二硫化スズナノフレークに基づく唾液電気化学コルチゾールバイオセンサー

要約

ステロイドホルモンであるコルチゾールは、視床下部-下垂体-副腎系から分泌されます。それは心理的ストレスのよく知られたバイオマーカーであり、したがって「ストレスホルモン」として知られています。コルチゾールの過剰発現が延長されて繰り返されると、コルチゾールの調節の機能障害が最終的に発生します。したがって、コルチゾールを検出するための迅速なポイントオブケアアッセイが必要です。唾液コルチゾール電気化学分析は、コルチゾールレベルの迅速な測定を可能にするのに潜在的に有用な非侵襲的方法です。この研究では、二次元の二硫化スズナノフレーク、コルチゾール抗体（C-M _ab ）、およびウシ血清アルブミン（BSA）は、グラッシーカーボン電極（GCE）上でBSA / C-M _abとして調製されました。 / SnS ₂ / GCE、および電気化学的インピーダンス分光法とサイクリックボルタンメトリーを使用して特徴付けられます。コルチゾール濃度の関数としてのバイオセンサーの電気化学的応答は、サイクリックボルタンメトリーおよび示差パルスボルタンメトリーを使用して決定された。このコルチゾールバイオセンサーは、100 pMから100μMの検出範囲、100 pMの検出限界、および0.0103 mA / Mcm ² の感度を示しました。（ R ² =0.9979）。最後に、開発された電気化学システムを使用して得られた本物の唾液サンプル中のコルチゾール濃度は、酵素免疫測定法を使用して得られた結果とよく相関していました。このバイオセンサーは、抗体-抗原相互作用の特異性に基づいて、生理学的範囲にわたる唾液コルチゾールの電気化学的検出に成功裏に準備され、使用されました。

はじめに

ステロイドホルモンであるコルチゾールは、視床下部-下垂体-副腎（HPA）系から分泌されます。これは、精神的ストレスのよく知られたバイオマーカーであるため、「ストレスホルモン」と呼ばれています[1、2]。コルチゾールレベルは、24時間周期で概日リズムに従います。最高レベルは早朝に観察され、レベルは夜になると徐々に減少します[3,4,5,6]。過剰なレベルのコルチゾールは、中心性肥満、紫色の脈理、近位筋力低下の症状を伴うクッシング病を引き起こす可能性があります。ただし、コルチゾールのレベルが低下すると、慢性疲労、倦怠感、食欲不振、起立性低血圧、低血糖を伴うアジソン病につながる可能性があります[7、8、9]。したがって、適切なコルチゾールバランスを維持することは人間の健康にとって不可欠です。

医学的および心理的に関連するイベントの前兆としてのコルチゾールの測定への関心が高まっており、その中で最も最近の苦痛は心的外傷後ストレス障害（PTSD）です。 PTSDにおける異常なHPA軸機能の重要性は議論の余地がありません。したがって、従来の評価方法でも、豊富な証拠と情報を提供することができます[10、11、12、13、14]。最近、多くの研究がコルチゾール検出の重要性を報告し、さまざまな病気との相関関係を特定しています[15、16、17、18]。さまざまな研究により、コルチゾールは自閉症スペクトラム障害[19]、うつ病[20]、自殺念慮[21]、小児期の逆境、および外在化障害[22]に関連していることが確認されています。

コルチゾールレベルの特定は重要な診断ツールですが、クロマトグラフィー[23、24]、ラジオイムノアッセイ[25]、電気化学発光免疫測定法[26、27、28]、酵素結合免疫吸着測定法[28、29]などの日常的な実験室コルチゾール検出技術]、表面プラズモン共鳴[1、30、31]、および水晶振動子微量天秤[32]は、分析に時間がかかり、費用がかかり、ポイントオブケア（POC）設定では実装できません[33]。したがって、現在、コルチゾールレベルを高感度で効率的かつリアルタイムに測定する必要があります。

近年、抗原と抗体間の特異的分子認識に基づいて確立された電気化学イムノアッセイ法が、シンプルなデバイス、迅速な分析、低コスト、ラベルフリーのPOCテストなどの顕著な特徴により、有望な技術として浮上しています。生体液中のコルチゾールの高感度、低検出閾値[34、35]。電位の変化は、電極での電気化学的酸化還元反応の濃度の変化に起因します。分泌されたコルチゾールは最終的に循環器系に入り、間質液[36]、血液[37]、尿[38]、汗[39]、唾液[40]などのさまざまな生体液に含まれます。唾液コルチゾールの電気化学的検出の利点は、非侵襲的な方法であり、サンプルの収集、取り扱い、保管が簡単であり、リアルタイム測定用のPOCセンサーへの応用の可能性を高めています[41]。

