察

ショウガとニンニク水抽出液による植物化学的還元NiOの200-600 nm間の光学的特性を図3a、bに示します。NiO-NPの最大吸収（λ_max）は350 nm付近（1:3.6 ml）で観察され、抽出液濃度とともに増加し、ブルーシフトを伴いました。ショウガとニンニク抽出液の吸収ピークはそれぞれ約275 nmと280 nmに現れました。根抽出液導入後、反応混合物の急激な色変化がワインレッドから薄緑色へ見られました。ピークの拡がりは、抽出液濃度に伴うNiOでの価電子帯から伝導帯への電子遷移と粒子凝集を、強い吸収バンドにより示唆しています[20]。したがって、図3a、bの結果では、最適化値（1:3.6 ml）を超えて抽出液量を増減させると、合成NPの吸収が減少することが示されました。バンドギャップはTaucプロット（式1）を用いて計算しました。

$$ \left(\alpha hv\right)=B{\left( hv-{E}_g\right)}^{\raisebox{1ex}{$1$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$2$}\right.} $$ (1)

a〜d ショウガ（a）とニンニク抽出液（b）によるグリーン合成NiO-NPの吸収スペクトル。ショウガ（c）とニンニク（d）による植物化学的還元NiOのバンドギャップ

ここで、αは吸収係数、hはプランク定数、Bは定数、υは光子周波数、E_gはエネルギーバンドギャップです。（αhʋ)^1/2対光子エネルギー（hʋ）のプロットから、植物化学的に還元されたNiOのショウガおよびニンニクによる推定バンドギャップを得ました。x軸への接線の切片を記録し、試料のバンドギャップエネルギーを得ました（図3c、d参照）。ショウガドーピングによるNiOへのバンドギャップエネルギー変動は4.15から3.1 eV、ニンニクでは3.5から3.0 eVと決定されました（図3c、d）。

NiO-NPの結晶性、サイズ、相組成はXRDにより確認されました（図4a、b）。2θ値37.10°、43.32°、62.81°、76.51°のピークは（111）、（200）、（220）、（311）に対応し（JCPDSカードNo: 00-047-1049）（図4a、b）、[30]を参照しています。ピーク強度は六方晶と面心立方晶（fcc）NiOを示し、シュレッサー式D=0.9λ/βcosθにより、ショウガ還元NiO-NPで平均サイズ32.9 nm、ニンニク還元で29.92 nmと計算されました。幅広いピークは試料中の酸素空孔と局所格子秩序乱れの存在を示しています[38]。ショウガの様々な植物化学物質（フラボノイド、アルカロイド、タンニン、サポニン）とニンニク水抽出液（アリシン、アリル硫化物、アリイン、脂肪酸、グリコリピッド、フェノール類、アミノ酸、フラボノイド）がキャッピング剤として作用し、金属酸化物NPの平均結晶子サイズを決定しています[14, 46]。

ショウガ（a）とニンニク（b）による異なる濃度の植物化学的還元NiOのXRDパターンと標準NiO（c）

ショウガとニンニク根から生合成されたNiOの記録されたFTIRスペクトルを図5a、bに示します。3380 cm⁻¹での精緻な広い吸収はOHに対応し、ピークの広がりはカルボニル基と（N-H）アミン伸縮振動周波数を示しています[50]。2313 cm⁻¹での鋭い吸収は、大気中またはNP粒子内のCO₂の伸縮振動を示します。大気CO₂の急速な吸収は材料の表面積が大きいことを示します[18]。1629 cm⁻¹での広い吸収はC=C芳香環伸縮に対応し、1392と1064 cm⁻¹での鋭いピークはC-N脂肪族アミンの伸縮振動に対応します[48]。978 cm⁻¹での強いピークはNiOの金属-酸素伸縮振動を確認しました[44]。

ショウガ抽出液からNiOへのFTIRスペクトル（a）とニンニク（b）

NiOの生物還元後のピークシフト（2535-2313、1828-1629、1585-1392 cm⁻¹）は、ケトン、アルコール、カルボン酸、アミン官能基を持つ植物化学物質、テルペノイド、フラボノイド、ポリオール、タンパク質が生物還元におけるキレートとキャッピングを担っていることを示しています[42]。

