制御された薬物放出のための温度およびpH変化に応答した二重刺激誘発ナノゲル

はじめに

刺激応答性ナノキャリアは、一般に、治療、イメージング、および診断用のドラッグデリバリーシステムとして開発されてきました[1、2]。最近、pH、温度、生体分子、酸化還元、磁場、紫外線などのさまざまな刺激が、内部または外部の活性化を介して持続的または制御された薬物放出を誘発するために使用されています[3,4,5,6]。これらの刺激の中で、pHと温度はドラッグデリバリーとリリースシステムで最もよく知られているモダリティです。ポリ- N -イソプロピルアクリルアミド（PNIPAM）は、薬物貯蔵庫および放出システムで利用されてきた代表的な温度応答性ポリマーです。この感熱性ポリマーは、その相挙動を変化させる能力があり、下限臨界溶液温度（LCST）で水とアミド官能基間の水素結合のために膨潤状態を示し、逆に、疎水性相互作用を介してポリマーネットワークの収縮を示します。 LCST [7,8,9]。さらに、LCSTは通常、アクリル酸（AAc）またはPNIPAMと結合したアクリルアミドの錯化比によって制御できます[10、11]。具体的には、LCSTがより高い温度にシフトすると、AAcは2つの相転移を起こす可能性があります[12、13]。 PNIPAM-co-AAcナノゲルは、疎水性相互作用のためにLCSTを超えて収縮し始めます[14、15]。ただし、AAcのカルボキシル基の脱プロトン化は、電子間反発と浸透圧の増加により、ナノゲルの直径を増加させます[16、17、18]。

PNIPAMを介したドラッグデリバリーシステムは、生物医学分野のさまざまなアプリケーション向けに開発されています。温度またはpHに敏感なPNIPAMナノゲルは、可逆的な相転移特性により、薬物の吸着と送達のプロセスを最適化するために使用されてきました[19、20、21、22]。特に、異なる組織内ではより微妙な変化がありますが、異なる組織のpH値が経口送達のために考慮されることが報告されています[23、24、25、26]。今日まで、pHや温度などの複数の刺激の下で協調応答を生成できるインテリジェントな生体材料は、単一の刺激に敏感なシステムよりも優れていることを示しています[27、28、29]。環境pHで自発的に発生するように調整できる温度感受性によって誘発される親水性の変化も、コポリマーおよびゲルのLCST挙動とともにpH感受性に重要な役割を果たす可能性があります。

天然化合物であるβ-ラパコン（β-LP）は、癌治療において治療活性を示しました[30]。生物医学では、β-LPの機能化されたキャリアは、その毒性作用を最小限に抑えることを目的として設計されています。金、酸化グラフェン、およびPNIPAMを使用してβ-LPデリバリー用のさまざまなキャリアが開発されています[31、32]。現在まで、β-LPをロードしたPNIPAMは、肝臓、乳がん、前立腺がん、および結腸がんの化学療法レジメンに適用されてきました[33、34、35、36]。いくつかのβ-LP担体が研究されてきたが、比較的複雑な調製手順は制御されていないか、または自発的なβ-LP放出がそれらの効率を部分的に抑制した。したがって、生物医学的応用のためのβ-LPの効率的な担体の開発は依然として重要な課題です。

ここでは、PNIPAMの熱およびpHに敏感な特性を使用して双方向制御放出システムを開発しました。このドラッグデリバリーシステムは、PNIPAM-co-AAcナノゲルを形成するAAc含有量と共重合されたPNIPAMナノゲルで構成されています。自己組織化戦略、薬物負荷、およびPNIPAM-co-AAcナノゲルの放出の概略図について説明しました（スキーム1）。モデル薬物であるβ-LPは、疎水性相互作用を介してPNIPAM-co-AAcナノゲルにロードされました。ロードされたPNIPAM-co-AAcナノゲルによるβ-LPの放出は、温度とpHによって効果的に制御できます。 PNIPAM-co-AAcナノゲルは、体温で塩基性pHの線維芽細胞で効果的な抗増殖特性を示しました。ナノゲルにロードされたβ-LPは、熱およびpH応答構造で有意な治療効果を達成したため、PNIPAM修飾ナノゲルは、刺激応答性のドラッグデリバリーおよび腫瘍の治療に適した候補となる可能性があります。