理想的なバイオセンサーは、低い検出限界、迅速な選択性、および高感度を備えている必要があります。免疫センサーを製造するために、選択される固定化マトリックスは、高い表面機能性、高い生体分子負荷、および高い電子伝達速度を伴う低い電子伝達抵抗性を備えている必要があります[42]。ただし、金属硫化物ナノ材料は、電気化学的バイオセンシングのためのタンパク質の固定化のためにめったに提案されていません。したがって、ここでは、唾液中に存在するコルチゾールを検出するために、免疫センサー開発用の潜在的な固定化マトリックスとして二硫化スズを選択しました。

ナノ二次元（2D）材料は、この10年間で豊富な研究関心を集めています。 2D材料には、半導体から金属、無機から有機[43,44,45,46]および関連する複合材料[47,48,49,50]までさまざまな種類があります。ナノ2D材料の発見、製造、調査は、さまざまな分野で普及しています。ナノ2Dスズジスルフィド（SnS ₂ ）、バンドギャップが2.18〜2.44 eVのn型半導体[51、52]は、六角形に配置され、近接して配置された硫黄（S）原子の2つの層の間に挟まれたSn原子で構成され、隣接するS層は弱いファンデルワールスによって結合されています。ワールス力[53]。その興味深い電気的特性、高いキャリア移動度、優れた化学的安定性、低コスト、および光学的特性[54]により、SnS ₂ は、リチウムイオン電池[57、58]、ガスセンサー、グルコースモニター[59、60]の電極として、太陽電池やオプトエレクトロニクスデバイス[55、56]のさまざまな用途に有望な材料に進化しました。電極材料の選択は、酵素と電極表面の間の電子移動を促進するための大きな反応領域と好ましい微小環境を提供することにより、性能を向上させるための重要な重要な要素です。

この作業では、バイオセンサーはSnS ₂を使用して製造されましたコルチゾールを検出するための固定化マトリックスとして。電気化学的センシングに関連する差動パルスボルタンメトリー（DPV）研究の結果は、0.0103 mA / Mcm ² の高感度を示しています。最小検出濃度は100pMです。

材料と方法

資料

ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、抗ウサギコルチゾール抗体（抗コルチゾール、C-M _ab ）、ヘキサシアノ鉄酸カリウム（II）、ヘキサシアノ鉄酸カリウム（III）、β-エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、およびコルチコステロンは、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。ウシ血清アルブミン（BSA）はPanReacから入手しました。塩化スズ（IV）五水和物（SnCl ₄ ^。 5H ₂ O）およびチオアセトアミド（C ₂ H ₅ NS）は昭和（日本）とアルファエーザー（イギリス）から供給されました。 NaCl、KCl、Na ₂で調製したリン酸緩衝生理食塩水（PBS） HPO ₄ 、およびKH ₂ PO ₄ Sigma-Aldrichから購入しました。マイクロポリッシュされたアルミナは、ビューラー（英国）から供給されました。他のすべての化学物質は分析グレードであり、さらに精製することなく使用されました。コルチゾール唾液ELISAキット（カタログ番号SA E-6000）はLDN（ドイツ）から購入しました。

二硫化スズの合成

SnCl ₄の粉末・5H ₂ OとC ₂ H ₅ NSを70mLの脱イオン水に混合し、pHを7.4に調整しました。反応物を含む熱水オートクレーブ反応器を室温から200 ^° に加熱した。 1時間でC、200 ^° に維持 Cで11時間。次に、結果のSnS ₂ 粉末を脱イオン水とエタノールで6000rpmで15分間洗浄し、最後に空気中80 ^° で乾燥させました。 C.この水熱合成法は、SnS ₂の合成にうまく適用されました。。

材料の特性評価

X線回折（XRD、PANalytical、オランダ）を利用して、2D六角形SnS ₂の結晶相を調査しました。フレーク。多機能電界放出走査型電子顕微鏡（FE-SEM、ツァイス、ドイツ）を使用して、材料の表面形態を画像化しました。フィールドエミッションガン透過型電子顕微鏡法（FEG-TEM、Tecnai、USA）を使用して、SnS ₂の微細構造を識別しました。、制限視野回折（SAED、Tecnai）を使用して結晶パターンを取得しました。

BSA / C-M _abの作成 / SnS ₂ / GCEバイオセンサー

ガラス状炭素電極（GCE）は、最初にアルミナスラリーで研磨され、次に5 M SnS ₂の混合物の液滴で研磨されました。前処理されたGCEの表面に堆積しました。抗コルチゾール抗体（1 mg / mL）とBSA（1％）の溶液をPBSで調製しました。 SnS ₂ 次に、/ GCEを抗体とBSA溶液で順番に装飾しました。製造されたBSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCEバイオセンサーは4 ^° の冷蔵下で保管されました使用しないときはC。研究コンセプトと検出システムのセットアップを図1に示します。

