温度・pH応答性PNIPAM系ナノゲルによるβ-ラパチノンの二重刺激制御放出

要旨

ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド（PNIPAM）ナノゲルをアクリル酸（AAc）と共重合し、下限臨界溶解温度（LCST）を調整した。得られたPNIPAM-co-AAcナノゲルは2つの明確な体積相転移を示し、LCSTはAAc含量の増加とともに上昇した。β-ラパチノン（β-LP）を担持させた場合、薬物放出は温度とpHの両方によって制御され、AAc比率の影響を強く受けた。特筆すべきは、PNIPAM-co-AAc20処方が酸性〜中性pHかつ体温では薬物放出を10%未満に抑制し、塩基性pHでは70%以上放出することである。これらの知見は、温度・pH二重応答性PNIPAMナノゲルが経口投与による腸管特異的薬物送達キャリアとして有望であることを示している。

はじめに

刺激応答性ナノキャリアは、薬物送達、イメージング、診断に広く用いられている。使用されるトリガー（pH、温度、酸化還元、磁場、光）の中でも、温度とpHは制御放出に最も広く利用されている。PNIPAMは熱応答性ポリマーであり、LCST（約32℃）以上で疎水性相互作用により収縮する。一方、AAcの脱プロトン化カルボキシル基は静電反発を導入し、LCSTを上方シフトさせる。PNIPAMとAAcの共重合は、温度とpHの両方に応答する調整可能なプラットフォームを提供する。β-ラパチノンは天然の抗がん剤だが、急速な代謝とオフターゲット毒性により治療窓が狭い。応答性ナノゲルへの封入によりこれらの欠点を緩和できる。本研究では、AAc含量を変えたPNIPAM-co-AAcナノゲルの合成、二重刺激薬物放出挙動、線維芽細胞における細胞毒性効果を報告する。

方法

材料

NIPAM（97%、Sigma-Aldrich）、N,N'-メチレンビスアクリルアミド（MBA）、AAc、蒸留水、EtOH、過硫酸カリウム（KPS、98%、Dae Jung）、β-LP（天然物）、PBSを分析級として購入し、そのまま使用した。

PNIPAM-co-AAcナノゲルの合成

500 mLフラスコに、NIPAM 2.26 g、MBA 0.154 g、AAc 0-0.145 gを水200 mLに溶解し、75℃で窒素置換後、KPS 37.5 mgを添加、10分間還流し濁った溶液を得た。ポリマーを透析（12-14 kDa、7日間）、液体窒素で凍結、凍結乾燥（3日間）し、乾燥ナノゲル（PNIPAM、PNIPAM-co-AAc5、PNIPAM-co-AAc10、PNIPAM-co-AAc20）を得た。

β-LP担持

乾燥ナノゲル1 mgをEtOH 1 mLに溶解し、β-LP 0.1 mgを添加。暗所で一晩攪拌後、透析（6-8 kDa）、凍結、凍結乾燥。得られたβ-LP担持ナノゲルを4℃で保存。

キャラクタリゼーション

形態はTEM（200 kV）とFE-SEM（15 kV）で観察。FT-IRスペクトルはNicolet 6700分光計で測定。薬物担持量と放出はUV-Vis分光法（200-800 nm）で定量。LCSTは動的光散乱（DLS）で30-50℃を1℃刻みで測定し決定。

薬物放出試験

β-LP担持ナノゲル10 mLを3.5 kDa透析チューブに入れ、pH 2、4、7.4、8.0のPBS中で24℃と37℃でインキュベート。規定時間（0-12時間）に2 mLずつ採取し、UV-Visで分析。累積放出率を総担持β-LPに対する割合で算出した。

細胞生存率アッセイ

NIH3T3線維芽細胞（2×10⁴ cells/well）を、遊離β-LP、PNIPAM-co-AAc5-β-LP、PNIPAM-co-AAc20-β-LPで0-20 µg/mLの濃度で処理。3時間後、MTTアッセイ（595 nm）とLIVE/DEAD®染色で細胞毒性を評価。

結果と考察

調製と形態

TEMとSEM像（Fig. 1）により、PNIPAM-co-AAc5で平均径約250 nmの単分散ナノゲルが得られたことが確認された。ゼータ電位はPNIPAMで-13.6 mVからPNIPAM-co-AAc20で-23.6 mVへ低下し、表面カルボキシル基の増加を反映していた。

Figure 1. PNIPAM-co-AAc5ナノゲルのTEM (a) とSEM (b) 像。(c) 30℃でのゾル-ゲル転移。(d) AAc含量に対するゼータ電位。(e) 30℃と50℃での流動径

温度応答性挙動

DLS測定（Fig. 2）により、2つの明確な膨潤-収縮転移が観察された。第1転移は約30℃で始まり、第2転移は約40℃付近に現れ、PNIPAM-co-AAc20では45℃へシフトした。したがって、LCSTはAAc含量とともに上昇し、先行研究と整合する。

Figure 2. 0-20% AAcを含むPNIPAMのFT-IRスペクトル

二重刺激薬物放出

37℃において、PNIPAM-co-AAc20は6時間でβ-LPを約61%放出したのに対し、PNIPAMとPNIPAM-co-AAc5は約80%放出した。pH 8.0では、PNIPAM-co-AAc20からの放出が中性または酸性pHと比較して約10%増加した（Fig. 3）。これらの結果は、薬物放出が塩基性pHと高温によって相乗的に促進されることを確認する。

Figure 3. PNIPAMおよびPNIPAM-co-AAc誘導体のpH 7.4における流動径の温度依存性

in vitro細胞毒性

遊離β-LPはナノゲル処方よりも細胞生存率を大きく低下させた。PNIPAM-co-AAc20は20 µg/mLでより高い細胞生存率を示し、37℃での低薬物放出と相関した。Live/Dead染色（Fig. 4）では、PNIPAM-co-AAc5-β-LPが3時間で顕著な細胞毒性を示したのに対し、PNIPAM-co-AAc20-β-LPはpH 8.0で6時間までほぼ無毒性であり、そこで相乗的な細胞死が観察された。

Figure 4. 24℃と37℃（pH 7.4）におけるPNIPAM、PNIPAM-co-AAc5、PNIPAM-co-AAc20からの累積β-LP放出

Figure 5. pH 2、4、7.4、8.0におけるPNIPAM-co-AAc20からのβ-LP放出

Figure 6. 37℃で3時間培養後のNIH3T3細胞に対するβ-LPおよびβ-LP担持ナノゲルの抗増殖活性

Figure 7. β-LP、PNIPAM-co-AAc5-β-LP、PNIPAM-co-AAc20-β-LPで処理したNIH3T3細胞のLive/Dead染色（pH 7.4およびpH 8.0）

結論

AAc含量でLCSTを調整可能なPNIPAM-co-AAcナノゲルを作製した。高AAc（20%）処方は生理温度ではβ-LP放出を最小限に抑え、塩基性pHで効率的に放出する。これは小腸環境を模倣しており、これらの二重刺激応答性ナノゲルは、経口投与による腸管標的β-ラパチノン送達の有力なプラットフォームである。

略語

AAc

アクリル酸

DLS

動的光散乱

FE-SEM

電界放出型走査電子顕微鏡

FT-IR

フーリエ変換赤外分光法

KPS

過硫酸カリウム

LCST

下限臨界溶解温度

MBA

N,N'-メチレンビスアクリルアミド

PNIPAM

ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド

TEM

透過型電子顕微鏡

β-LP

β-ラパチノン