温度とpHによるPNIPAM-co-AAcヒドロゲルの二重制御薬物放出の概略図

メソッド

資料

NIPAM（97％、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）を室温で真空乾燥しました。 N 、 N '-メチレンビスアクリルアミド（MBA）、AAc、蒸留水、エチルアルコール（EtOH）、過硫酸カリウム（KPS）（98％、Dae Jung、韓国）、β-LP（Natural Products、韓国）、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS ）はすべて分析グレードであり、さらに精製することなく使用されました。

PNIPAM-co-AAcナノゲルの合成

PNIPAM-co-AAcナノゲルは、以前の報告[37]に従って合成されました。 500 mLの3つ口丸底フラスコで、2.26 gのNIPAMモノマー、0.154 gの架橋剤としてのMBA、および0 g、0.036 g、0.077 g、0.145gのAAcを200mLの蒸留水に加えて溶解しました。磁気バーで75°Cで30分間撹拌した後、それぞれPNIPAM、PNIPAM-co-AAc5、PNIPAM-co-AAc10、およびPNIPAM-co-AAc20を合成します。窒素パージにより混合物から酸素を除去した。反応を開始するために、開始剤として37.5 mgのKPSを溶液に添加し、次に攪拌しました。高温による溶液の蒸発を防ぐために、還流冷却器を使用した。 KPSを添加してから10分以内に溶液が濁りました。未反応のモノマーを除去するために、透析チューブ（12〜14 kDa）で7日間透析しました。透析に使用する蒸留水は毎日交換しました。得られた材料を液体窒素で凍結し、3日間凍結乾燥して、乾燥したPNIPAM-co-AAcナノゲルを得た。

β-LPPNIPAM-co-AAcへのロード

合成されたPNIPAM-co-AAcナノゲル1ミリグラムを1mLのエタノールに溶解し、溶解したPNIPAM-co-AAcに0.1mgのβ-LPを添加しました。混合物を室温で暗所で一晩激しく撹拌した。攪拌後、カプセル化されていないβ-LPを透析チューブ（6〜8 kDa）で透析しました。透析したナノゲルを液体窒素で凍結し、3日間凍結乾燥しました。次に、1 mLのPNIPAM-co-AAcカプセル化β-LPを透析チューブ（6〜8 kDa）に注入しました。溶液の損失を防ぐために、チューブの端を密閉しました。 10 mLのエタノールを加えた後、準備した透析チューブをPBS溶液に浸しました。

PNIPAM-co-AAcの特性評価

形態は、透過型電子顕微鏡法（TEM）および電界放出型走査電子顕微鏡法（FE-SEM）によって決定されました。簡単に説明すると、超音波処理を使用してPNIPAM-co-AAcナノゲルを十分に分散させた後、分散液を300メッシュの銅グリッド（Electron Microscopy Science、PA、USA）に滴下し、一晩蒸発させます。次に、加速電圧200 kVでTEM画像を取得しました（JEM2100F、日本電子株式会社、日本）。 SEM顕微鏡写真は、15 kVの電子加速電圧（JSM-7100F、JEOL USA）でスキャンされました。スペクトルは、フーリエ変換赤外分光計（FT-IR、Nicolet 6700、日本）から収集されました。 β-LPの負荷とナノゲルから放出される量は、UV-Vis分光計（UV-1800、島津製作所、日本）によって計算されました。 LCSTを確認するために、動的光散乱（DLS）（ELS-2000ZS、大塚電子、日本）を使用して、ナノゲルのサイズと表面電荷の変化を1°Cの間隔で正確に測定しました。

PNIPAM-co-AAcの薬物放出特性

β-LPの放出挙動を研究するために、10 mLのβ-LPをロードしたナノゲルを透析チューブ（3.5 kDa）に移し、PBS中で室温および37°Cで攪拌しました。定義された放出時間（0〜12時間）で、各混合溶液中の2mLのサンプルをUV-Vis分光計で分析しました。 UV-Vis分光計では、ベースラインを200〜800 nmに設定し、PBSをpH 2、4、7.4、および8に設定し、PBS溶液に含まれる放出されたβ-LP2mLをキュベットに追加しました。