植物化学的還元NiO-NPの表面形態とサイズを、電界放出走査型および透過型電子顕微鏡で決定しました（図6a-f）。NiO-NPは立方体とより球形に近い形状（<50 nm）の多形性を示し、わずかな凝集を伴いました[40]。NPの凝集は、粒子間のポリマー付着と磁気相互作用から明らかです[49]。

a〜f ショウガ（a）とニンニク（b）による植物化学的還元NiOのSEM画像。ショウガ（c）とニンニク（d）による植物化学的還元NiOのTEM画像と、ショウガ（e）とニンニク（f）による植物化学的還元NiOのサイズ分布

合成NiO-NPの元素分析と更なる特徴を、エネルギー分散型X線分光法（EDS）で記述しました。これは図7a、bに示すように純粋なNiO相を確認しました。EDSスペクトルは、試験サンプル中の高純度Niに直接関連する1-10 kV間の3つのピークを確認しました。スペクトルを通じて観察されたNi、O、C、Znの原子量パーセンテージはそれぞれ54.69、27.81、18.06、-0.55でした。

a、b グリーン合成NiO-NPのEDSスペクトル

XPSは、図8a-dに示す植物化学的還元NiO-NPのC1s、O1s、Ni2pスペクトルを示し、合成サンプルの化学的性質と結合状態を示唆しています。284.8と286.2 eVでの最も強いピークはC1sスペクトル（図8b）を示し、C-CとC-OH/C-O-Cに対応します[21]。530.8 eVでのO1sピーク（図8c）は、酸素原子の水酸基、ニッケル空孔に隣接する酸素原子、または酸素結合炭素原子C=Oに割り当てられます[1, 15, 37]。532.2 eVでの寄与は、吸着水分子中の酸素原子（NiOH）に帰属します[31, 41]。Ni2pスペクトルはNi2p3/2とNi2p1/2ピークを含み、ガウス-ローレンツ関数を用いて5成分に分離できます（図8d）。872.72と855.82 eVでの最も強いピークは、それぞれ対応するサテライトピーク879.36と861.57 eVを持つNi2p1/2とNi2p3/2に属します[16]。Ni（2p1/2）とNi（2p3/2）およびNiO-NPコアレベル間のスピン-軌道分裂は17.28 eVで、先行報告とよく一致します[33, 34]。

a〜d 植物化学的還元粒子のXPSサーベイ（a）、C1s軌道（b）、NiOのO1sスペクトル（c）、Ni2p（d）

ショウガとニンニク根抽出液およびグリーン/植物化学的還元NiO-NPの抗菌/殺菌作用を、寒天ウェル拡散法による阻害ゾーン測定（mm）で評価しました（図9a-d、表1）。結果はNP濃度と阻害ゾーン（mm）の強い関係を描写しました。サンプル1（1.2 ml:1）、2（1.8 ml:1）、3（2.4 ml:1）、4（3 ml:1）、5（3.6 ml:1）、6（4.2 ml:1）で有意な阻害ゾーン（mm）（P＜0.05）が記録され、ショウガによる植物化学的還元NiO-NPでは低濃度と高濃度でそれぞれ（3-4.9 mm）と（3.05-5.2 mm）（図9c、d）、ニンニクによる植物化学的還元NPでは（3.15-5.3 mm）と（3.75-5.9 mm）がMDR S. aureusに対して得られました（図9e、f）。ショウガ根水抽出液はゼロ効力を示し（図9a）、ニンニク根は低濃度と高濃度でそれぞれ2.65と5 mmの阻害ゾーンを示しました（図9b）。すべての結果は陰性対照DIW（0 mm）と陽性対照シプロフロキサシン（12.55 mm）と比較されました。全体として、ニンニクによる植物化学的還元NiO-NPがMDR S. aureusに対して有意（P＜0.05）な殺菌作用増強を示しました。

a〜f ショウガ水抽出液（a）、ニンニク（b）、およびショウガ抽出液による低用量と高用量での植物化学的合成NiO-NP（c、d）とニンニク（e、f）の体外抗菌活性