電気化学分析

製造されたBSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCEは、電気化学的インピーダンス分光法（EIS）とサイクリックボルタンメトリー（CV）を使用して特性評価され、電気活性挙動を比較しました。コルチゾール濃度の関数としての電気化学的応答研究は、CVおよび示差パルスボルタンメトリー（DPV）を使用して実施されました。すべての実験は、作用電極としてGCE、補助電極としてPtワイヤー、および5 mM Fe（CNを含む10 mM PBS（pH 7.4）の参照電極として飽和カロメル電極を備えた3電極システムを使用して実行されました。）₆ ^{3- / 4-} 。電気化学測定は、モデルCHI6114Eシリーズ電気化学ワークステーション（CH Instruments、米国）で実行されました。 CVおよびDPVの測定は、特に指定がない限り、10 mV / sのスキャンレートで-0.4V〜1.0Vで実行されました。

唾液サンプルの収集と電気化学的センシング

唾液サンプル（2 mL）は、開発されたBSA / C-M _abを検証するために、正午頃に2人の健康な自発的被験者から収集されました。 / SnS ₂ / GCE。唾液サンプルはろ過せずに採取し、生物学的特性を維持するために最初は-20°Cで保存しました。感知する前に、唾液サンプルを室温まで解凍し、3500 rpmで15分間遠心分離して、測定用の上清を収集しました。分離した唾液は-20°Cで保存しました。 BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCEは、唾液サンプル中のコルチゾール濃度の電気化学的検知に利用されました。 BSA / C-M _abによる電気化学的分析を使用したコルチゾールの検出 / SnS ₂ / GCEは、上記の市販のELISAコルチゾールキットと比較されました。

干渉調査

BSA / C-M _abに対する、他のステロイドホルモンなどの潜在的な交絡因子の抑制効果 / SnS ₂ / GCEの特異性は、バイオセンサーを次の異なる溶液に入れることによって調査されました：100 nMのβ-エストラジオール、100 nMのテストステロン、100 nMのプロゲステロン、および100nMのコルチコステロン。スキャン速度は10mV / sで、スキャン範囲は-0.4 V〜0.6Vでした。

ELISAによる唾液コルチゾールの検出

ELISAは、製造元のプロトコルに従って唾液サンプルに対して実行されました。コルチゾール測定の検量線を確立するために、各ウェルの吸光度を決定するために、6つの既知の標準コルチゾール濃度（0.0、0.1、0.4、1.7、7.0、および30 ng / mL）を含む96ウェル力価プレートでアッセイを実行しました。 450nmで。未知のサンプルを計算するための方程式を得るために、検量線に近似曲線を当てはめました。

結果と考察

SnS ₂の材料分析

図2aのXRDパターンからわかるように、合成されたままの製品は、六方晶相SnS ₂に対応するXRDピークのみを表示します。（JCPDSカード番号89-2358）。図2b、cは、合成されたままのSnS ₂のFE-SEM画像を示しています。約300nmのサイズの均一なフレーク状の形態を持っています。図2d–fは、SnS ₂のFEG-TEMおよびSAED画像を示しています。、六角形のSnS ₂について、0.167nmと0.316nmの格子縞間隔が識別されます。単結晶構造として。ナノフレークの積み重ねは10層未満で、総厚は10nm未満です。

電極の電気化学的応答

二硫化スズの添加により、酸化電流が大幅に増加する可能性があります。図3a、bに示すように、SnS ₂から減少した酸化電流の大きさ / GCEからC-M _ab / SnS ₂ / GCE、続いてBSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE、電荷移動抵抗値が増加するにつれて。したがって、結果は、センサーの特性が電極上で変更されたことを示しています。最初は、BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCEは、図3cに示すように、スキャン速度を10 mV / sから100mV / sまで変化させて調べました。図3dにプロットされているように、スキャンレートに伴う電流応答の変化は、酸化電流がスキャンレートに比例して増加し、次の関係に従うことを示しています。 I =0.5156υ–0.0319（ R ² =0.9985）酸化中、および I =0.6758υ–0.0288（ R ² =0.9997）削減。ただし、明確に定義されたレドックスピークを使用してスキャン速度を上げると、ピーク電流がほぼ直線的に増加することは、安定した電子移動を伴う表面制御プロセスを示しています。