温度およびpH刺激による薬物放出活性

細胞生存率に対する二重の効果は、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイによって評価されました。 NIH3T3線維芽細胞を96ウェルプレートに播種しました（2×10 ⁴ 細胞/ウェル）および37°Cで一晩培養しました。次に、培地を、遊離β-LP、PNIPAM-co-AAc5、および様々な濃度のβ-LPを含むPNIPAM-co-AAc20を含む新鮮な培地と交換した。 3時間インキュベートした後、MTT溶液を各ウェルに加え、4時間インキュベートしました。その後、培地を除去し、可溶化溶液で処理した。マイクロプレートリーダー（EL800、Bio-Tek Instruments、Winooski、VT、USA）を使用して、595nmでの吸光度値を測定しました。生/死蛍光画像は、蛍光顕微鏡（IX37、オリンパス、日本）によってキャプチャされました。 NIH3T3セル（1.5×10 ⁵ 細胞/ウェル）をμ-スライド8ウェル（ibidi、ミュンヘン、ドイツ）に播種し、一晩培養しました。培地を交換した後、20μg/ mLの遊離β-ラパコン、PNIPAM-co-AAc5、および培地に分散したβ-LPを含むPNIPAM-co-AAc20をウェルに添加しました。 3時間または6時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、LIVE /DEAD®生存率/細胞毒性アッセイ（Molecular Probes、ユージーン、OR）によって細胞生存率を評価しました。

結果と考察

PNIPAM-co-AAcナノゲルの調製

AAcの3つの異なる含有量（5、10、および20％）を持つPNIPAM-co-AAcナノゲルは、ラジカル重合法によって製造されました。 TEMおよびSEMを使用して、ナノゲルの粒子サイズ、形態、および単分散性を確認しました。図1aおよびbに示すように、PNIPAM-co-AAc5ナノゲルは、平均粒子径が約250nmの比較的均一なサイズ分布を示しました。さらに、PNIPAMベースのナノゲルのゾル-ゲル転移は、温度が上昇するにつれて観察されました。 PNIPAM-co-AAc5の水溶液は室温でゾル相として存続しましたが、ナノゲルは加熱するとゲル相に移行し、LCSTより上で溶液が濁りました（図1c）。 PNIPAM、PNIPAM-co-AAc5、PNIPAM-co-AAc10、およびPNIPAM-co-AAc20のゼータ電位は、表面量の増加により、-13.56 mV、-16.61 mV、-21.87 mV、および-23.62mVに減少しました。 AAc含有量によって提供されるカルボキシル基（図1d）。また、PNIPAM-co-AAcの流体力学的直径は、水との水素結合の増加と電子間反発によりAAcの含有量が30°Cに増加するにつれて、217〜442nmの範囲を示すことも示しました。ただし、疎水性相互作用のため、ナノゲルの直径は50°Cで減少しました（図1e）。これらの結果は、PNIPAM-co-AAcは、PNIPAMにリンクされたAAcの量と温度に応じてサイズが変化する可能性があることを示唆しています。ナノゲルの組成は、図2に示すように、FT-IR分光法によってさらに特徴づけられました。1100cm ^-1 〜1200 cm ^-1 ピークはC-N曲げを示しました。スペクトルには、-CH ₂ も表示されました 1300 cm ^-1 での伸縮振動ピーク 〜1400 cm ^-1 。 1600 cm ^-1 の追加のピーク 〜1700 cm ^-1 NIPAMに属するC =Oに起因していました。具体的には、カルボン酸（-COOH）の伸縮が1700 cm ^-1 に現れました。 〜1800 cm ^-1 PNIPAMナノゲルを除いて。 3200 cm ^-1 の広いピーク 〜3300 cm ^-1 N-H伸縮の吸収を示した。したがって、PNIPAMとAAcのさまざまな混合比で構成されるPNIPAMナノゲル誘導体は、AAcの含有量が異なるため、特性が異なります。

a TEMおよび b PNIPAM-co-AAc5ナノゲルのSEM画像。 c PNIPAM-co-AAc5ナノゲルの物理的外観。スケールバーは500nmです。 d ゼータ電位と e pH 7.4で0％、5％、10％、および20％のAAc含有量のPNIPAMについて、DLSによって30°Cおよび50°Cで測定された平均直径