酸化ストレス耐性の違いは、合成ナノ材料の表面積、形態、粒子サイズなど様々な要因に依存し、抗菌作用ポテンシャルに推論的役割を果たします[29, 36]。細菌株とナノスケール材料間の静電相互作用による反応性酸素種生成が、細菌細胞死の原因であると見出されています[2,3,4,5, 22]。ナノ材料の細菌株との反応として2つの反応が可能です。1つは陽イオンNi²⁺と細菌細胞の負帯電部分との強い相互作用による崩壊、もう1つは光照射によるNiO表面からの価電子帯から伝導帯への電子励起です。さらなる電子反応でO₂と反応し、O⁻₂ラジカルを生成しH₂O₂生成につながります。h⁺と水の反応で·OH生成が起こります。結果として生じるO⁻₂·と·OH種が、細菌細胞外表面に存在する脂質またはタンパク質分子の分解に重要な役割を果たします[39]。

触媒活性

図10a-eは、室温で根抽出液とグリーン/植物化学的還元NiO-NP存在下でのMB触媒還元を示しています。図10aは従来法で合成されたNiO-NPの触媒ポテンシャルを、（図10b、c）はショウガとニンニク根水抽出液の触媒ポテンシャルを表します。植物化学的還元NiO-NPの触媒能力を図10d、eに示します。明らかに、NiOと植物根抽出液は効率的なナノ触媒ではなく、メチレンブルー還元に15、21、38分を消費しました（図10a-c）。ショウガ還元NPは速やかな分解（λ_max=8分）を示し、MBからロイコメチレンブルーへの効率的な変換を示しました（図10d）。ニンニク媒介NiO-NPは5分で100%染料還元の類似パターンを示しました（図10e）。

a〜e NiO（a）、ショウガ抽出液（b）、ニンニク抽出液（c）、ショウガによる植物化学的還元NiO（d）、ニンニク還元NP（e）の触媒活性

グリーン/植物化学的還元NPは、ドナー種（BH₄）からアクセプター（MB）への電子移動により系を安定化し、活性化エネルギーを低減することで有意な触媒的染料分解を実行します[27]。データは、グリーンNPが従来NPと個別抽出液と比較して効率的なナノ触媒であることを明らかにしました。

結論

ショウガとニンニク根抽出液を用いたNiO-NPは、優れた殺菌剤および触媒剤として機能しました。植物化学基団を持つ根抽出液導入により、FTIRで明らかになったようにNiO-NP合成に成功しました。XRDピークはNiO六方晶と面心立方晶（fcc）格子を確認し、SEMは平均サイズ16-52 nm（ショウガドーピング）と11-59 nm（ニンニクドーピング）の立方体とより球形に近い形態の多形性を確認しました。しかし、元素分析では化学的性質と結合状態がEDSとXPSで分析され、ニッケルと酸素の実際のパーセンテージが示され、UV解析では350 nm範囲の吸収ピーク差とドーパント量増加でのブルーシフトが検証されました。高濃度でのニンニク還元NiOは、MDR S. aureusに対してショウガ還元NPよりも強力であり、MBも効率的に還元しました。したがって、ニンニク根抽出液からのグリーン/植物化学的還元NiOは、抗生物質耐性の代替として先進医療に、環境ハザードのない触媒剤として繊維工業に採用される可能性があります。

データおよび資料の入手可能性

すべてのデータは制限なく完全に入手可能です。

略語

EDS:

エネルギー分散型X線分光法

fcc:

面心立方晶

FTIR:

フーリエ変換赤外分光法

G +ve:

グラム陽性

G -ve:

グラム陰性

JCPDS:

粉末回折標準合同委員会

MB:

メチレンブルー

Ni:

ニッケル

NiO:

酸化ニッケル

nm:

ナノメートル

NP:

ナノ粒子

SEM:

走査型電子顕微鏡

TEM:

透過型電子顕微鏡

UV-Vis:

紫外可視分光法

XPS:

X線光電子分光法

XRD:

X線回折