電流は、100pMから100μMの範囲でコルチゾールの濃度が増加するにつれて減少しました。電流の違いは、感知されるコルチゾール濃度と直接相関していました。 BSA / C-M _abについて、電流値と十分に分離された酸化ピークが得られました。 / SnS ₂ / GCE電極、図3e、fに示すように。濃度の対数による電流の変化はほぼ線形でした。線形回帰係数の減少がCVの方が優れていることは明らかです。したがって、より具体的で正確なDPVを使用してさらに測定を行いました。このようなDPV研究の結果は、図3gに示すように、電流応答の大きさがコルチゾールの添加によって減少することを示しました。図3hに示されている検量線は、電流応答の大きさとコルチゾール濃度の対数をプロットしており、線形従属であり、次の式に従うことがわかりました。 y =− 0.0103 x + 0.0443; R ² =0.9979。このセンサーは、100 pM〜100μMの検出範囲を示し、検出限界は100 pM、感度は0.0103 mA / Mcm ² でした。（ R ² =0.9979）。

ストレージの安定性に関する調査

BSA / C-M _abの貯蔵寿命を研究するために、CV研究も実施されました。 / SnS ₂ / GCEを1日から1週間の間隔で。 2つの保存条件を比較するために、1つの条件は真空下で乾燥させた電極を保管することであり、もう1つは4°Cで電極を保管することでした。 4°Cおよび真空下での電極の酸化還元ピーク安定性をそれぞれ図4a、cに示します。 4℃での保存条件が真空下よりも良好であったことは明らかです。図4b、dは、電極を真空下で7日間保存した場合の電極安定性の値が82％であったのに対し、電極を4°Cで保存した場合の電極の安定性の値は91％であることを示しています。 4°Cで保存された電極の安定性は、真空下での安定性よりも高かったことが観察できます。電極の活性の喪失は、真空下でのコルチゾール抗体活性の分解によって引き起こされた可能性があります。貯蔵安定性は、酵素センサーにとって重要な問題です。電極の将来の設計では、保護コーティングが導入される可能性があります。

干渉調査

BSA / C-M _abのCV研究の結果 / SnS ₂ コルチゾール（10 nM）に対するβ-エストラジオール（100 nM）、テストステロン（100 nM）、プロゲステロン（100 nM）、コルチコステロン（100 nM）などの潜在的な交絡因子を測定するための/ GCEを図に示します。 5a。コルチゾール信号の応答の変化と比較して、干渉の影響はコルチゾールの結果の5％未満であり、このような潜在的な干渉を簡単に無視できることを示唆しています。

ELISAおよび電気化学的方法を使用した唾液コルチゾールの検出

ELISAおよびBSA / C-M _abを使用して実行された唾液コルチゾールサンプルの測定 / SnS ₂ / GCE電極は表1と図5bにまとめられています。 ELISAを使用して測定されたコルチゾールの濃度は1.105×10 ^-8 でした。 Mおよび3.998×10 ⁻⁹ M.電気化学的測定を使用したコルチゾールの計算結果は1.046×10 ^-8 でした。 Mおよび3.911×10 ⁻⁹ M.これら2つの手法で良好な相関関係が達成され、わずか2〜5％の違いで同等の結果が示されました。したがって、結果は、このBSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCEは、唾液などの生物学的に関連する液体の電気化学的コルチゾール検知に使用できます。

<図>

他の研究との比較

この研究の結果は、このBSA / C-M _abの性能をよりよく理解するために、文献で報告されている唾液コルチゾールの電気化学センサーを含む他の研究と比較されました。 / SnS ₂ / GCE。表2と表3は、コルチゾール検出で非金電極を使用して得られた結果の比較を示しています。現在の仕事の3つの主な利点があります。まず、材料は他の研究で提示されたデバイスよりもはるかに低コストです。第二に、準備プロセスは比較的単純で迅速でした。最後に、検出限界は他の文献で報告されているものと同様であり、実際、報告されているものよりも優れていましたが、唾液コルチゾールの目標検出範囲は簡単に取得できます。

<図> <図>

結論

水熱法はSnS ₂の合成にうまく適用されました。 SnS ₂のプロパティ XRD、FE-SEM、FEG-TEM、およびSAEDによって特徴づけられました。コルチゾール濃度の関数としての電極の電気化学的応答は、CVおよびDPVを使用して決定されました。当社のコルチゾールセンサーは、100 pM〜100μMの検出範囲、100 pMの検出限界、0.0103 mA / Mcm ² の感度を示しました。（ R ² =0.9979）。得られた感知パラメータは、正常な生理学的範囲にあった。潜在的な干渉の影響は5％未満であり、このセンサーの優れた特異性を示しています。安定性テストは、4°Cで保存されたセンサーの活動が真空下よりも優れていることを示しました。唾液サンプル中のコルチゾールを測定するためのこの電極の結果は、ELISAと一致していました。したがって、このBSA / C-M _abを使用した電気化学的分析 / SnS ₂ / GCE電極は、従来の時間のかかるイムノアッセイアプローチに取って代わることができます。