0％、5％、10％、および20％のAAc含有量のPNIPAMのFT-IRスペクトル

温度応答特性

温度挙動を調査するために、PNIPAM-co-AAcナノゲルのサイズ分布をDLSで評価しました。流体力学的直径の変化を30〜50°Cの温度範囲で測定して、LCSTを決定しました。 AAc含有量が5％、10％、および20％のPNIPAMには、2つの異なる遷移ステップがありました（図3）。 PNIPAM-co-AAc誘導体は、30°Cで最初の遷移ステップを開始し、40°C付近で2番目の遷移ステップに入りました。さらに、第２の転移温度は、ＰＮＩＰＡＭのＡＡｃ含有量の増加とともに上昇する傾向があった。したがって、PNIPAM-co-AAc20のLCSTは45°Cの比較的高温でしたが、PNIPAMのLCSTは32°Cでした。 LCST値のこの違いは、PNIPAM-co-AAc誘導体の負電荷の増加によって引き起こされる可能性があります。ただし、PNIPAM-co-AAc5とPNIPAM-co-AAc10のLCST温度は、それぞれ37°Cと39°Cでほぼ同じでした。したがって、PNIPAM-co-AAc10は、薬物放出性能を評価するためにさらに使用されませんでした。 PNIPAM-co-AAc誘導体で得られたLCST値は、以前の研究[37]と同様でした。これらの結果は、PNIPAM-co-AAcナノゲルには2つの相転移があり、AAcを含むPNIPAMのLCSTは、界面PNIPAM鎖からの疎水性相互作用と、AAcのカルボキシル基を介した電子間反発により高温にシフトすることを示しています。

a の流体力学的直径の温度依存性 PNIPAM、 b PNIPAM-co-AAc5、 c PNIPAM-co-AAc10、および d PNIPAM-co-AAc20ナノゲル（pH 7.4）

二重制御薬物放出性能

PNIPAM、PNIPAM-co-AAc5、およびPNIPAM-co-AAc20の薬物放出プロファイルを比較するために、PNIPAM-co-AAc誘導体から放出されたβ-LPを室温（24°C）で6時間測定しました。と体温（37°C）。最初に、PNIPAM-co-AAc20およびβ-LPを含むPNIPAM-co-AAc20のUV-Vis吸収スペクトルを測定し、β-LPに対応する257 nmで強い吸収を観察しました（追加ファイル1：図S1）。 PNIPAM-co-AAc20をロードしたβ-LPの薬物負荷容量は、β-LPの標準濃度-吸光度検量線を使用して約60％であることがわかりました（追加ファイル2：図S2）[38、39]。図4に示すように、PNIPAM-co-AAc誘導体から放出された薬物の累積パーセンテージは、PNIPAM-co-AAc20から放出されたβ-LPの量が比較的少なく、その放出効果がPNIPAMおよびPNIPAMと比較して大幅に低下したことを示しました。 -両方の温度でのco-AAc5。ただし、ほとんどのPNIPAM-co-AAc誘導体の飽和薬物放出点は、2時間以内の治療後に観察されました。特に、PNIPAMナノゲルの薬物放出効率は反応温度に大きく影響されました。 PNIPAM-co-AAc誘導体は、室温での薬物放出効率と比較して、体温での薬物放出効率の改善を示しました。この結果は、反応温度が40°Cを超えたときにすべてのPNIPAM誘導体の累積薬物放出が大幅に増加したことによっても裏付けられました（追加ファイル3：図S3）。

a の温度でのPNIPAM、PNIPAM-co-AAc5、およびPNIPAM-co-AAc20ナノゲルからのβ-LPの累積放出 室温（24°C）および b 体温（37°C）およびpH 7.4

図4と表1に示すように、高温のPNIPAM-co-AAcナノゲルは、収縮が著しいため、薬物を容易に放出する可能性があります。さらに、体温で最も高い薬物放出効率がPNIPAMで観察され、2番目に高い効率はPNIPAM-co-AAc5でした。どちらもAAc含有量が比較的低く、LCST温度が低下します。特に、PNIPAM-co-AAc20のβ-LPは体温で比較的低い効率（61％）で放出されましたが、他のナノゲルでは、β-LPの約80％が同じ温度で放出されました。これらの結果は、PNIPAM-co-AAc20が、PNIPAMおよび他のPNIPAM-co-AAc5と比較して、可能な限りカプセル化しながら、体温での薬物の放出が最小限であることを示しました。さらに、これらの結果は、LCST値を決定するためのPNIPAM誘導体のサイズ測定における温度依存性の変化とも一致していました。

次に、PNIPAM-co-AAc20が、PNIPAMが応答する別の要因、pHを介して薬物放出を制御できるかどうかを評価し、体温で薬物を最大限に捕捉しました。 PNIPAM-co-AAc20は、約70％の累積最大放出効率を示し、酸性または中性のpHと比較してpH 8で約10％増加しました。一方、pH 7.4と酸性pHの間に有意差は観察されませんでした（図5および表2）。まとめると、これらの発見は、PNIPAM-co-AAc20の薬物放出プロファイルがAAcの含有量を制御することによって影響を受ける可能性があり、この二重制御薬物放出ナノゲルが、小腸の一部に存在します[40]。

さまざまなpH値でのPNIPAM-co-AAc20ナノゲルからのβ-LPの累積放出

薬物放出特性の評価

制御された薬物送達および放出のために設計されたナノ材料の重要な基準を実行するために、インビトロ抗増殖が評価された。図6に示すように、遊離β-LPは、同等の濃度のβ-LPに対してβ-LPをロードしたPNIPAM-co-AAcナノゲルよりも低い細胞生存率を示しました。さらに、PNIPAM-co-AAc20ナノゲルのβ-LP放出はPNIPAM-co-AAc5ナノゲルのそれと比較して比較的低かったため、PNIPAM-co-AAc20ナノゲルは20μg/ mLの濃度で比較的高い細胞生存率を示しました。 37°C。さらに、この結果は、累積的な薬物放出プロファイルとも一致しました。次に、蛍光染色した生細胞と死細胞を使用して細胞の生存率を評価しました（図7）。生/死細胞染色アッセイは、β-LPとβ-LPを含むPNIPAM-co-AAc5ナノゲルの細胞生存率が類似していることを示しましたが、PNIPAM-co-AAc20は20μg/ mLの用量で細胞生存率の有意な増加を示しました3時間の治療後。ただし、PNIPAM-co-AAc20からの薬物放出の増強は、pH 8.0で3時間のインキュベーション後に観察され始め、治療後6時間の同じpHで有意な相乗的抗腫瘍活性が見られました。これらの発見は、温度とpHの二重応答性PNIPAM-co-AAc20ナノゲルが、末端小腸での薬物の負荷と放出を制御するための潜在的な用途があることを示唆しています。

NIH3T3線維芽細胞にさまざまな濃度のβ-LPを37°Cで3時間ロードしたPNIPAM-co-AAcナノゲルの抗増殖活性

a を使用したNIH3T3細胞の細胞毒性の蛍光画像 未処理、 b β-LPのみ、 c β-LP/ PNIPAM-co-AAc5、および d pH 7.4で3時間のβ-LP/ PNIPAM-co-AAc20処理、および3時間のβ-LP/ PNIPAM-co-AAc20処理（ e ）および6時間（ f ）pH8.0で。生細胞と死細胞は、カルセインAM（緑）とエチジウムホモ二量体（赤）で染色されます。スケールバーは100μmです

結論

温度とpHによって薬物放出を引き起こすことができるβ-LPをロードしたPNIPAM-co-AAcナノゲルを開発しました。これらのナノゲル誘導体は、ラジカル共重合によって設計および調製されました。 LCSTは、AAc含有量のカルボキシル基間の電子間反発のためにPNIPAM-co-AAcナノゲルのAAc含有量が増加するにつれて上昇し、PNIPAMナノゲルの収縮とその結果としての薬物放出をもたらしました。 β-LPをロードした高AAc含有量のPNIPAM-co-AAcナノゲルは、体温で著しく低下したinvitro放出プロファイルを示しました。さらに、薬物放出は、塩基性pHで顕著な相乗効果で達成することができます。最後に、PNIPAM-co-AAc20が最適な特性を持ち、体温での薬物放出効率は低下しますが、線維芽細胞を使用した細胞生存率アッセイによってサポートされるpH8.0での薬物放出が強化されることを示します。したがって、この温度およびpH応答性ナノゲルは、小腸の生理学的pHでの二重制御薬物放出の有望なアプリケーションと、経口薬物投与による腸標的化薬物送達の魅力的なモダリティを促進する可能性があります。

略語

AAc：

アクリル酸

DLS：

動的光散乱

FE-SEM：

電界放出型走査電子顕微鏡

FT-IR：

フーリエ変換赤外分光計

KPS：

過硫酸カリウム

LCST：

臨界溶液温度を下げる

MBA：

N 、 N '-メチレンビスアクリルアミド

PNIPAM：

ポリ- N -イソプロピルアクリルアミド

TEM：

透過型電子顕微鏡

β-LP：

β-ラパコン